VIII-Capítulo 5
El término cultivo de meristema, por lo
Obtención de plantas libres de virus
Conci, Vilma C.
1 Eliminación de virus
Los virus de plantas son responsables de
importantes pérdidas en los rendimientos,
llegando en algunos casos a ser limitantes
para el cultivo.
La mayoría de los virus no se transmiten
por semilla, por lo tanto, las especies que se
multiplican por esta vía tienen la posibilidad
de liberarse de ellos en forma natural.
Por otra parte, cuando las especies que
se propagan exclusivamente en forma
agámica son infectadas sistémicamente por
virus ellos son transmitidos, con alta eficien-
cia, desde la planta madre a la descenden-
cia. Esta situación. que es normal en especies
que se multiplican por bulbos, tubérculos,
esquejes o estacas permite que la infección
continúe de generación en generación y se
disemine a diferentes regiones a través del
comercio de estos propágulos. Ejemplo de
ello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pe-
pita, yuca, papa, batata y numerosas espe-
cies ornamentales. En estos casos, la obten-
ción y multiplicación de plantas libres de vi-
rus por medios artificiales juega un papel im-
portante para mejorar la producción y cali-
dad de estas especies. Existen numerosos
ejemplos respecto a los beneficios obtenidos
como consecuencia del empleo de plantas li-
bres de virus, no sólo por los incrementos en
la producción sino que además ha permitido
la recuperación de áreas de cultivo que ha-
bían sido prácticamente abandonadas.
Una larga lista de especies han sido libe-
radas de virus a través de la regeneración de
plantas in vitro. El sistema más frecuente-
mente utilizado y con mayores éxitos es el
cultivo de meristema, suplementado en mu-
chos casos por tratamientos de termoterapia
o quimioterapia.
1.2 Cultivo de meristemas
Esta técnica consiste en aislar el
meristema y sembrarlo en un medio de culti-
vo adecuado que posibilite el desarrollo de
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
una planta completa.
general, no es correctamente empleado, ya
que en la mayoría de los casos se siembra el
domo meristemático acompañado por uno
o dos primordios foliares. El domo es una
estructura de menos de 0,1 mm de diáme-
tro muy difícil de extraer con éxito en forma
aislada, y de la cual resulta con frecuencia com-
plicado obtener plantas completas. Para ello
es necesario un medio de cultivo con una
concentración de nutrientes muy equilibra-
da y condiciones ambientales muy estrictas.
Por consiguiente los resultados en ese senti-
do han sido muy pobres. Por esta razón, en
la mayoría de los casos, se utiliza el domo
acompañado de uno ó más primordios
foliares. Tal vez lo más aconsejable sería utili-
zar el término cultivo de «yema», o «brote»,
o «tallo». A pesar de ello, en este capítulo
utilizaremos la denominación cultivo de
meristema por ser esta la terminología más
difundida, aunque no sea estrictamente co-
rrecta.
En general se considera que las plantas
provenientes del cultivo de meristema son
idénticas u homólogas a la planta madre de
donde se extrajo el explanto. Por el contra-
rio, las plantas derivadas de otros tejidos
como callos, nucela, primordios florales o
protoplastos, usualmente presentan distin-
tos grados de variabilidad. Esto último no es
deseable para la producción de plantas libres
de virus, donde el objetivo que se persigue
es mejorar la sanidad de la planta pero con-
servar el resto de sus características
agronómicas.
Sin embargo, es importante aclarar que
han sido señaladas ciertas mutaciones en
plantas provenientes de cultivo de
meristema, pero con mucha menos frecuen-
cia y menos importantes que las detectadas
con otros sistemas de obtención de plantas
in vitro.
El cultivo de meristema ha sido utilizado
con éxito para distintos objetivos, entre ellos
los más frecuentes son la rápida clonación de
material deseable (micropropagación), con-
servación de germoplasma a baja tempera-
tura o criopreservación y para la obtención
de plantas libres de patógenos sistémicos,
entre ellos los virus, que son el objetivo de
este capítulo.
303
2 Distribución de los virus en la planta
Los virus en la planta no están uniforme-
mente distribuídos. En las infecciones
sistémicas algunos están limitados al floema
o a pocas células parenquimáticas adyacen-
tes; otros involucran a todas, o casi todas,
las células de la planta. Existen otros virus que
dejan sectores de tejidos sin infectar y sólo
unos pocos invaden los nuevos tejidos
meristemáticos.
Los meristemas suelen tener pocos o nin-
gún virus. Las razones para que ello ocurra
no están esclarecidas completamente pero
se mencionan como posibles las siguientes:
1.- Sistema vascular poco diferenciado. Los
virus son rápidamente transportados a lo lar-
go de toda la planta por el floema y así se
distribuyen sistémicamente. Los meristemas
no tienen tejido vascular formado, por lo
tanto, el avance es solamente a través del
movimiento célula a célula. Se comprobó que
el Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potato
virus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el teji-
do vascular y 5 a 15 µ/h de célula a célula. Por
esta razón se supone que las células
meristemáticas no están completamente in-
vadidas por virus cuando están en activo cre-
cimiento.
2.- Elevada actividad metabólica.
Presumiblemente es más difícil para un virus
invadir células con elevada actividad
metabólica, como es el caso de las células
meristemáticas, donde tiene lugar una acti-
va mitosis.
3.- Elevadas concentraciones de auxinas.
Se ha observado que elevadas concentracio-
nes de 2,4-D en el medio de cultivo inhiben
la multiplicación de los virus. Por lo tanto se
puede suponer que las altas concentraciones
de auxinas endógenas existentes en los ápi-
ces meristemáticos pueden producir un efec-
to similar.
3 Meristema apical
El meristema apical incluye las células
meristemáticas iniciales y sus derivadas inme-
diatas del ápice de la raíz o del brote. El nú-
mero de células iniciales es variable y pueden
presentarse en una o más filas.
304 CONCI, Vilma C.
Dentro del meristema apical se distinguen
dos zonas de tejido: la túnica, que consta de
una o más capas periféricas de células, y el
cuerpo, masa celular rodeada por la túnica.
La demarcación entre ambas zonas se dedu-
ce de las diferencias en la división de las célu-
las. Las capas de la túnica presentan predo-
minantemente divisiones anticlinales, es de-
cir, experimentan un crecimiento en superfi-
cie. Las células del cuerpo se dividen según
varios planos y la masa crece en volumen. El
concepto de túnica-cuerpo fue desarrollado
refiriéndose a las angiospermas pero resulta
poco apropiado para la caracterización del
meristema apical de las gimnospermas. En
este grupo se presentan comúnmente varias
zonas de crecimiento derivadas de un grupo
de células iniciales superficiales.
El diámetro de los ápices oscila entre 90µ
en algunas angiospermas a 3,5mm en el caso
de Cyca revoluta. La forma y el tamaño del
ápice cambian notoriamente durante el de-
sarrollo de la planta.
Las hojas se inician mediante divisiones
periclinales de un pequeño grupo de células
situadas al lado del meristema y su situación
en relación al meristema apical varía en las
diferentes especies (Fig. 1).
Primordios
foliares
Nudos
Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciación de la hoja
en el ápice del brote de dicotiledónea de hojas opuestas
(Esau, 1959).
4 Factores que pueden afectar la
producción de plantas libres de virus
Varios factores pueden afectar el buen
desarrollo in vitro de una planta a partir de
un meristema: el medio de cultivo emplea-
do, el estado fisiológico del explanto, la con-
centración de hormonas endógenas del
explanto, las contaminaciones internas o
externas producidas durante el desarrollo del
cultivo, el tamaño y localización del explanto,
etc. Mencionaremos aquí algunas considera-
ciones haciendo especial referencia a aque-
llas que afectan la obtención de plantas li-
bres de virus.
- Localización del explanto: frecuente-
mente se utilizan meristemas apicales y
axilares con buenos resultados. Sin embargo
es aconsejable el uso de yemas terminales
ya que tienen un mayor crecimiento poten-
cial que las yemas laterales. En general, los
meristemas más jóvenes se desarrollan me-
jor que los viejos y producen mayores canti-
dades de plantas libres de virus que las ye-
mas laterales, probablemente porque tienen
un crecimiento más activo que las axilares. No
obstante, también es posible la obtención
de plantas sanas a partir de yemas axilares.
- Estación o momento de la extracción:
los meristemas en activo crecimiento son los
más recomendados por su alto potencial de
desarrollo, situación que favorece las posibili-
dades de obtener plantas libres de virus. Para
especies vegetales con períodos de
dormancia definidos los mejores resultados
se obtienen cuando los meristemas están
despiertos y comienzan a brotar. En el caso
de ser necesario se recomienda despertar el
material. Los tratamientos más usados con-
sisten en someterlo a períodos de frío (varia-
ble según la especie) y/o el uso de ácido
giberélico.
- Tamaño del explanto utilizado: el
meristema tiene una serie de requerimientos
nutricionales para cumplir sus funciones de
autoperpetuación y de generar células para
formar tejidos definidos. Por lo tanto, al ser
retirado de la planta debe ser sembrado en
un medio de cultivo apropiado, así rápida-
mente desarrolla en una planta completa.
Cuanto más pequeño sea el meristema
(explanto) más difícil será encontrar el me-
dio de cultivo adecuado que permita un buen
desarrollo. Se ha observado que sembrar sólo
el domo meristemático, en general no da
buenos resultados. En la mayoría de los ca-
sos no se desarrolla una planta, sólo produ-
ce callo que luego puede, o no, regenerar
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
plantas. Como se mencionó anteriormente,
la diferenciación a partir de callo implica un
incremento en la posibilidad de aparición de
mutaciones y de variabilidad no deseada
cuando se intenta obtener plantas
genéticamente iguales a las donantes de
explantos. Por esta razón generalmente se
cultiva el domo, con uno o dos primordios
foliares, a partir del cual se obtiene con fre-
cuencia una planta completa.
El tamaño del explanto, así como el nú-
mero de primordios que deba poseer, de-
penderá, en cada caso, del objetivo que se
persiga, la especie vegetal que se trate y el o
los virus involucrados. En términos generales,
cuanto más grande sea el explanto, mayor
será la posibilidad de regenerar plantas, pero
menor la posibilidad de obtener plantas li-
bres de virus. Si por el contrario se parte de
plantas ya saneadas, o lo que se desea es
sólo la multiplicación del material in vitro, se
podrán usar yemas o brotes de mayor tama-
ño y asegurar así el desarrollo de una planta
sin mayores requerimientos nutricionales.
Existe un gradiente de incremento en la
concentración de virus desde el domo
meristemático hacia los sucesivos primordios
foliares coincidiendo con el grado de diferen-
ciación. Esto significa que la probabilidad de
obtener plantas libres de virus es inver-
samente proporcional al tamaño del
explanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y
0,5 mm son los que más frecuentemente pro-
ducen plantas libres de virus. También se han
informado, sin embargo, buenos resultados
con el empleo de meristemas más grandes.
El tamaño recomendado es variable y depen-
de del hospedante, de tratamientos previos
(termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (o
los) virus involucrados. En algunos casos no
sólo es importante considerar la especie
hospedante sino también el cultivar, ya que
se han detectado notables diferencias entre
ellos.
Por otra parte, es probable que el tama-
ño del meristema por si solo no sea el factor
que determina el éxito en la obtención de
plantas libres de virus. Se han detectado nu-
merosos virus en meristemas apicales de 0,1-
0,5mm en diferentes especies (clavel, poro-
to, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sin
embargo se ha logrado la obtención de plan-
tas sanas con explantos de esos tamaños o
305
mayores, por lo que se podría suponer que
la eliminación de virus ocurre también duran-
te el proceso de cultivo in vitro o por alguna
otra razón no aclarada todavía.
5 Desarrollo del cultivo
El primer paso es la extracción del
meristema o explanto. Para ello se corta una
porción de tejido de aproximadamente 1cm
que incluye el meristema y se desinfecta. Esto
frecuentemente se realiza mediante la inmer-
sión en alcohol seguida de inmersión en
hipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cá-
mara de flujo laminar y con la ayuda de ins-
trumental estéril y bajo microscopio
estereoscópico se procede a la escisión del
explanto. Una vez extraído se coloca en un
medio de cultivo adecuado en el cual es man-
tenido, para su desarrollo, bajo condiciones
apropiadas de luz, temperatura y humedad.
- Fase I: Etapa de iniciación: el objetivo
de esta primera etapa es iniciar el desarrollo
del explanto cultivado en forma aséptica. En
general ocurre primero un aumento del ta-
maño y luego el tejido puede ir adquiriendo
lentamente pigmentación verde. Posterior-
mente irán desarrollándose brotes o plantas
completas a partir de las cuales pueden
obtenerse yemas axilares.
- Fase II: Etapa de multiplicación: en esta
etapa el objetivo es la multiplicación activa
del explanto para la producción de numero-
sas plantas a partir de una, constituyendo
así un clon proveniente de un solo meristema,
denominado en este caso «mericlon». La
multiplicación o micropropagación puede
efectuarse por proliferación de brotes axilares,
brotes adventicios, formación de embriones
somáticos, etc., tratando siempre de evitar
la formación de callo como paso previo a la
diferenciación. La etapa de multiplicación
puede involucrar varios repiques del material
a medio de cultivo fresco. Se ha visto con fre-
cuencia que la tasa de multiplicación varía con
el tiempo de permanencia del explanto en
el medio de cultivo. Es frecuente que después
de 2 o más subcultivos aumente el número
de yemas que se producen a partir de un
explanto. Sin embargo no es aconsejable
mantener el material indefinidamente en
306 CONCI, Vilma C.
esta etapa, ya que se ha observado un au-
mento de la variabilidad cuando las plantas
son mantenidas por largos períodos en es-
tas condiciones. En general, se considera que
10-12 subcultivos es lo máximo que debería
mantenerse el material en esta etapa.
- Fase III: Etapa de acondicionamiento
para el transplante a tierra: frecuentemen-
te las plantas desarrolladas in vitro no po-
seen raíces o, si las tienen, muchas veces no
son funcionales. En general tienen malas co-
nexiones vasculares entre la raíz y el tallo. A
nivel foliar puede estar alterada la produc-
ción de clorofila. Los estomas no funcionan
o lo hacen muy lentamente y la capa de cera
epicuticular es muy reducida.
La formación de raíces adventicias es re-
lativamente fácil de conseguir en plantas
herbáceas, y dificultosa en leñosas. Existe una
etapa de inducción de raíces, de iniciación del
crecimiento y de elongación de las mismas.
En esta fase del crecimiento se suele in-
crementar la intensidad de luz para favore-
cer la rusticación de las plantas pero hay que
tratar de que la misma no afecte a las raíces.
Esto puede mejorarse cubriendo la base de
los tubos con papel de aluminio o usando
0,3% de carbón activado en el medio de cul-
tivo para proporcionar sombra a las raíces.
Las plantas que se propagan por bulbos,
tubérculos, rizomas, etc., pueden ser induci-
das a formarlos in vitro para mejorar la efi-
ciencia en el transplante, ya que éstos pue-
den ser cosechados del tubo de ensayo y
sembrados directamente en tierra sin mayo-
res dificultades.
-Transplante: en el momento del trans-
plante es importante no dañar las raíces. Es
necesario lavarlas cuidadosamente para reti-
rar los restos de agar, debido a que los me-
dios de cultivo ofrecen un buen sustrato para
el desarrollo de hongos y bacterias que pue-
den afectar el desarrollo de la planta en el
suelo.
El mayor problema en esta etapa es la
deshidratación debida a algunas característi-
cas anatómicas que presentan las plantas
creciendo in vitro (reducida cera epicuticular,
lentitud de movimiento estomático, abun-
dantes espacios intercelulares, dificultades en
la conexiones entre el tallo y la raíz). Convie-
ne transferir las plantas a macetas y mante-
nerlas con alta humedad relativa durante los
primeros 15 días. Se han observado buenos
resultados con el uso de rocío artificial o ne-
blina. Otra práctica frecuente es cubrir las
plantas con polietileno o recipientes de vi-
drio transparente, a modo de cámara húme-
da, y descubrirlas progresivamente hasta
destaparlas completamente al cabo de 3 ó 4
semanas.
6 Multiplicación del material libre de
virus ex vitro
Las plantas libres de virus deben ser mul-
tiplicadas bajo condiciones controladas para
evitar su recontaminación. Una vez rusticadas
y adaptadas nuevamente a las condiciones
ex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajo
jaulas antivectores todo el tiempo que se
considere necesario. En esta etapa es impor-
tante evitar que las plantas se reinfecten. Es
recomendable la esterilización del suelo para
evitar la contaminación con nematodes y
hongos, que en algunos casos son transmi-
sores de virus. Las jaulas deben estar revesti-
das de una malla muy fina para evitar la en-
trada de los vectores. Es recomendable, para
evitar la entrada de los vectores, utilizar una
doble puerta que permita abrir una de las
hojas y recién cuando está cerrada, abrir la
otra. Periódicamente la malla debe ser con-
trolada para detectar inmediatamente la
presencia de roturas que dejen expuestas a
las plantas. A pesar de estos cuidados, es re-
comendable aplicar insecticidas y mantener
libre de malezas dentro y fuera de la jaula,
ya que las mismas pueden actuar como
reservorios de vectores. Si bien la sanidad del
material introducido a las jaulas debe ser pre-
viamente controlada, es conveniente, en esta
etapa, repetir los análisis para detectar rápi-
damente la presencia de una infección a fin
de eliminarla antes de que se propague. En
estas condiciones es posible mantener como
«plantas madres», por mucho tiempo, un
stock de material libre de virus a partir del
cual se pueden hacer las sucesivas multiplica-
ciones.
La etapa de multiplicación masiva, o a
gran escala, se realiza a campo en áreas ais-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
ladas de focos de contaminación. Esta eta-
pa se extiende todo el tiempo necesario has-
ta la obtención del número requerido de in-
dividuos para realizar la producción a nivel
comercial. Si el área protegida está lo suficien-
temente alejada de plantas infectadas y se
evita el acceso de los vectores, es posible
mantener las plantas libres de virus por mu-
chos ciclos de cultivo. Son fundamentales los
análisis periódicos que permitan llevar un re-
gistro del estado sanitario del material.
7 Algunas alternativas para mejorar la
eficiencia en la producción de plantas
libres de virus
- Termoterapia: es la técnica más antigua
utilizada para la liberación de patógenos en
plantas. No obstante, es difícil la obtención
de plantas libres de virus con el empleo de
altas temperaturas solamente. Mantener las
plantas enfermas por períodos prolongados
en termoterapia disminuye la concentración
de virus, pero al llevar las plantas nuevamen-
te a condiciones normales, en poco tiempo
recuperan la concentración original.
Una práctica muy usada es la combina-
ción de la termoterapia y el cultivo de
meristemas. Esto implica mantener las plan-
tas en termoterapia por un período variable
de tiempo y temperatura (generalmente
entre 34° y 38°C desde una a varias sema-
nas), luego se realiza la extracción del
meristema, se siembra en el medio de culti-
vo y se continúa con los pasos convenciona-
les para su desarrollo.
Esta práctica no es efectiva para todos
los virus por igual, depende del virus y del
hospedante. Se ha observado que un mis-
mo virus en distintas especies se inactiva en
forma diferente. Generalmente, esta prácti-
ca ha resultado más efectiva en virus de par-
tículas alargadas, y menos eficiente para vi-
rus poliédricos.
Podría suponerse que cuanto más largo
es el tratamiento de calor, resulta más efec-
tivo; sin embargo, no siempre es así. En cri-
santemo y en ajo se ha mencionado, por
ejemplo, que tratamientos de 10-30 días
pueden ser efectivos para la liberación de al-
gunos virus; en cambio, tratamientos más
prolongados no siempre producen mayor
porcentaje de plantas sanas. Estos tratamien-
307
tos prolongados, por otra parte, dificultan
la implantación in vitro del tejido, lo cual se
traduce en un número más reducido de plan-
tas obtenidas.
En algunos casos las bajas temperaturas
(5°C) seguidas del cultivo de meristemas fue-
ron utilizadas con éxito para la eliminación
de virus. Esta práctica fue aplicada principal-
mente en el caso de viroides, los cuales se
desarrollan bien con altas temperaturas.
- Quimioterapia: el uso de antivirales se-
ría la solución definitiva para estas enferme-
dades; sin embargo, hasta ahora no se ha
encontrado un producto que por sí solo cum-
pla esta función. Algunas sustancias químicas
ocasionan una disminución en la concentra-
ción de virus existentes en la planta y ate-
núan, o suprimen, los síntomas típicos de los
virus, pero, una vez suspendido el tratamien-
to se recupera la concentración original. Han
sido evaluadas diferentes sustancias pero la
más utilizada es el Ribavirin o Virazole (1-β-D-
ribofuranosyl-1, 2, 4 – triazole –3- carboxami-
de).
Un modo adecuado de emplear los anti-
virales es combinándolos con el cultivo de
meristemas. También han sido aplicados di-
rectamente a los meristemas in vitro. En este
caso, el antiviral es colocado en medio del
cultivo en concentraciones variables, que van
desde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta
100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajo
la acción del antiviral por largos períodos que
incluyen varios subcultivos.
Un problema importante con el Virasole
es su fitotoxicidad, que a su vez depende de
la dosis empleada y de la especie de planta
utilizada. El éxito del proceso en muchos ca-
sos requiere de varios meses de tratamiento
y la fitotoxicidad del antiviral constituye una
dificultad.
También se han obtenido plantas libres
de virus a partir de callos a los que previa-
mente se les aplicó Virasole, aunque esta
práctica no ha sido eficiente en todos los ca-
sos.
- Electroterapia: el método consiste en
aplicar corriente eléctrica a yemas por un
período variable de tiempo para obtener
plantas libres de patógenos. Se menciona
que la aplicación de electricidad produce de-
308 CONCI, Vilma C.
gradación de las partículas y pérdida de
infectividad. Esta técnica ha sido citada para
liberar del mosaico al almendro cv
Caetanuccia. Para ello los brotes fueron so-
metidos a 500V por tiempos variables y lue-
go injertados sobre pies sanos (obtenidos
por semilla). Se señaló que con 5 minutos de
tratamiento los resultados fueron buenos y
con 20 minutos se obtuvo completa
inactivación. El método también ha sido
empleado para eliminar bacterias de caña de
azúcar, Potato leaf roll virus de papa,
Dasheen mosaic virus de araceas y Banana
streak virus de banana, entre otras, aplican-
do 5-30V a las yemas por un período de 5
minutos. En este caso se obtuvo una eficien-
cia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y el
patógeno.
- Cultivo de domos proveniente del dis-
co basal (stem-disc dome culture): el pro-
cedimiento consiste en la obtención de plan-
tas libres de virus a partir del cultivo de es-
tructuras con forma de domo, diferenciadas
a partir del cultivo del disco basal de dientes
de ajo.
Se ha informado la diferenciación de 20-
30 brotes a partir del cultivo del disco basal
de dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Este
método fue designado por los autores
(Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del disco
basal (¨stem-disc culture¨). Una modificación
posterior de esta técnica consiste en la ex-
tracción de las estructuras con forma de
domo y su posterior cultivo en un medio ade-
cuado para la obtención de plantas.
- Microinjerto de ápices caulinares in
vitro para obtención de plantas de naran-
jo libres de virus: consiste en extraer el ápi-
ce caulinar de la variedad a injertar,
constituído por el domo apical y primordios
foliares, y luego sembrarlo sobre la superficie
decapitada del epicótilo de una plántula de
2 semanas de edad (patrón) proveniente de
semilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas cí-
tricas libres de enfermedades)
8 Análisis de las plantas obtenidas o
indexing
De lo expuesto previamente surge que
existen varias alternativas para obtener plan-
tas libres de virus a partir del cultivo de
meristemas. Si bien existen algunos
lineamientos, o consideraciones generales
para tener más probabilidades de éxito, no
hay proceso que ofrezca total seguridad. La
etapa decisiva en este sistema es el análisis
que permite comprobar si realmente se ha
producido la total erradicación de los virus.
En la bibliografía se señalan distintos porcen-
tajes de éxito en el proceso. Esto significa que
empleando el mismo protocolo, en el mis-
mo momento, con el mismo material, se con-
siguen plantas sanas y plantas que aún per-
manecen infectadas. Por lo tanto, la única
forma de separar las plantas sanas de las
enfermas es un análisis que permita distin-
guirlas para luego multiplicar solo aquellas que
fueron liberadas de los virus. El éxito de un
programa de producción de plantas libres de
virus no depende de la obtención de un alto
porcentaje de plantas sanas en al primera
etapa, sino en la obtención de al menos unas
pocas plantas madres realmente libres de
patógenos. Si el número es escaso pueden
ser multiplicadas por diferentes sistemas,
pero si alguna de ellas está contaminada,
todo el trabajo será inútil, porque al final,
después de las multiplicaciones a campo, lo
más probable es que tengamos todas las
plantas enfermas.
Las plantas deben ser analizadas una por
una para hacer una buena selección de «plan-
tas madres» a partir de las cuales se iniciarán
los procesos de multiplicación del material.
Es recomendable hacerle más de un análisis
para asegurar su sanidad, es preferible que
sea en etapas diferentes a lo largo del proce-
so, y en lo posible por técnicas distintas.
Para realizar un análisis confiable hay que
tener en cuenta varios factores que son es-
pecíficos para cada combinación planta-pa-
tógeno. Es importante el empleo de siste-
mas de alta sensibilidad que nos permitan
detectar los virus aun en bajas concentracio-
nes; sin embargo, no existe un sistema que
sea infalible, siempre hay un límite de con-
centración por debajo del cual el virus no
puede ser detectado. Para evitar errores en
este sentido es recomendable tener en cuen-
ta algunos factores. Como ya se ha mencio-
nado, la concentración de virus no es igual
en todas las partes de una planta; por lo tan-
to, si queremos hacer un análisis confiable hay
que establecer qué tejidos y órganos son los
que concentran más el patógeno y realizar
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
la prueba a partir de ellos. Del mismo modo
también se ha comprobado que existen fluc-
tuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lo
tanto, es conveniente realizar el análisis cuan-
do la concentración de virus es mayor. Esto
es importante cuando se prueba el material
a campo.
La elección de la técnica de análisis de-
penderá del patógeno que se desea elimi-
nar y de las posibilidades para realizarla.
Cuanto más temprano se descarten las
plantas contaminadas más seguro será el sis-
tema. Una planta infectada siempre es un
foco de contaminación. Por más cuidados
que se tengan siempre se corren riesgos.
Cuando las plantas están in vitro, en gene-
ral, la concentración de virus es muy baja,
probablemente debido a las condiciones de
cultivo, la concentración de hormonas en el
medio, u otros factores no bien establecidos.
Sin embargo, es recomendable hacer un aná-
lisis riguroso antes de empezar con la
micropropagación para hacer el primer des-
carte de individuos enfermos.
Frecuentemente se menciona en esta
etapa el empleo de la técnica inmuno-
enzimática de doble sándwich de anticuerpos
(DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en una
placa de poliestireno con 96 celdillas en la cual
se lleva a cabo una prueba por celdilla. En el
primer paso cada celda es tapizada por el
anticuerpo específico para el patógeno que
se está analizando. Luego se coloca el extrac-
to de la planta a probar. Si los virus están en
el mismo serán atrapados por el anticuerpo
previamente colocado. En el tercer paso se
aplica un anticuerpo combinado con una
enzima y en el último paso se coloca el
sustrato específico para la enzima. Si el virus
está presente en la muestra se produce el
sándwich anticuerpo-virus-anticuerpo conju-
gado con la enzima, el sustrato es desdobla-
do y la reacción vira al color amarillo (respues-
ta positiva, planta enferma). (Fig. 2).
Esta técnica tiene varias ventajas, ya que
permite el análisis simultáneo de muchas
muestras (96 celdillas por placa y se pueden
hacer varias placas simultáneamente). Es re-
lativamente fácil de usar y de bajo costo. Sin
embargo, nuestra experiencia nos indica que
esta prueba no es lo suficientemente sensi-
ble para detectar los virus en algunos casos.
Muchas de las plantas in vitro que dan resul-
309
tados negativos mediante DAS-ELISA resul-
tan positivas cuando se prueban por otra
técnica. Algunas variantes, como ELISA en
membrana de nitrocelulosa o Dot Blot, han
sido empleadas con resultados más satisfac-
torios; sin embargo, estas técnicas por sí so-
las permiten el escape de muchas plantas
infectadas.
Mejores resultados se han obtenido con
el empleo de técnicas que combinan la
Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultados
positivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras).
serología con la microscopia electrónica como
son la inmunoelectromicroscopía con o sin
decoración (ISEM o ISEM-D). En esta técnica
se tapiza una grilla porta especimen con an-
ticuerpo y luego se coloca sobre ella el extrac-
to de la planta a probar. Si las partículas virales
están presentes quedarán atrapadas al anti-
cuerpo. Luego se contrasta y se observa por
el microscopio electrónico (ME), donde se
pueden ver las partículas de virus que han sido
selectivamente atrapadas. Esto es lo que se
llama ISEM. Si antes de contrastar se aplica
otra vez el antisuero y éste es atrapado por
las partículas virales las mismas se verán más
oscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y serán
más fáciles de detectar (Fig. 3). Estas técni-
cas son altamente sensibles, permiten la ob-
servación directa del virus por lo cual no hay
falsos positivos y no se requiere un antisuero
de alta calidad para su desarrollo. El grave
inconveniente con ellas es que no son de uso
masivo, porque es engorroso analizar gran
cantidad de muestras, y por otra parte, se
requiere de un ME, que es un equipo alta-
mente costoso.
310 CONCI, Vilma C.
Figura 3: Extracto vegetal
conteniendo una mezcla
de virus probado por
ISEM-D con antisuero para
Garlic virus A. Izq.,
partícula viral decorada
con el antisuero utilizado.
Der., partícula viral no
decorada de una especie
viral diferente.
Las técnicas basadas en la detección de
los ácidos nucleicos han mostrado un gran
desarrollo y evolución en la última década, y
son utilizadas con frecuencia debido a su alta
sensibilidad y especificidad. El uso de sondas
moleculares ha dado buenos resultados. Con-
siste en dar condiciones para que el ácido
nucleico del patógeno, fijado sobre un sopor-
te sólido (membrana de nylon), se una con
un fragmento de ácido nucleico complemen-
tario, marcado con moléculas radioactivas, o
con un antígeno que luego será reconocido
por un anticuerpo específico que será detec-
tado por colorimetría o fluorescencia. La re-
acción en cadena de la polimerasa (PCR) y
sus variantes son las técnicas de mayor sensi-
bilidad con que se cuenta actualmente. En-
tre ellas se mencionan: PCR anidado, trans-
cripción reversa (RT), inmuno captura (IC) PCR
post. transcripción reversa (RT-PCR), entre
otras. La PCR consiste en amplificar un frag-
mento del genoma del virus mediante la uti-
lización de dos iniciadores que hibridan
específicamente en el genoma del patóge-
no. La técnica permite producir, en corto
tiempo, muchas copias del segmento del
genoma comprendido entre los 2 iniciado-
res, de tal forma que luego es posible obser-
varlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Esto
posibilita la detección de los virus, aun en
bajísimas concentraciones. Esta técnica ade-
más puede ser combinada con la serología y
ser realizada en placas como las de ELISA, lo
que permite el análisis simultáneo de muchas
plantas. Estas pruebas, si bien son altamen-
te sensibles, no son aún de uso masivo por-
que tienen un costo muy elevado.
Para obtener resultados en forma prácti-
ca y confiable es posible también la combi-
 Figura 4: Fragmentos
amplificados por IC-RT-
PCR. Líneas 1-4,
segmentos de 489pb
correspondientes a
Onion yellow dwarf
virus; líneas 4-5,
segmentos de 566pb
correspondientes a
Leek yellow stripe
virus; línea 6, marcador
de peso molecular.
nación de varias pruebas, pudiendo, por
ejemplo, aprovechar la practicidad del ELISA
y la sensibilidad de las técnicas moleculares,
o de ISEM u otras. En este caso, las plantas
que resultan negativas para el test de ELISA
pueden ser luego analizadas por una técnica
más sensible y disminuir así el número de prue-
bas complicadas o costosas. Esto depende
de la cantidad de plantas que ELISA sea ca-
paz de detectar, porque si no es lo suficien-
temente sensible tendremos que repetir la
prueba con todas, o casi todas las muestras.
Como se mencionó anteriormente, la
concentración de virus en las plantas in vitro
en general es baja, por lo tanto, se corre el
grave riesgo de considerar como sanas plan-
tas que, en realidad, están infectadas. Por
esta razón se hace casi obligatorio repetir los
análisis cuando las plantas son transferidas
al suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiem-
po antes de hacer el análisis, para que si el
virus está presente, tenga la posibilidad de
incrementar su concentración y ser entonces
fácilmente detectado. En esta etapa se utili-
za con frecuencia el test de ELISA en cualquie-
ra de sus variantes, que generalmente con-
duce a resultados confiables.
En algunos casos el sistema que resulta
más eficiente para hacer el indexing es el
empleo de plantas indicadoras. El injerto es
la forma más segura de transmitir un virus y
esto es lo que se emplea como sistema de
diagnóstico. Se realiza un injerto desde la
planta que se desea probar a plantas que
son susceptibles al virus (planta indicadora) y
que desarrollan síntomas claros y evidentes
de la presencia del patógeno. El inconvenien-
te, en este tipo de análisis, es que hay que
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
esperar que la planta obtenida in vitro sea
transferida al suelo, luego que se desarrolle
lo suficiente como para extraer una porción
de tejido (hoja, yema, brote, etc., según el
tipo de injerto). Se requiere además de un
operador con habilidad para realizar el injer-
to con éxito y luego mantener las plantas
injertadas en condiciones adecuadas hasta
la aparición de los síntomas. En algunos ca-
sos, este tiempo puede ser muy prolonga-
do. A pesar de los inconvenientes que se men-
cionan, para algunas especies este sigue sien-
do el método más seguro. Por ejemplo la
frutilla, que es afectada por más de 20 enfer-
medades diferentes y que en muchos casos
ni siquiera ha sido todavía caracterizado el
agente causal, la transmisión del virus a plan-
tas indicadoras resulta la prueba más efecti-
va. En este caso se injerta el folíolo medio de
una hoja perteneciente a la planta que se
desea probar en plantas indicadoras en las
cuales los patógenos van a dar síntomas cla-
ros. Algunos virus se van a manifestar des-
pués de 2 ó 3 semanas de realizado el injer-
to; en otros casos, la bibliografía menciona
que los síntomas aparecen entre los 6 y 12
meses. Con frecuencia, no es posible identifi-
car que virus es el que está presente, pero es
posible determinar si la planta está infecta-
da.
En vid, parte de los virus son analizados
mediante ELISA. Pero otros son probados por
injerto a plantas indicadoras. Algunos de los
virus pueden ser detectados en pocas sema-
nas, pero para el stem pitting/grooving
sindrome, por ejemplo, es necesario esperar
entre 8 y 12 meses.
9 Algunas consideraciones respecto a los
análisis de virus
En general, cuando se habla de las plan-
tas liberadas de virus se emplean términos
como «plantas libres de virus» «planta sana»
o «saneada» sin que se defina qué virus fue-
ron eliminados ni qué pruebas se emplearon
para comprobar su eliminación. El concepto
de plantas libres de virus debería estar aco-
tado al, o a los virus, analizados. En el caso
de plantas que son afectadas por un conjun-
to de virus diferentes sería necesario realizar
un análisis independiente para cada uno de
311
ellos y señalar el o los virus de los cuales ha
sido liberada o probada. Por otra parte debe
definirse la técnica de análisis empleada.
Como se mencionó previamente pueden
emplearse diferentes métodos de diagnósti-
co con distintos grados de sensibilidad. Así,
por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISA
calibrado para detectar hasta 10 ng/ml y un
RT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y se
analiza una planta con 50 pg/ml; la técnica
de DAS-ELISA no va a detectar el patógeno y
el resultado será negativo, mientras que el
RT-PCR arrojará un resultado positivo. Todas
las técnicas tienen un límite de sensibilidad
por debajo del cual no son capaces de de-
tectar la presencia del patógeno. Por consi-
guiente, dependiendo de la sensibilidad de
la técnica que se use, el porcentaje de plan-
tas supuestamente «libres de virus» puede
variar. Lo correcto sería entonces hablar de
plantas negativas a un virus probado me-
diante una técnica determinada. Por ejem-
plo, «plantas negativas a Onion yellow
dwarf virus mediante DAS-ELISA», lo que no
significa que realmente está libre de virus sino
que la técnica no lo detectó. Por esa razón
se aconseja evaluar las plantas en más de una
oportunidad y repetir los análisis cuando las
plantas están a campo, para darle al pató-
geno, si está presente, la posibilidad de mul-
tiplicarse.
10 Agradecimientos
A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, Sergio
Nome y al Dr. Luis Conci por la revisión del
presente manuscrito; y a la Ing. Agr. Eva
Cafrune por su colaboración en la búsqueda
de información.
312 CONCI, Vilma C.
11 Lecturas Recomendadas
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