23.

1 Membuat DNA Rekombinan

Molekul DNA yang dibuat dengan DNA yang asalnya berbeda dinamakan molekul DNA rekombinan.
Setiap fragmen DNA yang dimasukkan dalam molekul pembawa yang kompatibel disebut vektor. 6
tahap dasar dalam pembuatan rekombinan:

1. Isolasi dan pemurnian DNA.

Vector dan molekul DNA target dapat disiapkan dengan bermacam-macam metode.
2. Pemotongan urutan DNA
 Merupakan tahap yang sangat penting dalam teknologi DNA rekombinan.
 DNA biasanya dipotong-potong dengan produk nuklease dan pembatasan endonuklease.
3. Penghubungan Fragment DNA
Molekul rekombinan DNA biasanya dibentuk dengan pemotongan DNA kemudian disisipkan
dan digabungkan ke dalam DNA vektor. Fragmen DNA secara khusus bergabung menggunakan
DNA ligase.
4. Pengenalan DNA rekombinan dengan sel yang kompatibel
DNA yang telah bergabungan dengan DNA vektor harus dikenalkan dengan sel yang kompatibel
dengan DNA yang berada dalam sel, dinamakan transformasi genetik. DNA rekombinan dapat
dibungkus dengan partikel virus dan ditransfer ke dalam sel dengan transfiksi.
5. Replikasi dan reaksi DNA rekombinan dalam sel
Cloning vektor membantu DNA bereplikasi.
6. Identifikasi sel yang mengandung DNA rekombinan
Vektor biasanya mengandung marker genetik atau gen, yang membantu seleksi sel yang
mengambil DNA asing. Identifikasi partikel fragmen DNA biasanya melibatkan tahap tambahan,
yaitu screening klon DNA rekombinan yang memiliki ukuran yang besar.
23.2 Cloning Vector

Vektor untuk Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA
tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut, antara lain:

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)

1. Plasmid
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu makhluk hidup

 Bentuknya pita ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Sebuah vektor plasmid pUC19, berisi polylinker yang dapat mengenali beberapa enzim restriksi yang
berbeda, sebuah gen yang mengkode resistensi terhadap ampisilin (AMP r) untuk amplifikasi selektif dan
asal replikasi (ORI = origin of replication) untuk proliferasi di dalam sel inang.

Multiple Cloning Site (MCS)

 Sebuah vektor plasmid dapat dibuat dari plasmid alami, kemudian segmen yang tidak perlu
dihapus dan urutan DNA yang ingin dikode disisipkan. Untuk mengkloning sebuah sampel DNA,
enzim restriksi yang sama harus digunakan untuk memotong kedua vektor dan sampel DNA.
 Oleh karena itu, vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali beberapa
enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning berbagai sampel DNA.

 Dalam dunia farmasi, teknologi DNA rekombinan menggunakan vektor plasmid sangat berguna
dalam pengembangan obat-obatan. Plasmid E.coli (atau bakteri lainnya) yang digunakan sebagai
vektor harus mengandung suatu gen yang menghasilkan sifat resisten terhadap antibiotik
tertentu (drug-resistence gene). Pada gambar sebelumnya, plasmid mengandung AMP r yang
nantinya bakteri tersebut dapat memproduksi enzim β-lactamase. Enzim tersebut membuat
bakteri resisten terhadap ampisilin (antibiotik golongan beta laktam, yang cara kerjanya
menghambat sintesis dinding sel bakteri). Dengan mengetahui mekanisme genetik yang
menyebabkan resistensi suatu bakteri terhadap obat, maka obat baru dapat dikembangkan.

Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli

 Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan
Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk
binatang lain

 Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang
memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

 Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid
rekombinan"

 Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

 Simplified Procedure

Kloning Terorientasi

Bila diinginkan untuk menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu

 Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki
menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda
Vektor berupa Plasmid

 Keunggulan:

 Kecil, mudah pengerjaannya

 Strategi seleksi mudah

 Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp)

 Kelemahan:

 Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

2. Vektor berupa Bakteriofaga (l phage)

l-fag merupakan virus yang dapat menginfeksi bakteri. Keuntungan utama dari vektor ini adalah efisiensi
transformasi yang tinggi, sekitar 1000 kali lebih efisien daripada vektor plasmid.

Skema gambar kloning DNA

menggunakan fag sebagai vektor.
Pertama, DNA akan di kloning
dimasukkan ke dalam DNA,
menggantikan sebuah wilayah yang
tidak penting dari fag. Kemudian, untuk
sistem perakitan in vitro, virion
membawa DNA rekombinan dapat
dibentuk. Panjang genom adalah 49 kb,
dan dapat membawa hingga 25 Kb DNA
asing.
 Perakitan Virion
Vektor berupa Bakteriofaga

 Keunggulan:

 Bermanfaat untuk mengklon potongan

DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)

 Seleksi berdasar ukuran

 Kelemahan:

 Lebih sulit pengerjaannya

3. Vektor Kosmid (Cosmids)

 Kosmid adalah kombinasi dari plasmid vektor

dan situs COS yang memungkinkan target DNA
untuk dimasukkan ke dalam kepala λ-fage.

Kloning dengan menggunakan vektor kosmid. (a) Selain AMP r, ORI, dan polylinker seperti vektor
plasmid, vektor kosmid juga berisi situs COS. (b) Setelah vektor kosmid dibelah dengan enzim restriksi,
mereka dikombinasikan dengan fragmen DNA. Perakitan dan langkah-langkah transformasi selanjutnya
sama seperti kloning dengan bacteriophage (λ-fage).

Vektor Cosmid
Gabungan sifat vektor plasmid dan sifat berguna dari situs l cos (dihilangkan pada vektor l)

 Keunggulan:

 Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)

 Seleksi berdasar ukuran

 Pengerjaan seperti plasmid

 Kelemahan:

 Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

4. Vektor YAC

 Kromosom ragi buatan (Yeast Artificial Chromosome) vektor mampu membawa fragmen DNA
besar (hingga 2 Mb), tetapi efisiensi transformasi sangat rendah.

 Komponen penting vektor YAC:

a) Sentromer (CEN), telomer (TEL) and sekuen untuk replikasi otonom (ARS = autonomous replicating
sequence) untuk proliferasi di dalam sel inang.

b) ampr amplifikasi spesifik dan sebagai marker / penanda bagi DNA TRP1 dan URA3 untuk
mengidentifikasi sel yang mengandung vektor YAC.

c) situs yang dapat dikenal oleh enzim restriksi, contohnya EcoRI dan BamHI.

Kloning menggunakan vektor YAC

 Sebagian DNA
target dicerna
oleh EcoRI.
Sementara,
vektor YAC
dibelah oleh
EcoRI dan
BamHI (enzim
restriksi).
Segmen vektor
YAC dengan
DNA fragmen
disambungkan
kembali untuk
membentuk
kromosom
buatan.
Kemudian
lakukan proses
transformasi
untuk
membuat
sejumlah besar
salinan.

Vecktor YAC
 large
ARS URA3 insertsHI
telomere centromere markers telomere
replication S3
origin
 Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

Vektor BAC

Replikasi
dimediasi
oriS dan
oriE
parA and
parB
mengend
alikan
BACs dan YACs
agar
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes hanya
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
terdapat
 Keunggulan:
satu
vektor
dalam sel
 akan
penanda
ketahana
 Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran sangat besar (100 -
2,000 kbp)

n
 Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genom

 Kelemahan:
terhadap
Khloramf
 Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat besar

enikolR
Shuttle Vector

 Vektor yang dapat digunakan untuk dua macam inang (memiliki origin of replication dari
masing-masing inang)

Memilih Vektor
 Ukuran
DNA yang
disisipkan
Ukuran
vektor
Situs enzim
restriksi
yang
tersedia
Jumlah
salinan (copy
23.3 Identifikasi Sel Inang berisi DNA Rekombinan

number)
Saat vektor kloning dan DNA yang akan disisipkan digabung secara in vitro, molekul DNA rekombinan
dapat dimasukkan ke dalam sel inang yang kebanyakan merupakan sel bakteri seperti E.coli. Secara
Efisiensi
umum, transformasi bukanlah cara yang efisien untuk menempatkan DNA pada sel karena hanya

kloning
sebagian kecil bagian sel yang disisipkan DNA rekombinan. Akibatnya sel yang berhasil mengalami
transformasi harus dapat dibedakan dengan sel yang tidak mengalami transformasi. Untuk

Kemampuan
mengidentifikasi sel inang yang mengandung DNA rekombinan memerlukan seleksi gen dan uji lainnya.

untuk
Dalam penyeleksian, sel ditumbuhkan dalam kondisi dimana sel yang bertransformasi dapat bertahan
hidup; sedangkan sel lain akan mati. Sel yang bertransformasi dapat diidentifikasi keberadaan DNA

menapis
rekombinan yang diinginkan secara individual.

DNA sisipan
A. Strategi Penyeleksian dengan Gen marker
Kebanyakan seleksi memerlukan gen marker yang sesuai (gen marker : gen yang keberadaanya

Penelitian
dapat dengan mudah dideteksi). Sebagai contoh, banyak vector plasmid bakteri membawa gen
marker yang dapat mengkode β-laktamase, yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis antibiotic
yang β-laktam. Hanya sel yang ditransformasi dengan plasmid yang membawa atau mengekspresikan

diinginkan
gen β-laktamase yang dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin, sel seperti ini
resistan terhadap ampisilin. Bakteri yang tidak mengandung plasmid akan mati saat
ditumbuhkan pada media yang mengandung ampisilin ini. Metode seleksi ini sangat efektif
dalam mengeliminasi banyak sel yang tidak tersisipi DNA pada saat tahap transformasi.
Penyeleksian juga dapat dilakukan dengan penyisipan agen peng-inaktivasi. Pada teknik ini,
penyisipan fragmen DNA di dalam daerah pengkodean gen fungsional pada vector akan
 membuat gen tersebut ter-inaktivasi. Jika gen mengkode produk yang mudah terdeteksi,
penyisipan penginaktivasi dapat digunakan dalam penyeleksian dan pengamatan. Sebagai
contoh, plasmid Pbr322 mengandung dua gen yang resisten terhadap antibiotik (yang satu
resisten ampisilin dan yang lain resisten tetrasiklin). Yang biasanya digunakan adalah cloning site
dengan gen yang resisten terhadap tetrasiklin. Penyisipan DNA pada salah satu site ini akan
menginaktivasi gen yang resisten terhadap tetrasiklin dan akan memberikan peningkatan pada
transformant yang mengandung gen yang sensitive terhadap tetrasiklin tapi resisten terhadap
ampisilin. Sel yang tidak ditransformasi dengan penyisipan inaktivator adalah ampRtetR
(resisten terhadap ampislin dan tetrasiklin) sedangkan sel tanpa satu pun plasmid adlan
ampStetS (sensitive terhadap ampisilin dan tetrasiklin).
B. Seleksi pada Eukariot
Beberapa vector plasmid yang ditumbuhkan pada ragi membawa gen ragi LEU2, yang dapat
mengkode enzim β-isopropilat dehidrogenase, enzim esensial dalam jalur biosintesis leucine. Sel
mutan ragi yang kehilangan fungsi gen LEU2 tidak dapat tumbuh akibat ketidakberadaan leusin.
Sel yang ditransformasi dengan plasmid yang mengandung LEU-2 dapat tumbuh pada media
yang miskin leusin. Kebanyakan marker ragi yang lain pada umumnya sering digunakan untuk
seleksi ini.
C. Marker Visual : Penyisipan Peng-inaktivasi gen β-Galactosidase
Visual marker pun dapat digunakan untuk mengamati sel inang yang mengandung molekul DNA
rekombinan. Sebagai contoh, gen lacZ pada E.coli mengkode enzim β-Galactosidase, yang dapat
mengkatalisis reaksi hidrolisis dalam sintesis substrat 5-bromo-4chloro-3-indolyl β-D-
Galactosidase(yang dikenal sebagai X-gal). Potongan X-gal dapat meghasilkan pewarnaan biru,
5-bromo-4-chloroindole. Keberadaan pewarnaan biru mengidentifikasikan sel mengandung β-
Galactosidase aktif. Ketidakberadaan enzim ini menunjukkan X-gal ini tidak dipotong, dan tidak
ada warna biru yang teramati.
Kebanyakan vector cloning plasmid membawa gen lac-Z atau modifikasi yang dapat
menghasilkan aktivitas β-Galactosidase. Dalam gen lacZ terdapat banyak site restriksi dimana
DNA asing dapat disisipkan. Vector tanpa penyisipan menghasilkan β-Galactosidase fungsional
dan memberikan peningkatan koloni berwarna biru dengan keberadaan X-gal. Saat DNA
disisipkan pada salah satu site, gen lacZ terinterupsi dan rekombinan yang dihasilkan tidak dapat
memproduksi β-Galactosidase fungsional. Pleh karena itu, koloni yang mengandung DNA
rekombinan berwarna putih. Teknik pengamatan ini sangat baik karena single white colony
dapat dibedakan dari 104 koloni yang berwarna biru.

23.4 Genomic Libraries

Teknologi DNA rekombinan terbukti sangat berguna untuk mengisolasi fragmen DNA spesifik dalam
jumlah besar dengan genom yang kompleks. Proses pengkloning fragmen ini biasanya dimulai dengan
konstruksi DNA-library. DNA-library hanyalah sekumpulan dari molekul DNA rekombinan yang dihasilkan
dengan me-ligasi semua fragmen DNA particular pada sampel ke dalam vector. Molekul DNA
rekombinan kemudian disisipkan ke dalam sel, dimana setiap rekombinan akan bereplikasi. Tipe DNA-
library yang terbentuk bergantung pada penyisipan, jenis vector yang digunakan dan jenis persoalan
alamiah yang terinvestigasi.

Genom Libraries, yang menggambarkan keseluruhan DNA dari genom organisme, biasanya
menggunakan vector cloning yang merupakan turunan dari bakteriofage. Vektor cosmid, YAC dan BAC
pun biasa digunakan dalam mengkonstruksi genom-libraries, terutama bila genom sangat besar. Vektor
YAC dapat mengakomodasi penyisipan sekitar 500kb, yang berarti untuk kebanyakan spesies eukariotik
dibutuhkan sebanyak 1000 YAC yang berbeda. BAC libraries memegang peran penting dalam Human
Genomic Project. BAC libraries mengandung kurang lebih 2000 BAC yang berbeda mengandung 3 miliar
pasangan basa. Setiap rekombinan mengandung fragmen genom manusia sebesar 150 hingga 200 kb.
Genomic libraries termasuk DNA yang terekspresi maupun yang tidak terekspresi pada manusia. Pada
sel eukariot dengan genom yang besar dan kompleks, non-coding DNA meyusun fragmen yang terdapat
pada library.

23.5 cDNA Libraries are made from mRNA

Proses pembuatan cDNA libraries dimulai dengan pemurnian mRNA. Kebanyakan teknik untuk
memurnikan molekul mRNA dari eukariot mengambil keuntungan dari ekor poli-A yang terdapat pada
mRNA eukariotik yang matang. Hal ini memungkinkan mRNA eukariotik untuk dipisahkan dari mRNA dan
molekul tRNA, yang kekurangan ekor poli-A. mRNA yang mengandung ekor poli-A (kira-kira 3% dari total
RNA) berikatan secara selektif dengan oligodeoksitimidilat (oligo dT) yang berikatan pula secara kovalen
dengan matriks insoluble seperti selulosa.

Pada langkah pertama, populasi mRNA adalah inkubasi dengan oligo dT, yang hybridizes ke poli A urutan
pada ujung 3 'dari setiap molekul mRNA. Fragmen oligo dT bertindak sebagai primer untuk sintesis DNA
yang berdiri komplementer oleh reverse transcriptase. Hibrida mRNA-cDNA yang dihasilkan kemudian
diobati dengan RNase H, enzim yang nicks RNA, RNA meninggalkan kecil fragmen dasar-dipasangkan ke
untai DNA. Fragmen ini digunakan sebagai primer oleh DNA polimerase I, yang merusak RNA fragmen
karena 5 '- 3' aktivitas exonuclease dan menggantikan RNA dengan. Sebuah untai DNA berkelanjutan
karena hasil sepanjang template (reaksi analog dengan bergabung fragmen Okazaki selama replikasi
DNA). Produk dari reaksi ini adalah molekul cDNA double stranded urutan yang sesuai dengan yang ada
pada mRNA asli. molekul cDNA sering dikonversi menjadi lengket molekul cDNA berakhir dengan
menambahkan oligonukleotida sintetik. Pembangunan perpustakaan cDNA selesai oleh ligating molekul
cDNA untuk vektor dan memperkenalkan rekombinan ke dalam sel inang.

Faktanya, cDNA library pada populasi molekul mRNA yang berbeda ditemukan pada tipe sel yang
berbeda. Walaupun molekul DNA genom identik pada setiap sel dalam satu organism, tetapi molekul
mRNAnya berbeda tergantung pada fungsi spesifik dari setiap tipe sel. Ketika sel hati dan sel otak
memiliki banyak molekul mRNA yang identik, setiap tipe sel juga memiliki molekul mNA yang mengkode
setiap komponen penting yang memiliki fungsi spesifik. Pembentukna cDNA library dari jaringan spesifik
dimana target protein meningkatkan kesempatan berjalannya proses cloning gen yang sukses. Sebagai
contohnya, cDNA globin yang melimpah pada library yang tengah dibentuk dengan mRNA yang diisolasi
dari sel darah merah. Sebagai catatan yaitu tidak mungkin untuk mengklon gen untuk protein yang yang
tidak diekspresikan di dalam jaringan.

Vector λ dan plasmid digunakan dalam pembentukan cDNA library. Library-library ini harus
menunjukkan semua gen yang diekspresikan dalam sel khusus atau jaringan pada waktu khusus selama
proses perkembangan. Ketika cDNA library lebih banyak diperoleh dari mRNA yang telah
dewasadibandingkan dari transkrip mRNA primer atau dari gennya sendiri, cDNA yang dibentuk tidak
memiliki intron dan bentunya tidak lebih kompleks bial dibandingkan dengan genom library. cDNA
library yang berkualitas memiliki jumlah klon rekombinan yang banyak dan ukuran cDNA yang lebar.
Kesimpulannya, kualitas dari library yang dibentuk adalah tergantung pada mRNA yang digunakan baik
itu ukurannya dan kemurniannya dan efisiensi dari setiap langkah dalam proses pengerjaannya.

23.6 Screening a Library

Proses cloning yang sulit dimana diperlukan banyak waktu adalah isolasi DNA rekombinan dari banyak
rekombinan yang berbeda yang terdapat dalam library. Kemungkinan suatu library (dengan ukuran
tertentu)memiliki klon-klon khusus diatur dalam persamaan berikut ini:

N ln ⁡(1−P)
P=1−( 1−n ) atau N=
ln ⁡(1−n)

Dimana N adalahjumlah rekombinan di dalam library, P adalah kemungkinan menemukan klon khusus
dan n adalah frekuensi dari kejadian klon yang diinginkan. Seluruh fragmen DNA diasumsikan sudah
disisipkan ke dalam vector dan dipropagasi dengan efisiensi yang sama. Frekuensi kejadian (n)
tergantung pada tipe dari library. Pada DNA library genom, n merupakan rasio ukuran fragmen DNA
yang disipkan dengan ukuran dari gemon itu sendiri.

Pada cDNA library, kemungkinan diperolehnya klon yang kita inginkan tegantung padakelimpahan dari
molekul mRNA original dan bukan ukuran dari genom. Sehingga, n dalam cDNA library merupakan
kelimpahan dari molekul mRNA.

Pada umumnya, metode untuk seleksi atau “probing”, DNA library untuk rekombinan yang kita inginkan
harus memungkinkan beribu-ribu rekombinan untuk dianalisis secara berkala. Probe adalah suatu
molekul yang dapat mengenal secara spesifik bagian DNA yang kita inginkan dalam suatu library yang
besar. Probe memiliki tipe yang berbeda-beda dan metode penyeleksiannya dikembangkan agar dapat
mendeteksi klon asam nukleat (dengan berikatan dengan klon DNA) atau secara tidak langsung (dengan
mendeteksi produk gen yang merupakan hasil dari klon DNA).

Sel yang terdapat dalamklon library dipelihara/ditumbuhkan di dalam plat petri secara individual
dipisahkan dari koloninya. Asam nukleat atau protein dari sel dilepaskan ditransfer ke suatu filter
dimana mereka dihentikan. Filter yang sudah diberi label kemudian dibawa ke probe sehingga dapat
dideteksi (label yang biasa digunakan adalah isotop radioaktif, fluorescent dyes dan enzim yang
aktivitasnya menghasilkan warna ketika diberikan suatu substrat yang cocok). Setelah probe yang
berlebih dihilangkan dengan cara dicuci, lokasi tempat berikatannya probe secara spesifik dapat
dideteksi dengan teknik yang tepat untuk label (misal autoradiograophy untuk probe radioaktif). Lokasi
ikatan probe di dalam filter dicocokkan dengan lokasi koloni klon di dalam plat petri. Karena tidak ada
satu pun teknik yang 100% aman untuk digunakan, screening selalu dilakukan dengan filter ganda untuk
memberikan hasil yang positif benar (diperlihatkan oleh kedua filter) agar dapat dibedakan dengan hasil
yang positif salah (ditunjukkan oleh hanya satu filter).

Klon cDNA digunakan lebih banyak bila dibandingkan deengan mRNA sebagai probe untuk pengkodean
gen protein pada DNA library genom. Pemurnian molekul cDNA khusus menggunakan teknologi DNA
rekombinan lebih mudah bila dibandingkan dengan pemurnian molekul mRNA dari sel secara individu.

23.7 Kromosom berjalan

Sulit mengisolasi genomic library dengan teknik yang telah dijelaskan sebelumnya. Contoh : gen bias
termutasi, produknya tidak teridentifikasi. Gen bertanggung jawab untuk kelainan bawaan pada
manusia. Fragmen DNA rekombinan dari daerah yang paling dekat dengan kromosom digunakan sebagai
titik awal ke gen yang diinginkan. Pada teknik ini, fragmen DNA yang overlap diisolasi berturut-turut
pada library. Disetiap langkah, wilayah DNA yang lebih besar dari DNA dikloning,memungkinkan
ilmuwan untuk ‘berjalan’ disepanjang kromosom. Contoh kromosom berjalan :

Perjalanan dimulai dengan isolasi fragmen DNA yang merupakan salah satu terminal dari rekombinan
awal. Fragmen terminal diberi label dan digunakan untuk menyelidiki genomic library, yang
mengidentifikasi semua rekombinan yang mengandung gen tersebut. DNA yang dimurnikan dari masing-
masing rekombinan individu kemudian dibelah dengan restriksi endonuklease dan dipetakan untuk
mengidentifikasi bagian yang terjauh untuk masuk ke daerah yang berdekatan dengan mulainya klon
rekombinan. Fargmen terminal dari rekombinan yang terisolasi digunakan untuk meneruskan langkah
kedua dalam perjalanan. Proses ini dilanjutkan sampai mencapai temoat yang diinginkan. Gen yang
teregulasi pada Drosophilla melanogaster diisolasi dari kromosom berjalan. Gen ini selanjutnya
digunakan sebagai model untuk mengisolasi gen homolog hewan lain. Drosophilla pekerja juga
menggunakan kromosom berjalan untuk mengisolasi beberapa gen yang sangat besar (>50kb). Gen ini
sering terganggu oleh intron besar ketika genomic library di screening dengan mRNA atau model cDNA,
2 atau lebih rekombinan diidemtifikasi, masing-masing berisi urutan komplementer tetapi tidak
berdekatan pada kromosom ,maupun terlibat dalam seluruh gen. Kromosom berjalan memungkinkan
rekombinan yang tidak berdekatan ini terhubung, sehingga memebentuk struktur gen yang lengkap.
Strategi yang sama digunakan oleh gen manusia yang sangat besar untuk cystic fibrosis dan distrofi otot.

23.8 Ekspresi protein menggunakan teknologi DNA rekombinan.

Cloning atau amplifikasi DNA dapat dimurnikan dan dipisahkan untuk membentuk RNA dan protein, atau
dimasukkan kedalam organism dengan tujuan untuk mengubah fenotip mereka. Salah satu alasan
teknologi rekombinan DNA memiliki pengaruh yang besar dalam biokimia karena sulitnya memurnikan
dan memisahkan protein yang sangat sedikit dan menentukan urutan asam aminonya. Banyak protein
yang pertama kali diketahui sebagai band dalam gel poliakrilamid atau sebagai antigen yang dikenal oleh
antibody. Tidak diketahui struktur dan fungsi dari protein yang baru ditemukan. Teknologi DNA
rekombinan memungkinkan protein dimurnika tanpa perlu karakterisasi lebih lanjut. Pemurnian dimulai
dengan produksi protein berlebih dalam sel yang mengandung vector yang diekspresikan.

a. Vector ekspresi prokaryot.

Bbrp gen eukaryote dalam vector cloning dapat disajikan di prokaryot. Kebanyakan produk gen
eukaryote tidak dapat dideteksi di prokaryot kecuali gen itu diproduksidari vector ekspresi
khusus. Vector ekspresi untuk host bakteri umumnya plasmid yang telah direkayasa agar
mengandung zat-zat yang diperlukan dalam transkripsi dan translasi seperti promoter yang kuat,
situs binding-ribosome, dan terminator transkripsi. Karena jarak antara situs binding-ribosom
dan kodon inisiasi sangat penting, banyak vector mengandung situs cloning hilir inisiasi kodon.
Ketika vector ini digunakan, protein diproduksi dalam jumlah yang banyak tetapi dengan sedikit
residu pada N-terminus. Asam amino tambahan biasanya tidak hadir dalam studi biokimia
berikutnya.
Protein eukaryote dapat dibuat dari bakteri dengan memasukkan fragmen cDNA ke vector
ekspresi. Jumlah yang sangat besar pada protein yang dibutuhkan dapat dimurnikan dari sel
yang ditransformasi. Dalam beberapa kasus,
protein dapat digunakan untuk mengobati
pasien dengan gangguan genetic. Misalnya,
hormone pertumbuhan manusia, insulin dan
beberapa factor pembekuan darah telah
diproduksi dengan menggunakan teknologi
DNA rekombinan dan vector ekspresi .

Gen yang sebelumnya tidak diketahui, dapat

diidentifikasi jika produk gen tersebut dapat
dibuat dalam bakteri. Antibody yang
mengenali protein dapat digunakan untuk
menyaring klom dari ekspresi-vektor cDNA
library. Pendekatan ini sangat berguna untuk
karakterisasi protein ditahap awal karena
tidak perlu diketahui tentang posisi protein dalam band poliakrilamida. Band ini dapat
 dihilangkan dan protein yang disuntikkan ke binatang untuk meningkatkan antibody yang
nantinya digunakan untuk screening. Antibody dapat diberi label dan digunakan sebagai model
untuk mengidentifikasi sel-sel rekombinan yang mengekspresikan antigen protein yang
diinginkan.
b. Ekpresi protein eukaryote
Sel Prokariot mungkin tidak dapat memproduksi fungsi protein dari gen eukariotik bahkan ketika
semua sinyal yang dibutuhkan untuk ekspresi gen hadir karena banyak  protein eukarotik harus
diubah posttranlationally(contoh glycosylation). Sel Escherhia coli kekurangan beberapa enzim
yang dibutuhkan untuk mengkatalisasi perubahan ini. Beberapa ekspresi vector yang berfungsi
di eukariotik telah dikembangkan. Vector ini berisi replikasi eukariotik asal, gen penanda dalam
pemilihan eukarot, turunan, dan region control translasi, dan tambahan fitur dibutuhkan untuk
efisiensi translasi mRNA eukarotik, seperti sinyal polidenilasi dan tempat capping.

Ragi dan sel eukarotik lainnya dalam budaya adalah tuan rumah yang cocok untuk cloning gen
eukariotik. Sel ini memiliki enzim yang dibutuhkan untuk menyambungkan turunan RNA primer
untuk menghasilkan molekul mRNA yang matang. Untuk alasan ini, gen eukarotik dengan
introns dapat diisolasi dari perpustakaan genom dan dengan langsung menyatakan pada sel ini. 

Ini juga memungkinkan untuk membuat molekul DNA rekombinan yang dapat diintegrasikan ke
dalam genom organism multiseluler besar, termasuk mamalia. Rekombinan seperti ini biasanya
mengandung gen dibawah control promoter yang aktif dalam organism host. Jika zigot atau
embrio awal berubah, mungkin tumbuh menjadi organism yang membawa DNA rekombinan
dalam beberapa sel. Breeding ini dapat menghasilkan individu yang memiliki DNA rekombinan
pada seluruh selnya. Individual seperti ini disebut organism transgenic karena mereka memiliki
DNA asing terintegrasi secara stabil. Ilustrasi tikus transgenic yang berasal dari mencit
mengandung gen hormone pertumbuhan tikus menggunakan teknologi ini.
23.9 APLIKASI TEKNOLOGI REKOMBINAN DNA

Rekayasa genetika banyak digunakan dalam bidang agrikultur, dimana perubahan gen ditujukan
untuk memproduksi tanaman dengan perubahan karakteristik tertentu, seperti ketahanan terhadap
hama dan penyakit, serta peningkatan kemampuan fiksasi nitrogen pada tanaman. Dalam bidang
kesehatan, rekayasa genetik digunakan dalam pengembangan hewan transgenik yaitu tikus sebagai
model untuk penelitian penyakit spesifik tertentu pada manusia. Manipulasi genetik seperti ini juga
dapat menentukan perbedaan antara sel normal dan sel berpenyakit sehingga virulensi mikroba dapat
diketahui.

A. Rekayasa Genetik pada Tanaman

Dalam bidang biologi molekular, telah dikembangkan eksploitasi plasmid bakteri yang
disebut Ti, plasmid dari bakteri Agrobacterium tumefaciens yang membawa rangkaian yang
penting dalam replikasi dan seleksi pada E.coli sehingga dapat mentransformasi berbagai
macam tanaman. DNA yang telah ditransformasi dengan plasmid Ti (T-DNA) dapat digabungkan
dengan vektor kompatibel E. coli untuk menghasilkan cloning vektor E. coli tertentu.
Selanjutnya, DNA asing dapat disisipkan ke dalam T-DNA pada wilayah non-esensial, dan plasmid
rekombinan dapat mentransform Agrobacterium tumefaciens. Ketika bakteri menginfeksi
tanaman, T-DNA masuk ke dalam sel tanaman, lalu berintegrasi dengan genome tanaman inang.
Sebagai contoh, gen luciferase dari kunang-kunang ditransformasikan pada tanaman tembakau
menggunakan plasmid Ti. Pancaran cahaya akan muncul dari semua jaringan tanaman bila
tanaman tersebut disiram dengan larutan luciferin ( substrat untuk luciferase dari kunang-
kunang).
 Teknologi kloning T-DNA juga telah banyak digunakan memperkenalkan beberapa gen
untuk ketahanan terhadap herbisida. Resistensi herbisida dibuat dengan mengubah target
enzim herbisida atau dengan memperkenalkan gen tanaman atau bakteri yang memiliki produk
untuk mengkatabolisme herbisida. Sebagai contoh, strain bakteri Klebsiella pneumoniae
mengandung plasmid yang mengkode nitrilase spesifik untuk herbisida bromoxynil (turunan
dari benzonitril) sebagai sumber nitrogen. Mentransfer gen nitrilase pada tanaman tomat
menghasilkan tanaman transgenik yang resisten terhadap herbisida. Selain itu, ketahanan
terhadap serangga juga dikembangkan dengan memproduksi tanaman yang mengandung gen
yang mengkode protein bakteri yang toksik pada serangga tertentu yang mengganggu tanaman
tersebut.
B. Rekayasa Genetik pada Prokariot
Pengembangan penelitian di bidang genomik bakteri semakin banyak dilakukan akibat
berkembangnya resistensi bakteri yang menyebabkan terjadinya penurunan efektivitas
antibiotik. Genome bakteri yang paling pertama dipublikasikan adalah genome bakteri
Haemophilus influenzae pada tahun 1995. Selama 5 tahun, lebih dari 30 rangkaian genome
mikroorganisme telah diteliti. Perbandingan urutan genome dari suatu organisme yang berbeda
berguna dalam memahami bagaimana perbedaan strain dari genus yang sama akan mungkin
memiliki perbedaan pada virulensi atau jaringan yang terinfeksi. Penelitian genome bakteri juga
dapat membantu pada pengembangan obat yang efektif untuk melawan patogen.
23.10 Aplikasi Untuk Penyakit Pada Manusia

 Aplikasi utama untuk teknologi DNA rekombinan adalah untuk memproduksi protein dalam
jumlah besar.
 Gen atau cDNA untuk suatu protein yang diinginkan dapat diisolasi, diklon di dalam vector, dan
diproduksi dalam jumlah besar untuk diteliti atau untuk pengobatan.
 Contoh: insulin, interleukin, interferon, growth hormones, EPO, faktor koagulasi VIII.
 Suatu gen yang telah diklon juga dapat digunakan sebagai probe untuk mengidentifikasi
penyakit genetik pada manusia.
 Dengan teknologi DNA rekombinan, kecacatan pada gen manusia dapat diperbaiki
menggunakan gen yang telah dimodifikasi.
 Terapi gen menggunakan teknologi DNA rekombinan memberikan manfaat besar bagi
pengobatan penyakit genetik namun isu etika yang muncul harus diperhatikan.

23.11 Polymerase Chain Reaction (PCR)

 PCR digunakan untuk memperbanyak DNA yang terdapat dalam jumlah kecil.
 Dengan PCR, tidak perlu lagi menggunakan sampel dalam jumlah besar untuk diklon atau diteliti.
Cukup mengambil sedikit sampel DNA dan diperbanyak menggunakan PCR.

Proses PCR:
  Campuran yang dimasukkan kea lat PCR berisi: target DNA yang akan diperbanyak, dua
primer, Taq polymerase, dan deoksiribonukleotida.
 Terdapat tiga tahap:
o Denaturation: Target DNA berupa DNA rantai ganda. Campuran dipanaskan sampai
sekitar 90oC untuk mengubah rantai ganda DNA menjadi rantai tunggal.
o Annealing: Setelah terbentuk rantai tunggal, campuran didinginkan hingga sekitar
60oC. Pendinginan ini mengakibatkan kedua primer berikatan dengan rantai tunggal
DNA pada kodon yang seusai.
o Elongation: Campuran dipanaskan lagi sampai suhu 72 oC. Enzim Taq polymerase
akan menggabungkan nukleotida-nukleotida pada ujung kedua primer sehingga
terbentuk rantai DNA baru.
 Ketiga tahap ini diulang-ulang sampai terbentuk sejumlah rantai DNA yang diinginkan.

23.12 Site-direction Mutagenesis

• Merupakan teknik yang mempunyai pengaruh yang kuat terhadap pembelajaran produk gen
dan protein yang lain.
• Mutasi yang diinginkan bekerja langsung ke dalam ke dalam gen dengan sintesis dari
oligonukleat.
• Ketika oligonukleat digunakan sebagai bahan primer replikasi DNA in vitro, copyan gen yang
terbentuk merupakan mutasi yang diinginkan.
• Mutan gen dapat disintesis dengan sempurna dengan metode in vitro, tetapi site-directed
mutagenesis ini jarang digunakan untuk produksi mutan protein.
• Site-directed mutagenesis umumnya digunakan untuk memperkenalkan single-nukleotida
mutasi ke dalam gen.