Spektrofotometri Uv-Vis
Spektrofotometri Uv-Vis
Radiasi Elektromagnetik
merupakan salah satunya, dapat dianggap sebagai energi yang merambat dalam
gelombang yang berdekatan. DImensi panjang gelombang adalah panjang (L) yang
Gambar 1.
Suatu panjang gelombang yang merupakan jarak dalam arah perambatan antara 2 titik yang
besesuaian
tertentu dalam satuan waktu. Dimensi frekuensi adalah seper waktu. Frekuensi biasa
disimbolkan dengan huruf latin nu (v). Bilangan panjang gelombang (1/λ) sehingga
hubungan antara energi yang dimiliki radiasi elektromagnetik, frekuensi, dan panjang
C
V= , dengan menggabungkan kedua persamaan diatas.
λ
h.c
E=
λ
Yang mana :
λ = panjang gelombang
Gambar 2.
Kisaran panjang gelombang, frekuensi, dan spektrum elektromagnetiknya
Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar
putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak.
Sinar pada panjang gelombang tunggal (radiasi monokromatik) dapat dipilih dari
sinar putih (sebagai contoh dengan alat prisma). Warna-warna yang dihubungkan
dengan panjang gelombang diringkas pada tabel.1. pada kolom ketiga disebutkan
juga warna komplementer, yang mempunyai makna jika salah satu komponen warna
putih dihilangkan maka sinar yang dihasilkan akan nampak sebagai komplemen
Tabel.1
Panjang gelombang Warna yang diserap Warna yang diamati/
Warna komlementer
400 - 435 nm Ungu Hijau kekuningan
450 – 480 nm Biru Kuning
480 – 490 nm Biru kehijauan Orange
490 – 500 nm Hijau kebiruan Merah
500 – 560 nm Hijau Merah anggur
560 – 580 nm Hijau kekuningan Ungu
580 – 595 nm Kuning Biru
595 – 610 nm Orange Biru keunguan
610 – 750 nm Merah Hijau kebiruan
fenomena. (1) Molekul secara keseluruhan dapat bergerak yang kejadian ini disebut
dengan translasi; energi yang berhubungan dengan translasi tersebut disebut energi
translasional, Etrans, (2) bagian molekul (atom atau sekelompok atom) dapat bergerak
karena berkenaan satu sama lain. Gerakan ini disebut dengan vibrasi dan energinya
dinamakan dengan energi vibrasional, Evib, (3) molekul dapat berotasi pada sumbunya
dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi rotasional, Erot; (4) di samping bentuk
dianggap hanya memiliki nilai tertentu pada suatu molekul tetentu; dan energi-energi
ini dikatakan terkuantitasi Level energi energi tersebut berhubungan erat dengan
struktur molekulnya. Kita dapat mengharapkan bahwa tidak ada 2 molekul yang
Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energi ke tingkat energ yang
lebih rendah maka beberapa energi akan dilepaskan. Energi ini dapat hilang sebagai
radiasi dan dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul dikenai
suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul
tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan
(absorpsi) energi oleh molekul. Supaya terjadi absorpsi, perbedaan energi antara dua
tingkat energi harus setara dengan energi foton yang diserap. Secara matematis,
Yang mana :
Suatu grafik yang menggambarkan proses ini dapat dilihat pada gambar 2.
Energi ini yang melompat dari suatu tingkat ke tingkat lain disebut dengan transisi,
dan komponen energi yang terlibat dalam proses penyerapan dapat dikatakan dengan
Gambar 3.
Penyerapan (absorpsi) frekuensi (v) radiasi yang menyebabkan transisi dari tingkat energi 1
(rendah) ketingkat 2 (rendah).
diserap oleh suatu molekul secara fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik yang
dengan struktur kimia yang berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya
juga berbeda. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi
yang bermanfaat untuk analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada
radiasi, sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk
tampak dikatakan sebagai spektra elektronik keadaan energi yang paling rendah
molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi.
energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi, Apabila pada molekul yang
sederhana tadi hanya terjadi transisi elektronik pada satu macam gugus yang terdapat
pada molekul, maka hanya akan terjadi satu absorpsi yang merupakan garis spektrum
(sebagai ordinat) dan panjang gelombang (sebagai absis) bukan merupakan garis
spektrum akan tetapi merupakan suatu pita spketrum. Terbentuknya pita spektrum
UV-Vis tersebut disebabkan oleh terjadinya eksitasi elektronik lebih dari satu macam
pada gugus molekul yang sangat kompleks. Gambar 5 menggambarkan prinsip dasar
terbentuknya pita spektrum UV-Vis diberikan oleh molekul dengan struktur yang
lebih kompleks karena terjadi beberapa transisi. Sehingga mempunyai lebih dari satu
Gambar 5.
Gambaran terjadinya pita spektrum UV-Vis
Penyerapan radiasi sinar ultraviolet dan sinar tampak oleh spesies atom atau
molekul (M) dapat dipertimbangkan sebagai proses 2 langkah; yang pertama adalah
Hasil reaksi antara M dengan foton (hv) merupakan partikel yang terkesitasi
secara elektronik yang disimbolkan dengan M*. Waktu hidup M* sangat pendek, dan
melibatkan konversi energi eksitasi manjadi panas, sesuai dengan persamaan berikut :
M* M + panas
suatu proses yang disebut dengan reaksi fotokimia, ALternatifnya, relaksasi juga
melibatkan emisi radiasi kembali yang dikenal dengan fluoresensi dan fosforesensi.
Penyerapan (absorpsi) sinar UV dan sinar tampak pada umumnya dihasilkan oleh
mengabsorpsi dapat dihubungkan dengan ikatan yang mungkin ada dalam suatu
molekul.
Ada tiga macam proses penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak yaitu :
(1) penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan, (2) penyerapan
oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks; dan (3) penyerapan oleh
perpindahan muatan.
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat
1. Aspek Kualitatif
Data spectra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk identifikasi
kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika digabung dengan cara lain seperti
spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti, dan spektroskopi massa, maka dapat
yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal,
intensitas, efek PH, dan pelarut, dan kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan
data yang sudah dipublikasikan (Published data). Dari spectra yan diperoleh dapat
dilihat, misalnya :
Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan pH. Jika berubah,
Obat – obat yang netral misalnya kefein, kloramfenikol, atau obat-obat yang
pensiklidin.
2. Aspek Kuantitatif
Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan
sampel) dan itensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang
dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya.
Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui
satu satuan luas penampang perdetik. Serapan dapat terjadi jika foton/radiasi yang
mengenai cupikan memiliki energy yang sama dengan energy yang dibutuhkan untuk
menyebabkan terjadi perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan
dengan adanya penhamburan dan pemantuan cahaya, akan tetapi penurunan karena
Perhatikan suatu larutan encer senyawa yang mampu menyerap sinar pada
panjang gelombang terpilih untuk suatu percobaan dengan menggunakan pelarut yang
tidak menyerap sinar pada panjang gelombang yang terpilih tersebut. Perlu dicatat
bahwa jika sinar monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan
ketebalan db, maka penurunan intensitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan
tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (I), konsentrasi spesies yang
menyerap (c) dan dengan ketebalan lapisan larutan (db), secara matematis,
-dl = KIcdb
Persamaan di atas dapat disusun ulang dan diintegritas dengan batas Io (intensitas
sinar mula-mula) dan I ( intensitas sinar setelah melalui larutan dengan ketebalan b).
A = abc
Keterangan :
A = absorbansi
a = absorpsi
c = konsentrasi
Persamaan diatas dikenal juga sebagai hokum lambert-Beer. Kualitas
spektroskopi yan diukur biasanya adalah Transmitans (T) = I/Io, dan absorbansi (A);
yang mana
A= log 1/T.
konsentrasi, tabel kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
satuan c dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan absorptivitas molar dan
dengan persen berat/volume (g/100 ml) maka absorptivitas dapat ditulis dengan E11 %cm
Hubungan antara lain nilai E11 %cm dengan absorptivitas molar (ε) adalah sebagai
berikut :
BM
Ε = E11 %cm X
10
Penting juga untuk memahami penamaan yang lebih digunakan, karena istilah ini
juga digunakan di beberapa literatur. Istilah-istilah yang lebih dulu digunakan ini juga
Tabel. 1
Penamaan spektroskopik
Istilah Simbol Istilah yang lebih dulu
digunakan
Transmittan T Transmisi
Persen transmitan %T Persen transmisi
Absorban A Ekstinsi, E, Densitas, D,
Absorbansi
Absorptivitas a Koefisien ekstingsi, indeks
E11 %cm
Absorptivitas ε Koefisien ekstingsi molar
Tebal kuvet B I,d
Konsentrasi C
zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum
Penyerapan yang terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas
yang sama
Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang
tiga macam pelaksanaan pekerjaan, yaitu : (1). Analisis zat tunggal satu komponen;
(2) analisis kuantitatif campuran dua atau tiga macam zat atau analisis dua komponen
dan (3) analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih (analisis multi
komponen)
Jika absorbansi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang, suhu,
terhadapn konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan
persamaan A = abc. Grafik ini disebut dengan plot hukum Lambert-Beer dan jika
garis yang dihasilkan merupakan suatu garis lurus maka dapat dikatakan bahwa
persamaa regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi baku dengan
lain paling kecil. Dua buah kromofor yang berbeda akan mempunyai kekuatan
absorbansi cahaya yang berbeda pua pada satu daerah panjang gelombang.
dihitung.
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spekrofotometri
UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis
dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus
diperhatikan.
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah
tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi senyawa lain atau
b. Waktu operasional
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna.
Pada awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat
sampai waktu tertentu hingga diperoleh abdorbansi stabil Semakin lama waktu
pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak
atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun.
Karena alasan inilah, maka untuk pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi
dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.
maksimal, yaitu :
Pada panjang gelombang maksimal, kepekaan juga maksimal karena pada
Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan
konsentrasi (X). Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis
lurus. Kemiringan (a). Kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang. Penyimpanan
dari garis lurus biasanya dapat disebabkan oleh kekuatan ion yan tinggi, perubahan
15% sampai 70% jika di baca sebaai transmitrans. Anjuran ini didasarkan anggapan
dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan
sistem optik.
gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen, kuarsa atau lampu
tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang antara 350-900
nm)
iii. Optik-optik; dapat didesain untuk memecah sumber sinar sehingga sumber sinar
suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk mengoreksi
pembacaan atau spektrum sampel. Yang paling sering digunakan sebagai blanko