Anda di halaman 1dari 34

Interpretasi hasil kurva PCR

Covid-19
Andi Utama, PhD
Laboratory Director, KALGen Innolab

Webminar Molecular Diagnostic of Covid-19, 20 Oct 2020


PCR Evolution

PCR Real Time PCR Digital PCR


Qualitative Relative Quantitative Absolute Quantitative
Apa itu real time PCR?

The Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah proses amplifikasi


(perbanyakan) suatu fragmen DNA.

Real-Time PCR adalah teknik khusus yang memungkinkan reaksi PCR


bisa divisualisasi dan dideteksi secara “real time” selama proses
PCR berlangsung (fase awal reaksi).

Real-Time PCR memungkinkan kita untuk mengukur jumlah DNA di


dalam sampel.
Bagaimana real time bekerja?

Untuk memahami apa itu real time PCR, mari


kita lihat lagi bagaimana PCR bekerja......!
Komponen dan Step PCR
Bagaimana PCR bekerja?
3’ 5’
5’ 3’

d.NTPs
Primers
Thermal Stable
DNA Polymerase

Add to Reaction Tube

95°C

Denaturation

55°C
Annealing
3’ 5’

5’ 3’

72°C Extension
3’ Taq 5’

5’ 3’
Taq

Extension Continued

3’ Taq 5’

Taq 3’

Repeat
3’ 5’
3’

3’ 5’
3’
Cycle 2
3’ 5’
3’
4 Copies
3’
3’

3’ 5’
3’
3’ 5’
3’

3’ 5’

3’
3’
5’
Cycle 3
3’

3’ 5’
3’ 8 Copies
3’ 5’
3’

3’ 5’
3’

3’
3’
Bagaimana real time PCR bekerja?
Q R

5’ 3’

Extension
R
Q
Taq
5’ 3’
R

Q
Hydrolysis
Taq
5’
5’ 3’

R
Taq
5’
5’ 3’

l
+ Probe R
Signal
Taq
5’
5’ 3’
Real-Time PCR adalah teknik khusus yang memungkinkan
reaksi PCR bisa divisualisasi dan dideteksi secara “real time”
selama proses PCR berlangsung.

Relative Quntitative
Bagaimana menghitungnya?

Mari bayangkan di dalam tube PCR saya ada 1,000,000 copi DNA
pada cycle ke-25....

Cycle Me

23 250,000

24 500,000

25 1,000,000
Jika anda memiliki DNA 4x dari DNA yang saya miliki...anda akan
mencapai 1,000,000 copi pada cycle ke-23, 2 cycle lebih cepat
dari DNA saya

Cycle 25

Cycle Me You

23 250,000 1,000,000

24 500,000 2,000,000

25 1,000,000 4,000,000
Sebaliknya, jika anda memiliki 1/8 dari DNA yang saya miliki...
• anda hanya memiliki 125,000 copi pada cycle ke-25,
• anda akan memiliki 1000,000 copi pada cycle ke-28, 3 cycle lebih lama

Cycle 25

5000000

Cycle Me You 4500000

4000000

25 1,000,000 125,000 3500000

3000000

26 2,000,000 250,000
2500000

2000000

27 4,000,000 500,000
1500000

1000000

500000

28 8,000,000 1,000,000 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Jika di rekap…

4 units 1 unit 1/8 unit


Ct=23 Ct=25 Ct=28
5000000

4500000

4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

1500000

1000000

500000

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tes real time PCR Covid-19?
SARS-CoV-2
Prosedur & kontrol real time PCR
Step Kontrol
RNA extraction Internal Control (IC)

Reverse Transcription

One-step Positive Control


PCR PCR (PC) & Negative
Control (NC)

Data analysis
Pemilihan alat dan protokol?
Apakah kit sudah divalidasi dengan alat PCR yang akan digunakan?

<Interpretasi hasil>
Sudah

Jalankan tes dan analisa


hasil sesuai protokol/insert kit
Pemilihan alat dan protokol?
Apakah kit sudah divalidasi dengan alat PCR yang akan digunakan?

Belum

Pastikan flurescence kit bisa dideteksi


di alat yang akan digunakan
Pemilihan alat dan protokol?
Apakah kit sudah divalidasi dengan alat PCR yang akan digunakan?

Belum

Pastikan flurescence kit bisa dideteksi


di alat yang akan digunakan

Lakukan optimasi protokol


Interpretasi hasil

Ct? 4 units 1 unit 1/8 unit


Ct=23 Ct=25 Ct=28
5000000

4500000

4000000

3500000

3000000

2500000

2000000

Ct (threshold cycle) 1500000

• Threshold cycle (Ct) adalah jumlah cycle dimana signal 1000000

flurescence memotong garis ambang (threshold line). 500000

• Semakin sedikit sampel template, nilai Ct semakin tinggi 0


0 5 10 15 20 25 30 35 40

• Ct value otomatis terhitung jika kita sudah menentukan


threshold line
Bagaimana menentukan threshold line?
• Threshold line adalah tingkat
deteksi atau garis dimana
reaksi mencapai intensitas di
atas signal dasar (background
atau baseline)
• Threshold line diset pada fase
eksponensial dari amplifikasi.
• Cycle dimana sampel
mencapai level ini disebut Ct
(Cycle Threshold).
Contoh kasus
Contoh 1 (Semua IC, PC and NTC OK)

IC IC

Log scale Linear scale


NTC=baseline
Log scale

Target Gen 1 Target Gen 2


Linear scale

Target Gen 1 Target Gen 2


Contoh 2 (ada IC yang tidak OK)

Log scale Linear scale


Contoh 3 (signal tidak sigmoid)

Target Gen 1 Target Gen 2

Sigmoid
?
Poin poin penting saat menganalisa data
• Pastikan Internal Control positif (range Ct sesuai kit insert)
• Pastikan Positive Control dan Negative Control (No Template Control)
juga valid.
• Signal yang bagus adalah yang berbentuk sigmoid (pada saat linear
scale), tetapi pada Ct tinggi, sering tidak ditemukan bentuk ini
• Analisa dan threshold setting harus dilakukan untuk masing-masing
target gen
• Threshold diset pada fase exponensial dar kurva dan di atas signal
dasar (baseline)
• Jika kurang yakin, disarankan minta bantuan teknis kepada vendor
alat.
Terima kasih

Anda mungkin juga menyukai