BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Begitu banyak mikroorganisme dalam hidup kita yang tanpa kita sadari
selalu ada di lingkungan kita. Salah satu mikroorganisme yang selalu ada
disekitar kita adalah bakteri.Bakteri memiliki bentuk dan jenis yang beragam,
begitu pula dengan habitat atau tempat hidupnya.Ada bakteri yang bisa hidup
di air, tanah, udara, dan ada pula yang hidup dalam makanan kita. Bakteri-
bakteri tersebut bisa saja menguntungkan, tapi banyak pula yang merugikan.
(kuswiyanto,2014)
Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam
yaitu pengecatan sederhana, negatif, diferensial dan struktural. Pemberian
warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan
tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan, yang sudah difiksasi,
dinamakan pewarnaan sederhana prosedur pewarnaan yang menampilkan
perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut
teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian
dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora,flagella dan pengecatan kapsul(Berty.2015).
Bakteri penyebab infeksi saluran napas bawah yaitu Mycobakterium
Tuberculosis dan non tuberkulosis adalah Streptococcus pneumoniae diikuti
oleh Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Psedumonas
sp.,danProteus sp. (Azizah, 2015).

Dari hasil penelitian diatas kami akan melakukan isolasi dan identifikasi
bakteri pada sampel sputum positif TB dan sputum negatif TB, yaitu untuk
mengetahui bakteri jenis flora normal dan bakteri yag bersiafat pathogen apa
saja yang terdapat pada saluran pernafasanyang diidentifikasi melalui sampel
sputum pasien penderitainfeksi saluran pernafasan atau pasian yang dalam
keadaan normal.
B. Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk isolasi dan identifikasi bakteri pada
sampel sputum dan untuk mengetahui bakteri yang terdapat pada saluran
pernapasan
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri merupakan organisme uniseluler, prokariotik (nucleoid), tidak
berklorofil, saprofit atau parasite, peembelahan biner, termasuk Protista.Protista
dibagi 2 macam yaitu Prokaryot terdiri atas bakteri, alga biru hijau dan Eukaryot
yang terdiri atas jamur, ganggang, lumut dan Protozoa. Perbedaan mendasar dari
kedua sel tersebut antara lain organismenya termasuk bakteria dan Sianobakteria,
ukuran sel 1- 10 mikron, organelnya hanya ada beberapa bahkan hampir tidak ada,
DNA Prokaryot bersirkuler dalam sitoplasma, RNA dan proteinnya disintesis
dalam sitoplasma. Sedangkan pada Eukaryot organismenya termasuk fungi,
hewan dan manusia, ukuran sel 5- 100 mikron, organelnya terdapat inti,
mitokondria dan kloroplast, DNA terkemas dalam inti, RNA dalam inti dan
protein dalam sitoplasma (Hartati, 2012).
Bentuk sel bakteri ada 3 macam, yaitu bulat (kokus), batang (basil) dan
Spriral (lengkung atau koma).Bakteri dapat membentuk kumpulan sel atau
susunan sel yaitu pada bentuk kokus, dapat berupa diplokokus (dua- dua),
tetrokokus (empat- empat) sarkina (8 atau kubus), streptokokus (seperti rantai)
dan staphylokokus (bergerombol seperti buah anggur).Pada bentuk batang dapat
berupa streptobasil (berderet) dan diplobasil (dua- dua). Bakteri umumnya
monomorfik, namun karena faktor lingkungan maka dapat berbentuk pleomorfik
contohnya, Rhizobium dan Corynebacterium.,Bakteri gram positif adalah bakteri
yang mempertahankan zat warna metil unggu sewaktu proses pewarnaan gram.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram.(Harti, 2015).
Sputuma adalah lendir dan meteri lainnya yang dibawa dari paru, bronkus
dan trakea yang mungkin dibutukkan dan dimuntahkan atau ditelan. Kata
“sputum” yang diambil langsung dari bahasa latin “meludah” disebut juga dahak.
Sputum biasanya juga disebut ecpectoratorian.Sputum berbada dengan sputum
yang bercampur air liur.Cairan sputum lebih kental dan tidak terdpat gelembung
busa diatasnya.Sputum diambil dari salursan nafas bagian bawah sedangkan
sputum yang bercampur air liur diambil dari tenggorokan.Sputum yang diproduksi
oleh trakeabronkial yang secara normal memproduksi mucus setiap hari sabagai
bagian dari mekanisme pembersihan normal. (Lubis, 2016)
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat
tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus
dengan pewarnaan tahan asam.Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam
(BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat.. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium
tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia
meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah
bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan
asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA).Penularan
Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Azizah, 2015).
Mikroorganisme infeksi saluran pernafasan bawah merupakan jenis-jenis
mikroorganisme yang dapat bersifat patogan bagi penderita bila tidak ditindaki
lanjuti penyebarannya.Bakteri yang dapat tumbuh dan berkembang pada saluran
pernafasan bagian bawa ini disebebkan tingkat imunitas yang kurang terjaga atau
jerjadinya penurunan sistem kekebalan tubuh.Koloni bakteri dapat meningkat
apabila sipenderita merupakan porokok aktif.Sputum adalah lendir dan meteri
lainnya yang dibawa dari paru, bronkus dan trakea yang mungkin dibatukkan dan
dimuntahkan atau ditelan.Sputum merupakan media atau bakan yang digukan
untuk pemeriksaan kolonisasi bakteri atau infeksi yang terjadi pada saluran
pernafasan bagian bawah.Bakteri penyebab infeksi saluran napas bawah yaitu
Mycobakterium Tuberculosis dan non tuberkulosis adalah Streptococcus
pneumoniae diikuti oleh Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus,
Psedumonas sp.,danProteus sp. (Azizah, 2015).
sputum secara fisik yaitu dipilih yang kental, purulen berwarna hijau
kekuningan, kadang ada bercak darah agar dalam pembuatan sediaan menjadi
berkualitas.(Budiharjo, 2016)
 BAB III
METODE PRAKTIKUM
A. Pelaksanaan Praktikum
Waktu : Rabu, 28 November 2018 s/d jumat, 3 desember 2018
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi DIV Analis Kesehatan STIKes Mega
Rezky Makassar
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Mikroskop
b. Pipet Tetes
c. Beaker Gelas
d. Objek Gelas
e. Bunsen
f. Korek Api
g. Ose Bulat & Ose Lurus
h. Cawan Petri
i. Tabung Reaksi
j. Inkubator
k. Autoklaf
l. Rak Tabung
m. Kulkas
2. Bahan
a. Sampel sputum(+ TBC)
b. Sampel sputum ( sehat )
c. NaCl 0,9%
d. Lugol
e. Gentian Violet
f. Alkohol 96%
g. Air Fuchsin
h. Methylen blue
i. Oil Emercy
 j. Tissue
k. Kapas Alkohol 70%
l. Media AC (Agar coklat)
m. Media MCA (Mac Conkey Agar)
n. Media BAP (Blood Agar Plate)
o. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
p. Media MIO (Motility Indol Ornitin)
q. Media MR- VP (Metyl Red - Vogesh Paskuer)
r. Media SCA (Simon Citrat Agar)
s. Media LIA (Lisin Iron Agar)
t. Media Urea
u. Reagen MR
v. Larutan KOH 40%
w. Larutan α - naphtol 5% 0,6 ml
x. Reagen Kovash

C. Prinsip Kerja
1. Prinsip Isolasi Bakteri Dengan Tehnik Penggoresan
Metode gores menggunakan ose bulat dan menggoreskannya ke
permukaan medium dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan,
hanya sel- sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke
medium. Sel- sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang
kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan
murni.
2. Prinsip Inokulasi Bakteri
a. Inokulasi metode gores
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Inokulasi digoreskan dipermukaan media agar nutrient (media padat)
dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Diantara garis-
garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat
tumbuh menjadi koloni
 b. Inokulasi metode tusuk
Metode tusuk yaitu dengan cara menusukan ujung jarum ose yang
didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan kedalam media
3. Prinsip Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial (untuk membedakan)
bakteri- bakteri yang bersifat gram negatif atau gram positif dengan
menggunakan beberapa jenis larutan.
4. Prinsip Media MCA (Mac Conkey Agar)
Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu, dan
merah netral sebagai indikator warna. Media ini akan menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dengan adanya garam empedu yang akan
membentuk Kristal violet. Bakteri gram negatif yang tumbuh dapat dibedakan
dalam kemapuannya memfermentasikan laktosa.
5. Prinsip Media BAP (Blood Agar Plate)
Merupakan media diferensial untuk megklasifikasikan suatu kelompok
bakteri hemolitik dan nonhemolitik yaitu berdasarkan kemampuan mereka
untuk melisiskan sel- sel darah merah.
6. Prinsip Media Agar Coklat (AC)
Agar coklat (AC) sama dengan agar darah, tetapi pada agar darah coklat,
darah yang digunakan dilisiskan terlebih dahulu sebelum dimasukkan
kelarutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit mengeluarkan bahan- bahan
intraseluler haemoglobin, hemin dan koenzim yang dapat digunakan oleh
bakteri yang sukar tumbuh.
7. Prisnip Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Media TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan
sukrosa, media ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
dalam memfermentasikan gula.Media TSIA diinokulasikan dengan
menusukkan ose sedalam ¾ medium lalu menggoreskannya pada slunt media.
8. Prinsip Media MIO (Motility Indol Ornitin)
 Merupakan media untuk mengidentifikasi pergerakan atau motility, indol
atau adanya cincin merah setelah penambahan reagen Kovash, serta Ornitin
untuk mengetahui perubahan warna.
9. Prinsip Media MR (Metil Red)
Menentukan adanya fermentasi asam campuran (Metilin Glikon). Hasil
negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna media menjadi
merah setelah ditambah reagen MR , sedangkan hasil positif ditandai dengan
terjadinya warna merah setelah ditambah reagen MR.
10. Prinsip Media VP (Voges Proskauer)
Mengetahui pembentukan asetil metil karbonil (aseton) dari hasil
fermentasi glukosa.Hasil positif ditandai dengan terjadi perubahan warna
media menjadi merah setelah ditambahkan alpha naftol dan KOH 40% artinya
hasil akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil karbonil (aseton).
11. Prinsip Media SCA (Simon’s Citrat Agar)
Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media
akan berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.
12. Prinsip Media LIA (Lisin Iron Agar)
Melihat kemampuan miroorganisme dalam mendekarboksilasi lisin
menjadi amain kadaverin yang bersifat basa.
13. Prinsip Media Urea
Mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim urease yang dapat
menguraikan urea menjadi amoniak dan CO2. Urea berisi indikator phenol red,
bila urea dihidrolisiskan NH4+ terakumulasi pada media biakan dan
menyebabkan pH menjadi basa yang ditandai dengan perubahan warna.

D. Cara Kerja
1. Persiapan Sampel Sputum (Pada Penderita Tuberkulosis)
a. Dijelaskan pada pasien apa yang dimaksud dengan sputum agar yang
dibatukkan benar- benar merupakan sputum, bukan air liur/ saliva ataupun
campuran antara sputum dan saliva
b. Dijelaskan pada pasien cara mengeluarkan sputum yang baik
 c. Diminta pasien membatukkan dahaknya kedalam tempat yang sudah
disiapkan (pot sampel)
d. Setelah sputum masuk ke dalam pot sampel, ditutup pot sampel dengan
rapat
e. Sputum siap diisolasi
2. Persiapan Sampel Sputum (Pada Penderita Batuk Biasa)
a. Dijelaskan pada pasien apa yang dimaksud dengan sputum agar yang
dibatukkan benar- benar merupakan sputum, bukan air liur/ saliva ataupun
campuran antara sputum dan saliva
b. Dijelaskan pada pasien cara mengeluarkan sputum yang baik
c. Diminta pasien membatukkan dahaknya kedalam tempat yang sudah
disiapkan (pot sampel)
d. Setelah sputum masuk ke dalam pot sampel, ditutup pot sampel dengan
rapat
e. Sputum siap diisolasi
3. Isolasi sampel ke Media AC (Agar Coklat)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil sampel sputum positif dan negatif lalu dimasukkan ke media AC
dengan teknik goresan sinambung
c. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
4. Inokulasi Sampel ke Media MCA (Mac Conkey Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil sampel sputum positif dan negatif lalu dimasukkan ke media
MCA dengan teknik goresan sinambung
c. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
5. Inokulasi sampel ke BAP (Blood Agar Plate)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil sampel sputum positif dan negatif lalu dimasukkan ke media BAP
dengan teknik goresan sinambung
c. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
Interpretasi Hasil
 1. Pertumbuhan bakteri α-hemolitik : Warna abu-abu kehijauan
2. Pertumbuhan bakteri β-hemolitik : Warna bening/transparan
3. Pertumbuhan bakteri γ-hemolitik : Warna merah
6. Pewarnaan Ziehl Neelsen
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dibersihkan objek gelas dengan alkohol 70%
c. Diambil sputum menggunakan ose bulat steril, kemudian diratakan diatas
objek gelas 2X3 cm lalu difiksasi sampai kering
d. Diteteskan larutan Karbol Fuchsin sampai tertutup semua preparat
e. Difiksasi sampai menguap dengan menggunakan bunsen
f. Diamkan selama 10 menit, lalu dibilas dengan air mengalir
g. Diteteskan larutan asam alkohol 3%
h. Diamkan selama 30 detik, lalu bilas dengan air mengalir
i. Diteteskan larutan Methylene Blue 0,5%
j. Diamkan selama 1 menit, lalu dibilas dengan air mengalir kemudian
dikeringkan
k. Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X dengan tambahan 1
tetes oil emersy
Interpretasi Hasil :
Negatif : Tidak ditemukan BTA
Positif : Apabila terdapat 1-9 BTA/ 100 Lapang Pandang
Positif 1 : Apabila terdapat 10-90 BTA/ 100 Lapang Pandang
Positif 2 : Apabila terdapat 1-9 BTA/ 1 Lapang Pandang
Positif 3 : Apabila terdapat > 10 BTA/ 1 Lapang Pandang
7. Pewarnaan Gram
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dibersihkan objek gelas dengan alkohol 70%
c. Pijarkan kawat ose bulat diatas api menyala
d. Diambil biakan bakteri pada cawan petri menggunakan kawat ose bulat
steril dari media BAP(Blood Agar Plate)
e. Dilakukan suspensi bakteri pada objek gelas
 f. Difiksasi objek gelas diatas api menyala
g. Ditetesi objek gelas dengan larutan Gentian violet 1-2 tetes
h. Didiamkan selama 2 sampai 3 menit
i. Dibilas dengan air mengalir
j. Ditetesi dengan larutan lugol 1-2 tetes
k. Diamkan selama 1 menit
l. Dibilas dengan air mengalir
m. Dilunturkan preparat dengan alkohol 96%
n. Didiamkan selama 30 detik sampai 1 menit
o. Dibilas dengan air mengalir
p. Ditetesi dengan larutan Air Fuchsin 1-2 tetes
q. Didiamkan selama 1 menit
r. Dibilas dengan air mengalir
s. Diamati dibawah mikroskop pada perbesaran 100X dengan tambahan 1
tetes oil emercy
8. TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil biakan bakteri yang tumbuh dari media MCA atau Endo Agar
menggunakan ose lurus steril
c. Diinokulasi kedalam media TSIA dengan cara ditusuk sedalam ¾ pada
daerah butt, dan digores pada daerah slunt
d. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
e. Diamati koloni yang terbentuk
Intepretasi Hasil :
1 Acid-acid : slunt (kuning) – butt (kuning)
2 Alkali-alkali : slunt (merah) – butt (merah)
3 Alkali-acid : slunt (merah) – butt (kuning)
4 Positif H2S : jika daerah tusukan berwarna hitam
5 Positif gas : jika media terangkat keatas
9. Mio (Motility Indol Ornitin)
a. Disiapkan alat dan bahan
 b. Diambil biakan bakteri yang tumbuh dari media TSIA dengan ose lurus
steril
c. Diinokulasi kedalam media MIO
d. Dihomogenkan
e. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
f. Diamati kekeruhan dan perubahan warna
g. Dilakukan uji biokimia, dengan ditambahkan reagen Kovash sebanyak 5
tetes lalu dihomogenkan
h. Diamati perubahan warna
Intepretasi Hasil :
1. Motility ditandai dengan terbentuknya kekeruhan yang melebar
pada permukaan media
2. Indol ditandai dengan terbentuknya cincin merah setelah
penambahan larutan kovasah 5 tetes
3. Ornitin ditandai dengan perubahan media dari warna ungu menjadi
warna kuning
10. MR-VP (Metyl Red- Vogesh Paskuer)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil biakan yang tumbuh dari media TSIA bakteri denga ose lurus
steril
c. Diinokulasi kedalam media MR-VP
d. Dihomogenkan
e. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
f. Diamati perubahan warna
g. Dilanjutkan dengan uji Biokimia
h. Pada media MR, ditambahkan reagen MR sebanyak 5-10 tetes lalu
dihomogenkan, kemudian diamati perubahan warna
i. Pada media VP, ditambahkan reagen α - naphtol 5% 0,6 ml 5 tetes lalu
ditambahkan lagi reagen KOH 40% 0,2 ml 5 tetes lalu dihomogenkan
j. Diamati perubahan warna
Intepretasi Hasil :
 MR : Positif jika terjadi perubahan warna dari Kuning – Merah
VP : Positif jika terjadi perubahan warna dari Kuning – Merah
11. SCA (Simon Citrat Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil biakan bakteri yang tumbuh dari media TSIA dengan ose lurus
steril
c. Diinokulasi kedalam media dengan menggores pada daerah slunt
d. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
e. Diamati perubahan warna
Intepretasi Hasil :
Positif jika terjadi perubahan warna dari Hijau – Biru
12. LIA (Lysin Iron Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil biakan bakteri yang tumbuh dari media TSIA dengan ose lurus
steril
c. Diinokulasi kedalam media dengan menggores pada daerah slunt
d. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
e. Diamati perubahan warna
Intepretasi Hasil :
Positif jika terjadi perubahan warna dari Ungu Muda – Ungu Tua

13. UREA
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil biakan bakteri yang tumbuh dari media TSIA dengan ose lurus
steril
c. Diinokulasi kedalam media dengan menggores pada daerah slunt
d. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
e. Diamati perubahan warna
Intepretasi Hasil :
Positif jika terjadi perubahan warna dari Jingga – Merah Ungu
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
1. Tabel pengamatan
1.1. Hasil pengamatan pada pewarnaan ziehl-neelsen

Sampel Jenis BTA

Sputum normal Negatif BTA
Sputum TB Negatif BTA

1.2. Hasil Pengamatan Pada Media AC (Agar Coklat)

Uji katalase
Nama Media Ciri- ciri Pertumbuhan Bakteri Pewarnaan Gram
(-) Basil Tidak
AC + Putih Bulat dan Menyebar dilakukan uji
katalase
(-) Coccus Tidak
AC - Putih Bulat dan Menyebar dilakukan uji
katalase

1.1. Hasil Pengamatan Pada Media MCA (Mac Conkey Agar)

Uji katalase
Nama Media Ciri- ciri Pertumbuhan Bakteri Pewarnaan Gram
Tidak
MCA + Warna koloni merah muda (-) Basil dilakukan uji
katalase
Tidak
MCA - - - dilakukan uji
katalase

1.3. Hasil Pengamatan Pada Media BAP (Blood Agar Plate)

Pewarnaan Uji katalase
Nama Media Ciri- ciri Pertumbuhan Bakteri
Gram
Staphylococcu
BAP + Abu Kehijauan dan Menyebar (+) coccus s
Tidak
BAP - Abu Kehijauan dan Menyebar (-) Basil dilakukan uji
katalase
 1.4. Hasil Pengamatan Pada Media TSIA/KIA
Ciri- ciri Pertumbuhan Pada Media TSIA/KIA
Nama Media
Slunt Butt Gas H2S
BAP + Alkali Acid + +

MCA + Alkali Acid + +

AC - Alkali Acid - -

1.5. Hasil Pengamatan Pada Media AC, MCA & BAP

Sampel MIO MR VP SCA LIA UREA
Keterangan
M I O

BAP + + - + - - - + - Staphylococcus sp

MCA + + + + - - - + - EdwardSiella

AC - + - + + - + - - Neisseria Subflava

B. Pembahasan
 Pada praktikum hari pertama dilakukan proses pengamatan bakteri pada
sampel sputum dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen pada sampel sputum positif dan
sputum negatif, sebelum melakukan pengamatan dilakukan sterilisasi pada
preparat dengan menggunakan alkohol 70%, agar bakteri yang menempel pada
preparat mati dan tidak terjadi kontaminasi dengan bakteri lain, kemudian
difiksasi preparat menggunakan api bunsen agar bakteri yang masih tersisa akan
mati dan untuk mempercepat proses pengeringan preparat, diambil sampel sputum
menggunakan ose bulat, pengambilan sampel sputum diambil yang benar-benar
dahak virulen, kenlat, tidak bercampur dengan air liur dan berwarna kuning
kehijaunan, agar pada saat pemeriksaan tidak menimbulkan hasil positif atau
negatif palsu.
pengambilan sampel dilakukan disekitar pentilasi karena bakteri
M.tuberculosisi bertahan hingga 18 jam di udara tergantung dari ada tidaknya
sinar ultra violet dan kelembapan udara sehingga pada saat pengambilan sampel
bakteri tidak terjadi kontaminasi atau menyebabkan phatogenesis pada praktikan.
Sampel sputum yang telah diambil kemuadian dibuatkan suspensi di atas
preparat. Kemudian tetesi reagen pewarna primer (karbol fuchsin) hingga
menutupi seluruh bagian suspensi sputum, fungsi dari karbol fuchsin adalah untuk
mendeteksi bakteri cepat asam karena lebih mudah larut dalam lipid dinding sel
daripada asam alkohol, jika bakteri cepat asam bakteri akan mempertahankan
warna merah awal pada pewarnaan. lalu dipanaskan diatas api bunsen, hingga zat
pewarna diatas preprat menguap dengan tujuan untuk merenggangkan lapisan lilin
dan lipid pada sitoplasma bakteri dan diamkan selama 10 menit agar zat pewarna
primer bisa masuk dan diserap sempurna ke dalam sitoplasma bakteri tahan asam
(Mycobacterium Tuberculosis), setelah itu dibilas manggunakan air mengalir.
Selanjutnya ditetesi asam alkohol 0,3% diamkan selama 30 detik untuk
melunturkan zat warna primer pada bakteri tidak tahan asam serta pada
komponen-komponen metabolisme lainnya, setelah 30 detik dibilas dengan air
mengalir. Kemudian ditetesi reagen pewarna metilen blue hingga menutupi
seluruh bagian suspensi sputum, diamkan selama 1 menit agar bakteri tidak tahan
asam dan komponen-komponen metabolisme lain dapat mengikat zat pewarna
methylen blue, sehingga akan tempak perbedaan bakteri tahan asam
(Mycobacterium Tuberculosis) dengan bakteri lain. Bakteri tahan asam akan
tampak berwarna merah karena mengikat zat pewarna karbol fuchsin dan bakteri
tidak tahan asam akan tampak berwarna biru karena mengikat zat pewarna
methylen blue, preparat yang sudah ditetesi zat pewarna methylen blue kemaudian
dibilas menggunakan air mengaril. Setelah itu dikeringkan lalu diamati dibawa
mikroskop dengan perbesaran 100x dan ditambahkan beberapa tetes oil imersi
agar bakteri yang akan diamati terlihat lebih jelas sampai pada 100 Lp.
Hasil yang didapatkan pada sampel sputum pada penderita tuberkulosis yaitu
positif 3 dimana terdapat > 10 BTA/ 1 lapang pandang, Sedangkan hasil yang
didapatkan pada sampel sputum penderita batuk biasa adalah negatif dimana tidak
ditemukan bakteri basil tahan asam.
Setelah melakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen sampel sputum di isolasi
pada media AC (Agar Coklat), MCA (Mac Conkey Agar) dan BAP (Blood Agar
Plate). Isolasi dilakukan dengan mengambil sampel sputum pada pot sampel
sebanyak 1-2 ose dengan menggunkan ose bulat, pengambilan dilakukan disekitar
nyala api bunsen. Kemudian dilakukan metode penggoresan pada media AC
(Agar Coklat), MCA (Mac Conkey Agar) dan BAP (Blood Agar Plate). Setelah
itu inkubasi media tersebut pada inkubator selama 1×24 jam dalam suhu 37ᵒC.
Hari ke dua dilakukan proses pengamatan yang terjadi pada media AC,
MCA dan BAP yang telah di inkubasi. Hasil yang didapatkan yaitu pertumbuhan
bakteri pada media AC yang berasal dari sampel positif setelah diinkubasi terjadi
pertumbuhan bakteri ditandai dengan adanya koloni berwarna putih dan
menyebar, sedangkan media AC negatif setelah diinkubasi terjadi pertumbuhan
bakteri ditandai dengan adanya koloni berwarna putih dan menyebar. Bakteri
dapat tumbuh dimedia ini dikarenakan media ini memiliki sejumlah nutrisi yang
memungkinkan bakteri untuk tumbuh dimedia ini.
Pada media BAP didapatkan hasil yaitu media BAP yang berasal dari
sampel positif terjadi pertumbuhan bakteri ditandai dengan koloni berwarna abu
kehijauan dan menyebar.Sedangkan pada media BAP yang berasal dari sampel
negatif juga terjadi pertumbuhan bakteri ditandai dengan koloni berwarna abu
kehijauan dan menyebar.Bakteri mampu tumbuh pada media BAP karena media
BAP merupakan media diferensial untuk megklasifikasikan suatu kelompok
bakteri hemolitik dan nonhemolitik yaitu berdasarkan kemampuan mereka untuk
melisiskan sel- sel darah merah.
Pada media MCA didapatkan hasil yaitu pada media MCA yang berasal
dari sampel positif terjadi pertumbuhan bakteri ditandai dengan koloni berwarna
putih dan menyebar.Sedangkan pada media MCA yang berasal dari sampel
negatif tidak terjadi pertumbuhan bakteri.Bakteri dapat tumbuh dimedia ini
dikarenakan dikarenakan persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa dan
garam empedu yang membuat bakteri mendapatkan nutrisi untuk pertumbuhan,
dan bakteri yang dapat tumbuh di media ini adalah bakteri gram negatif.
Setelah melakukan pengamatan kemudian dilakukan inokulasi pada media
TSIA serta pewarnaan Gram pada media AC, BAP dan MCA. Inokulasi media
AC, BAP dan MCA pada TSIA dilakukan dengan, sterilkan ose lurus dari ujung
ke pangkal terlabih dahulu, kemudian ambil biakan pada media
MCAmenggunakan ose lurus yang telah disterilkan sekitar 1-2 ose pada media
MCA. Disterilkan mulut tabung, sebelum melakukan tusukan dan penggoresan
pada media TSIA, setelah itu lakukan inikolasi pada media TSIA yaitu dengan
cara tusuk dan angkat sedikit kemudian gores secara zigzag, dapat juga dilakukan
dengan cara gores kemudian ditusuk. Disterilkan kembali ose dari pangkal ke
ujung pada api bunsen, setalah dibuat goresan, inkubasi media TSIA pada
Inkubator pada suhu 37°C selama 1х24 jam, amati pertumbuhan dan perubahan
yang terjadi pada media TSIA setelah 1х24 jam.
Pewarnaan Gram pada media AC, BAP dan MCA dengan cara tetesi
preparat dengan NaCl dan diambil biakan bakteri dan di buat suspensi lalu
ditambahkan dengan gantian violet 2-3 menit,fungsinya merupakan zat warna
utama dan akan tampak berwarna ungu yang akan mewarnai bakteri gram positif
dan ditambahkan dengan lugol 2-3 menit,fungsi untuk memperkuat ikatan zat
warna utama pada bakteri gram positif kemudian pemberian dengan alkohol
96%selama 30 detik, alkohol 96% berfungsi untuk mencuci lemak pada dinding
selkemudian ditambahkan dengan zat warna air fuchsin yang berfungsi sebagai
zat warna tanding yang akan memberikan warna merah pada bakteri gram negatif,
lalu dibilas dan dikeringkan lalu diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran
100x dengan penambahan oil imersi yang bertujuan untuk melindungi mikroskop.
Dari hasil pewarnaan didapatkan hasil media BAP ialah bakteri gram
negatif basil yang ditandai dengan warna merah.Berdasarkan pada sifat bakteri
gram negatif peptidoglikan bakteri yang tipis dan lapisan lemak yang tebal pada
dinding bakteri maka saat berikatan dengan gentilen violet, ikatan yang terjadi
adalah ikatan lemah, kemudian diberikan lugol untuk memperkuat ikatan dengan
gentilen violet, namun tidak terlalu memberikan arti yang signifikan, sehingga
bakteri gram negatif (-) yang memiliki lemak yang tebal ketika diberi alkohol
maka lemak luntur dan warna gentilen violet pun luntur. Karena tidak terwarnai
maka bakteri akan menyerap warna fuchsin yaitu merah.
Pada media MCA ialah bakteri gram negatif basil yang ditandai dengan
warna merah.Berdasarkan pada sifat bakteri gram negatif peptidoglikan bakteri
yang tipis dan lapisan lemak yang tebal pada dinding bakteri maka saat berikatan
dengan gentilen violet, ikatan yang terjadi adalah ikatan lemah, kemudian
diberikan lugol untuk memperkuat ikatan dengan gentilen violet, namun tidak
terlalu memberikan arti yang signifikan, sehingga bakteri gram negatif (-) yang
memiliki lemak yang tebal ketika diberi alkohol maka lemak luntur dan warna
gentilen violet pun luntur. Karena tidak terwarnai maka bakteri akan menyerap
warna fuchsin yaitu merah. Sedangkan pada media AC yang berasal dari sampel
negatif memiliki bakteri dengan gram negatif coccus.
Pada hari ke tiga setelah 24 jam media diamati perubahan warna pada
media TSIA dibagian slunt dan butt media serta apakah mengandung gas ataupun
H2S, bila mikroorganisme hanya dapat memfermentasikan glukosa maka bagian
butt media akan berwarna kuning (Acid) maksudnya bersifat asam dan bagian
slunt nya berwarna merah (Alkali) maksudnya bersifat basa. Bila mikroorganisme
dapat memfermentasikan laktosa dan sukrosa atau keduanya maka bagian butt dan
slunt media akan berwarna kuning (Acid) dan apabila slunt dan butt nya berwarna
merah (Alkali) maka akan memfermentasikan ketiga gula tersebut dan jika
terdapat gas maka terdapat gelembung atau media terangkat dan jika terkandung
H2S maka bekas tusukan berwarna hitam.
dilakukan pengamatan pada media TSIA(Triple Sugar Iron Agar) yang
telah diinkubasi selama 24 jam dengan melihat daerah slunt dan butt
nya.Pengamatan media TSIA dari koloni bakteri yang diinokulasi dari media AC
yang berasal dari sampel negatif yaitu pada daerah slunt berwarna kuning (alkali)
dan goresan pada butt berwarna merah (acid) yang berarti bakteri hanya dapat
memfermentasikan satu jenis gula yang ada pada media TSIA yaitu glukosa. Pada
pengamatan gas dan H2S didapatkan hasil negatif.Pengamatan media TSIA dari
koloni bakteri yang diinokulasi dari MCA yang berasal dari sampel positif
didapatkan hasil yaitu pada daerah slunt berwarna kuning (alkali) dan goresan
pada butt berwarna merah (acid) yang berarti bakteri hanya dapat
memfermentasikan satu jenis gula yang ada pada media TSIA yaitu glukosa. Pada
pengamatan gas didapatkan hasil positif ditandai dengan media yang terangkat
keatas yang berarti bakteri bisa memproduksi gas.Pada pengamatan H 2S juga
didapatkan hasil positif ditandai dengan bekas tusukan pada media berubah warna
menjadi hitam, yang berarti bakteri dapat memfermentasikan asam amino yang
memiliki sulfur. Pengamatan media TSIA dari koloni bakteri yang diinokulasi
dari media BAP yang berasal dari sampel positif yaitu pada daerah slunt berwarna
kuning (alkali) dan goresan pada butt berwarna merah (acid) yang berarti bakteri
hanya dapat memfermentasikan satu jenis gula yang ada pada media TSIA yaitu
glukosa. Pada pengamatan gas didapatkan hasil positif ditandai dengan media
yang terangkat keatas yang berarti bakteri bisa memproduksi gas.Pada
pengamatan H2S juga didapatkan hasil positif ditandai dengan bekas tusukan pada
media berubah warna menjadi hitam, yang berarti bakteri dapat
memfermentasikan asam amino yang memiliki sulfur.
Pada hari keempat dilakukan pengamatan hasil uji biokimia koloni pada
media BAP positif. Hasil uji media MIO BAP positif menunjukkan hasil
motilitinyapositif (+) karena bagian tusukan berwarna keruh dan melebar yang
menunjukkan bakteri pada media tersebut bergerak aktif pada media. Untuk
Indolnyamenunjukkan hasil negatif (-) karena tidak ditunjukkan terbentuknya
lapisan menyerupai cincin merah muda pada permukaan media MIO berarti
bakteri ini tidak membentuk indol tryptopan sebagai sumber karbon yang dapat
diketahui dengan menambahkan larutan kovasah.Untuk Ornitinya menunjukkan
hasil positif (+) karena terjadi dekarboksilasi ornithin oleh bakteri yang
melepaskan CO2 yang menyebabkan kenaikan pH pada media MIO sehingga
berubah warna dari merah ke kuning.
Hasil uji MR BAP positif hasilnya negatif (-) karena tidak terjadi perubahan
warna menjadi merah setelah ditambahkan larutan MR (methyl red). yang berarti
bakteri dapat memfermentasikan asam campuran yang ada pada media MR
Hasil uji VP BAP positifhasilnya negatif (-) karena tidak terbentuk warna
merah setelah ditambahkan larutan α-naphtol dan larutan KOH artinya bakteri
pada kedua media tersebut tidak mampu memfermentasikan 2,3 butanadiol
sehingga tidak ada hasil fermentasi berupa asetil metil karbinol (aceton) yang
menyebabkan perubahan warna.
Hasil uji media SCA BAP positifhasilnya positif (+) yang ditandai dengan
adanya perubahan warna pada media SCA yaitu berwarna biru.Artinya bakteri
dapat menggunakan sitrat sebagai energi utama atau sebagai satu-satunya sumber
energi karbon.
Hasil uji LIA BAP positif adalah negatif (-) karena tidak terjadi perubahan
warna dan media tetap berwarna ungu muda artinya lisin tidak mengalami
dekarboksilasi oleh bakteri dalam media.Bakteri dalam media ini tidak memiliki
kemampuan dalam mendekarboksilase lisin menjadi amain kadaverin yang
bersifat basa.
Hasil uji UREA BAPmenunjukkan hasil negatif (-) karena tidak terjadi
perubahan warna pada media.Hal itu dikarenakan bakteri tidak mempunyai enzim
urease yang dapat menguraikan urea menjadi amoniak dan CO2. Selain itu, UREA
berisi indikator phenol red yang tidak terhidrolisis oleh NH4+ sehingga tidak
terakumulasi pada media biakan yang menyebabkan tidak terjadi perubahan
warna.
 Setelah mendapatkan hasil dari semua uji pada media dan uji
biokimia.Didapatkanlah hasil bahwa bakteri yang terkandung pada sampel sputum
positif adalah Staphylococcus sp dan Edward Siella sedangkan pada sampel
sputum negatif didapatkan bakteri Neisseria Subflava.
Staphylococcus sp merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang
dan memiliki flagel yang membantu pergerakan bakteri pada media Indol, dapat
memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa.Serratia Mercescensdapat
menyebabkan infeksi oputurnistik pada kulit 5%, saluran percernaan 10%,
saluran kemih dan kelamin 4%, saluran pernafasan 6% dan infeksi post- operasi
10%. Beberapa strain dari bakteri ini dapat resistan dari treatment anti- biotik
spesifik. Ditemukannya bakteri ini pada sampel sputum dikarenakan adanya suatu
bentuk infeksi pada saluran pernafasan dan merupakan agen dari peyakit saluran
kemih.
 BAB V
KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilaksanakan dapat disimpulkan

bahwa bakteri bakteri yang didapatkan dari sputum penderita Tuberkulosis
adalahEdward Siella dan Staphylococcus sp sedangkan bakteri yang didapatkan
dari sputum penderita batuk biasa adalah Neisseria Subflava.
 DAFTAR PUSTAKA

Kuswiyanto. 2014. Bakteriologi 1. Yogyakarta: Buku kedokteran

Berty,dkk. 2015. Pewarnaan sederhana dan cara-cara pewarnaan. Samarinda:

fakultas matematika dan ilmu pengetahuan alam.

Hartati Sri Agnes.Dra. 2012. Dasar- Dasar Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta: Nuha
Medika
Harti Sri Agnes.Dra. 2015. Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta : Andi Offset
CV

Azizah, siti. 2015. Pewarnaan tahan asam. Bandung: Universitas padjajaran

Lubis, Azizah. 2016. Teknik pengeluaran sputum dengan metode regular

dibandingkan metode pursed lip breathing terhadap kualitas sputum
pada populasi mahasiswa politeknik PSKPD UIN Syarif hidayatullah.
Jakarta: UIN Syarif hidayatullah