Metode IMViC uji ditingkatkan diungkapkan yang cocok untuk melakukan beberapa tes

IMViC bakteri pada media padat. The method comprises (1) obtaining a suitable culture
of bacteria by growing the bacteria first in LST broth, then in EC broth and finally on
EMB agar; (2) inoculating a test plate containing solid test media for the IMViC tests in
separate compartments; (3) incubating said inoculated test plate; and (4) determining the
results of the tests. Metode ini terdiri dari (1) memperoleh budaya yang cocok bakteri
dengan menumbuhkan bakteri pertama dalam kaldu LST, kemudian dalam kaldu EC dan
akhirnya pada agar EMB, (2) inokulasi piring berisi media tes uji padat untuk tes IMViC
di ruang terpisah; (3) inkubasi kata plat uji inokulasi, dan (4) menentukan hasil tes. The
period of incubation for the IMViC tests has been reduced to 48 hours by this method.
Masa inkubasi untuk tes IMViC telah dikurangi sampai 48 jam dengan metode ini. A test
plate suitable for use with this method is also disclosed. Sebuah plat uji yang sesuai untuk
digunakan dengan metode ini juga diungkapkan.

Banyak metode isolasi dan identifikasi tes telah dikembangkan untuk menentukan
identitas strain bakteri. The isolation methods are designed to take advantage of the
different growth requirements of the various families of bacteria. Metode isolasi ini
dirancang untuk mengambil keuntungan dari persyaratan tumbuh yang berbeda dari
berbagai keluarga bakteri. Byusing specific culture (growth) media, it is possible to
obtain a culture of bacteria which has a limited number of bacterial strains. Byusing
media kultur spesifik (pertumbuhan), adalah mungkin untuk mendapatkan kultur bakteri
yang memiliki sejumlah strain bakteri. These strains may be differentiated further by
using appropriate tests. Strain ini dapat dibedakan lebih lanjut dengan menggunakan tes
yang sesuai. These tests are formulated to take advantageof the various metabolic
requirements and products of the large number of known bacterial strains. Tes ini
diformulasikan untuk mengambil advantageof persyaratan berbagai metabolisme dan
produk dari sejumlah besar jenis bakteri yang dikenal. Thus, using a specific isolation
method and a series of tests it is possible to identify an unknown bacterial culture as a
specific genus, species andvariety. Jadi, dengan menggunakan metode isolasi khusus dan
serangkaian tes adalah mungkin untuk mengidentifikasi budaya bakteri yang tidak
diketahui sebagai genus tertentu, spesies andvariety. Four such known identifying tests
are the indole, methyl red, Voges-Proskauer and citrate tests which are collectively
known as the IMViC tests. Empat seperti tes mengidentifikasi dikenal adalah indol,
merah metil, Voges-Proskauer dan tes sitrat yang secara kolektif dikenal sebagai tes
IMViC.

The indole test is used to detect the production of indole by the bacterial sample. Uji
indol digunakan untuk mendeteksi produksi indola oleh sampel bakteri. A positive ( )
result indicates the presence of indole in the test medium and is determined by the
development of a dark red color upon the addition of theappropriate reagent to the test
medium. Hasil positif () menunjukkan adanya indola dalam medium uji dan ditentukan
oleh perkembangan warna merah gelap pada penambahan reagen theappropriate ke
medium uji. The methyl red test determines the acidity or basicity of the medium after
prolonged incubation of the bacterial sample. Uji metil merah menentukan keasaman atau
kebasaan dari media setelah inkubasi lama sampel bakteri. A red color which develops
upon addition of methyl red indicator to the medium isindicative of an acidic medium and
represents the positive result. Warna merah yang berkembang pada saat penambahan
indikator metil merah ke media isindicative media asam dan merupakan hasil yang
positif. The bacterial product of acetyl-methyl-carbinol is detected using the Voges-
Proskauer test. Produk bakteri carbinol-asetil-metil terdeteksi menggunakan uji Voges-
Proskauer. The positive result is the production of acetyl-methylcarbinol and is indicated
by a redcolor which develops upon the addition of specific reagents to the medium. Hasil
positif adalah produksi asetil-methylcarbinol dan ditandai oleh redcolor yang
mengembangkan pada penambahan reagen khusus untuk media. The growth of bacteria
with citrate as the only carbon source is the basis of the citrate test. Pertumbuhan bakteri
dengan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya adalah dasar dari tes sitrat. Bacterial
growth on the citrate agar is a positive result and is also indicatedby the change in color
of the medium from greeen to deep blue. pertumbuhan bakteri pada agar-agar sitrat
merupakan hasil yang positif dan juga indicatedby perubahan warna media dari greeen
sampai dalam biru. If these results do not occur, the tests are said to be negative. Jika
hasil ini tidak terjadi, tes dikatakan negatif.

The IMViC tests are the most important and useful tests for differentiation of coliforms,
ie bacteria of the genera Escherichia and Enterobacter, into species and varieties.
Pengujian IMViC adalah tes yang paling penting dan berguna untuk diferensiasi koli,
yaitu bakteri dari genus dan coli Enterobacter, menjadi spesies dan varietas. Furthermore,
the IMViC tests are used generally for distinguishingmembers of the family
Enterobacteriacea and as a basis for the primary differentiation of E. coli and
Enterobacter aerogenes. Selanjutnya, tes IMViC digunakan umumnya untuk
distinguishingmembers keluarga Enterobacteriacea dan sebagai dasar untuk diferensiasi
utama E. coli dan Enterobacter aerogenes. For example, E. coli type 1 yields a -- result
respectively to the IMViC tests whereas Enterobacter aerogenes yields a -- result
respectively to the IMViC tests. Sebagai contoh, E. coli tipe 1 menghasilkan - hasil tes
masing-masing ke IMViC sedangkan Enterobacter menghasilkan aerogenes a - hasil tes
masing-masing ke IMViC. The IMViC tests are also useful for confirming the presence
of E. coli in foods. Tes IMViC juga berguna untuk mengkonfirmasikan keberadaan E.
coli dalam makanan. See for example Speck, ML, Compendium of methods for
microbiological examination of foods, American Public Health Association,Washington,
DC (1970). Lihat misalnya Speck, ML, Kompendium metode untuk pemeriksaan
mikrobiologis makanan, American Public Health Association, Washington, DC (1970).

However, the IMViC tests have a severe shortcoming which limits their usefulness
particularly for confirming the presence of E. coli in foods. Namun, tes IMViC memiliki
kekurangan yang parah yang membatasi kegunaannya terutama untuk mengkonfirmasi
kehadiran E. coli dalam makanan. This shortcoming is that the IMViC tests are time
consuming and procedurally laborious when conductedas prescribed by standard
methods. Kekurangan ini adalah bahwa tes IMViC yang memakan waktu dan tenaga
secara prosedural ketika conductedas ditentukan oleh metode standar. While the indole
test requires an incubation of 24 hours and the Voges-Proskauer test requires 48 hours,
the methyl red and citrate tests require a minimum incubation of 96 hours. Sementara uji
indola membutuhkan inkubasi 24 jam dan uji Voges-Proskauer membutuhkan 48 jam, tes
metil merah dan sitrat memerlukan inkubasi minimal 96 jam. Furthermore, an additional
4 days isrequired to obtain a suitable culture of the sample bacteria before the IMViC
tests may be performed. Selanjutnya, tambahan 4 hari isrequired untuk mendapatkan
sebuah budaya yang cocok untuk bakteri sampel sebelum tes IMViC dapat dilakukan.
This length of time makes it impractical to examine the presence of E. coli in foods.
Jangka waktu ini membuatnya tidak praktis untuk memeriksa keberadaan E. coli dalam
makanan. The prior art IMViC tests are useful, however, for the testingof coliforms
where time is not so critical, eg fecal coliform determinations. The prior art IMViC tes
yang berguna, namun untuk testingof pada koli di mana waktu tidak begitu penting,
misalnya penentuan coliform fecal. See for example Speck, ML supra and Association of
Official Analytical Chemists: Official Methods of Analysis, 11th Ed., Ed. Lihat misalnya
Speck, ML supra dan Asosiasi Official Analytical Chemists:. Resmi Metode Analisis, Ed
11, Ed. Horwitz, W., Association of AnalyticalChemists, Washington, DC (1970).
Horwitz, W., Asosiasi AnalyticalChemists, Washington, DC (1970).

Several methods have been developed which reduce the time of incubation for the methyl
red and Voges-Proskauer tests. Beberapa metode telah dikembangkan yang mengurangi
waktu inkubasi untuk metil merah dan tes Voges-Proskauer. The Voges-Proskauer test
was reduced to only a 6 hour incubation by using a massive inoculum of bacteria in 2.0
ml of testmedium and standard test reagents. Uji Voges-Proskauer berkurang menjadi
hanya inkubasi 6 jam dengan menggunakan inokulum besar bakteri dalam 2,0 ml
testmedium dan reagen uji standar. See for example Coblentz. Lihat misalnya Coblentz.
LM, Am. LM, Am. J. Public Health 33, 815 (1943). J. Kesehatan Masyarakat 33, 815
(1943). The time of incubation required for both the methyl red and Voges-Proskauer
tests has been reduced to less than 18 hours by using small volumesof the test media.
Waktu inkubasi yang diperlukan untuk kedua merah metil dan tes Voges-Proskauer telah
diturunkan sampai kurang dari 18 jam dengan menggunakan volumesof kecil media uji.
See for example Benjaminson, MA, De Guzman, BC and Weil, AJ, J. Bacteriology 87,
234 (1944) and Barry, AK Bernshon, KL, Adams, AP, and Thrupp, LD, Applied
Microbiol. Lihat misalnya Benjaminson, MA, De Guzman, BC dan Weil, AJ, J.
Bakteriologi 87, 234 (1944) dan Barry, AK Bernshon, KL, Adams, AP, dan Thrupp, LD,
Terapan Microbiol. 20, 866 (1970). 20, 866 (1970). It has been proposed toperform the
citrate test using a test plate rather than the conventional agar slant. Telah diusulkan
toperform uji sitrat menggunakan plat uji daripada slant agar-agar konvensional. This
approach yields a positive test for Enterobacter within 24-48 hours. Pendekatan ini
menghasilkan hasil positif untuk Enterobacter dalam waktu 24-48 jam. See Difco
Manual, 9th Ed., Difco Laboratories, Detroit, Mich. (1953). Lihat Manual Difco, 9 Ed.,
Difco Laboratories, Detroit, Mich (1953). However, none ofthese methods have been
widely accepted or followed. Namun, tidak ada metode ofthese telah diterima secara luas
atau diikuti. Even if these methods are being followed, they do not provide a simplified
test method in which all of the IMViC test media are solid and thus capable of being in
one test plate as well as reducingthe time of incubation as is disclosed in the present
invention. Bahkan jika metode ini sedang diikuti, mereka tidak menyediakan metode
pengujian sederhana di mana semua media uji IMViC yang kuat dan dengan demikian
mampu berada di satu piring tes serta waktu inkubasi reducingthe seperti yang
diungkapkan dalam penemuan ini.
Another limitation of the prior art is the requirement of four separate tubes to complete
the IMViC tests using the conventional methods. Lain pembatasan seni sebelumnya
adalah persyaratan dari empat tabung terpisah untuk menyelesaikan tes IMViC
menggunakan metode konvensional. This means the laborious procedure of separately
handling, labeling, inoculating and incubating therequisite number of tubes. Ini berarti
prosedur melelahkan secara terpisah penanganan, pelabelan, inokulasi dan inkubasi
jumlah therequisite tabung. Four separate tubes were required by the prior art since a
combination of liquid and solid test media were used. Empat tabung terpisah yang
diperlukan oleh seni sebelumnya karena kombinasi media uji cair dan padat digunakan.
While the citrate test utilized a solid agar, the indole, methyl red and Voges-Proskauer
tests utilized liquidbroths. Sementara uji sitrat digunakan sebuah agar-agar solid, indol,
merah metil dan Voges-Proskauer tes digunakan liquidbroths. It has been reported that
the indole test could also be performed using a solid agar. Telah dilaporkan bahwa uji
indola juga bisa dilakukan menggunakan agar-agar padat. See Roche Diagnostics,
Improved Enterotube, Roche Diagnostics, division Hoffman-La Roche Inc., Nutley, New
Jersey (1974). Lihat Roche Diagnostics, Peningkatan Enterotube, Roche Diagnostics,
divisi Hoffman-La Roche Inc, Nutley, New Jersey (1974). No method has been proposed
whichwould allow the methyl red and Voges-Proskauer tests to be performed using solid
test media. Tidak ada metode telah diusulkan whichwould memungkinkan merah metil
dan tes Voges-Proskauer akan dilakukan menggunakan media uji padat. Thus, no method
has been proposed which would eliminate the necessity of using separate tubes for these
specific individual test procedures. Dengan demikian, metode belum ada usulan yang
akan menghilangkan perlunya menggunakan tabung terpisah untuk prosedur pemeriksaan
khusus individu.

In order to perform the IMViC tests a suitable culture of bacteria must first be obtained.
Dalam rangka untuk melaksanakan tes IMViC budaya yang cocok bakteri pertama harus
diperoleh. The isolation procedure generally followed by the prior art is as follows.
Prosedur isolasi umumnya diikuti oleh seni sebelumnya adalah sebagai berikut. LST
broth was inoculated with a sample of bacteria and incubated at 35° C. for 24 hours
allowing the bacteria to grow. kaldu LST diinokulasi dengan sampel bakteri dan
diinkubasi pada 35 ° C selama 24 jam memungkinkan bakteri untuk tumbuh. Next, EC
broth was inoculated with a sample of bacteria from the LST culture and incubated at
45.5° C. for 24 hours. Selanjutnya, EC kaldu diinokulasikan dengan sampel bakteri dari
budaya LST dan diinkubasi pada 45,5 ° C selama 24 jam. Then Levine EMB agar was
inoculated with a bacterial sample from the EC cultureand incubated at 35° C. for 24
hours. Kemudian agar-agar EMB Levine diinokulasikan dengan sampel bakteri dari EC
cultureand diinkubasi pada 35 ° C selama 24 jam. Difco Manual, supra, which contains a
description of the composition of the above broths and agars is incorporated herein by
reference. Difco Manual, supra, yang berisi deskripsi komposisi kaldu di atas dan agars
yang tergabung disini dengan referensi. An isolated colony was transferred to a nutrient
agar slant andincubated at 35° C. for 24 hours. Sebuah koloni terisolasi dipindahkan ke
nutrien agar miring andincubated pada 35 ° C selama 24 jam. This last step was required
to grow a large enough culture of bacteria to inoculate the four separate tubes required for
the IMViC tests as described above. Langkah terakhir ini diperlukan untuk
menumbuhkan budaya cukup besar bakteri untuk menyuntik empat tabung terpisah
dibutuhkan untuk menyelesaikan tes IMViC seperti dijelaskan di atas. Each tube, using
the conventional method, required aseparate inoculation thus a minimum of four
inoculums were required for the IMViC tests. Setiap tabung, dengan menggunakan
metode konvensional, diperlukan inokulasi aseparate sehingga minimal empat inokulum
yang diperlukan untuk tes IMViC. Therefore, a single colony of bacteria from the EMB
agar would not suffice. Oleh karena itu, koloni tunggal bakteri dari agar-agar EMB tidak
akan cukup.

US Pat. US Pat. No. 3,205,151 and Roche Diagnostics, supra, describe an inoculation
device and method for inoculating several compartments or tubes of test media utilizing
only a single inoculum. No 3205151 dan Roche Diagnostics, supra, menggambarkan
perangkat inokulasi dan metode untuk inokulasi beberapa kompartemen atau tabung
media tes hanya menggunakan inokulum tunggal. This consists of a series of tubes
containing thesolid test media in an end to end arrangement. Ini terdiri dari serangkaian
tes tabung berisi media thesolid pada akhirnya untuk mengakhiri pengaturan. An
inoculating needle extends through the center of tubes. Sebuah jarum inokulasi meluas
melalui pusat tabung. A single inoculum is picked up with needle and the needle is pulled
through all of the tubes inoculating each test media. Sebuah inokulum tunggal dijemput
dengan jarum dan jarum ditarik melalui semua tabung inokulasi setiap media tes. Since
only one colonyis required for the inoculation, this colony could be obtained from an
EMB culture without the need of growing the bacteria in a nutrient agar or broth. Karena
hanya satu colonyis diperlukan untuk inokulasi, koloni ini dapat diperoleh dari budaya
EMB tanpa perlu menumbuhkan bakteri dalam nutrien atau kaldu. However, these
references only disclose the use of a single inoculum, and do not disclose usingsolid
methyl red and Voges-Proskauer test medium. Namun, referensi hanya mengungkapkan
penggunaan inokulum tunggal, dan tidak mengungkapkan merah metil usingsolid dan
menengah Voges-Proskauer uji.

The IMViC test method of this invention yields at least equally reliable and precise
results as obtained with the cumbersome and laborious methods of the prior art. Uji
IMViC Metode ini menghasilkan penemuan pada hasil yang sama dapat diandalkan dan
tepat setidaknya sama diperoleh dengan metode rumit dan melelahkan seni sebelumnya.
For example, using the improved method of this invention E. coli type 1 yieldsthe same --
result as obtained with the prior art. Sebagai contoh, menggunakan metode peningkatan
penemuan jenis E. coli 1 yieldsthe sama - hasil sebagai yang diperoleh dengan seni
sebelumnya. In addition, the improved method is designed to be performed in a single
test plate containing compartmentalized, solid test media, thereby eliminating the need
for separate tubes of the media. Selain itu, metode peningkatan ini dirancang untuk
dilakukan di piring tes tunggal yang berisi terkotak, media uji padat, sehingga
menghilangkan kebutuhan untuk tabung terpisah dari media. Theimproved method is also
designed to require substantially less time by reducing the incubation time of the methyl
red and citrate tests and by reducing the time necessary to obtain a suitable bacterial
culture. Theimproved metode ini juga dirancang untuk membutuhkan waktu substansial
kurang dengan mengurangi waktu inkubasi merah metil dan tes sitrat dan dengan
mengurangi waktu yang diperlukan untuk mendapatkan kultur bakteri yang sesuai. Thus,
at least as equally reliable andprecise results are obtained within 48 hours using the
improved IMViC test method of this invention when compared to the methods of the
prior art. Dengan demikian, setidaknya sebagai hasil andprecise sama diandalkan
diperoleh dalam waktu 48 jam dengan menggunakan metode IMViC uji peningkatan
penemuan ini bila dibandingkan dengan metode seni sebelumnya. And in fact, the prior
art methods need more time to yield the results which are obtained within 48 hoursby this
invention. Dan pada kenyataannya, metode penemuan sebelumnya perlu lebih banyak
waktu untuk menghasilkan hasil yang diperoleh dalam waktu 48 hoursby penemuan ini.

SUMMARY OF THE INVENTION Ringkasan Penemuan

The disadvantages of the prior art are obviated by the present invention. Kelemahan dari
penemuan sebelumnya yang terhindarkan oleh penemuan ini. The invention has at least
the following advantages; the time required to identify E. coli is reduced by 72 hours
which is accomplished by reducing the steps of growingthe bacteria and reducing the
incubation time of the IMViC tests; it eliminates the handling, labeling, inoculating and
incubating of separate tubes for each test; all media are solid and in a single test plate and
thus can be inoculated with a singleinoculum from a single colony; all of the test reagents
are added to the single test plate which makes the reading of the results more convenient;
less space is required for incubating the plates, and by providing solid test media, it is
now possible tomass produce an IMViC test plate. Penemuan ini setidaknya memiliki
keuntungan sebagai berikut; waktu yang diperlukan untuk mengidentifikasi E. coli
berkurang sebesar 72 jam yang dilakukan dengan langkah-langkah mengurangi bakteri
growingthe dan mengurangi waktu inkubasi tes IMViC; menghilangkan menangani,
pelabelan, inokulasi dan menginkubasi tabung terpisah untuk setiap tes, semua media
yang kuat dan dalam piring tes tunggal dan dengan demikian dapat diinokulasi dengan
singleinoculum dari sebuah koloni tunggal; semua reagen uji ditambahkan ke plat uji
tunggal yang membuat pembacaan hasil yang lebih nyaman, sedikit ruang diperlukan
untuk inkubasi piring, dan dengan menyediakan media uji padat, sekarang tomass
mungkin menghasilkan pelat uji IMViC. The invention yields correct responses for all
bacteria examined after only a 48 hour incubation of the inoculated test media. Penemuan
ini menghasilkan respon yang benar untuk semua bakteri diperiksa setelah hanya
inkubasi 48 jam media uji diinokulasi.

The improved IMViC test method comprises growing the bacteria first in LST broth, then
in EC broth and finally on EMB agar, inoculating a test plate in which all of the test
media are solid and compartmentalized with a single inoculum, incubatingthe test plate
for 48 hours and determining the results of the tests. Metode IMViC uji ditingkatkan
terdiri menumbuhkan bakteri pertama dalam kaldu LST, kemudian dalam kaldu EC dan
akhirnya pada agar EMB, inokulasi piring tes di mana semua media uji solid dan terkotak
dengan inokulum tunggal, plat uji incubatingthe selama 48 jam dan menentukan hasil tes.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING URAIAN SINGKAT YANG

MENGAMBIL
FIG. Gambar. 1 is a comparison between the flow charts of the prior art or conventional
method and the improved method of this invention. 1 adalah perbandingan antara grafik
aliran seni sebelumnya atau metode konvensional dan metode peningkatan penemuan ini.

DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS URAIAN perwujudan disukai

(i) Agar Test Methods (I) Agar Metode Uji

All media were purchased from Difco Laboratories, Detroit, Mich. Difco Manual, supra,
which contains a description of their media and Association of Official Analytical
Chemists, supra, and Speck, ML, supra, both of which contain adescription of test media
and methods are incorporated herein by reference. Semua media yang dibeli dari Difco
Laboratories, Detroit, Mich Difco Manual, supra, yang berisi deskripsi media mereka dan
Asosiasi Kimiawan Resmi Analytical, supra, dan Speck, ML, supra, baik yang
mengandung adescription media uji dan metode digabungkan disini dengan referensi.

The test medium for the indole test consists of a modified tryptophane medium. Medium
uji untuk uji indola terdiri dari media tryptophane dimodifikasi. The modified medium
consists of 1.5% tryptone and 1% agar which is, therefore, solid instead of the
conventional liquid broth containing only 1% tryptone. Media dimodifikasi terdiri dari
1,5 Trypton% dan 1% agar-agar yang, karenanya, padat bukan kaldu cair konvensional
yang mengandung hanya 1 Trypton%. Thetryptone and 1% agar medium was dissolved
by steaming and sterilized at 121° C. for 15 minutes. Thetryptone dan media agar-agar
1% dibubarkan dengan dikukus dan disterilkan pada 121 ° C selama 15 menit. The
modified Kovacs reagent as described by Gadebusch, HH, Am. The Kovacs diubah
reagen seperti yang dijelaskan oleh Gadebusch, HH, Am. J. Clinical Pathol. J. Pathol
klinis. 26, 1373 (1956) was used for the detection of indole. 26, 1373 (1956) digunakan
untuk mendeteksi indola. Themodified Kovacs reagent consists of 5 g of
paradimethlaminobenzaldehyde, 25 ml of concentrated hydrochloric acid and 75 ml of
isoamyl alcohol. Themodified reagen Kovacs terdiri dari 5 g
paradimethlaminobenzaldehyde, 25 ml asam klorida pekat dan 75 ml alkohol isoamyl.
This reagent must be straw colored in order to function properly. Reagen ini harus jerami
berwarna untuk berfungsi dengan baik. To test for the production of indole, thebacterial
growth on the medium surface is flooded with 0.3 ml of the modified Kovacs reagent.
Untuk menguji untuk produksi indol, pertumbuhan thebacterial di permukaan media
adalah banjir dengan 0,3 ml pereaksi Kovacs dimodifikasi. If a red color results, indole is
present and the test is positive. Jika hasil warna merah, indol hadir dan tes positif.

The test medium for the methyl red and Voges-Proskauer tests consists of a modified un-
buffered glucose peptone medium. Media uji merah metil dan tes Voges-Proskauer terdiri
dari media glukosa diubah un-buffered pepton. The modified medium consists of
substituting sodium chloride (NaCl) for dipotassium phosphate as described by Smith,
NR,Gordon, RE, and Clark, FE, Agriculture Monograph No. 16, US Government
Printing Office, Washington, DC (1952) and Speck, ML, supra, and adding agar to 1%
concentration. Media dimodifikasi terdiri dari menggantikan natrium klorida (NaCl)
untuk fosfat dipotassium seperti yang dijelaskan oleh Smith, NR, Gordon, RE, dan Clark,
FE, Monografi Pertanian No 16, US Government Printing Office, Washington, DC
(1952) dan Speck, ML, supra, dan agar-agar menambah konsentrasi 1%. The composition
of the medium per liter of solution was 7 g ofproteose peptone, 5 g of glucose, 5 g of
NaCl and 10 g of agar. Komposisi media per liter larutan adalah 7 g pepton ofproteose, 5
g glukosa, NaCl 5 g dan 10 g agar. The medium was dissolved by steaming and sterilized
at 121° C. for 15 minutes. Medium dibubarkan dengan dikukus dan disterilkan pada 121
° C selama 15 menit. The pH of the medium was 6.3. PH medium adalah 6,3. The
addition of agar yields a solid medium as compared with theconventional liquid broth of
the prior art. Penambahan menghasilkan agar-agar sebuah medium padat dibandingkan
dengan kaldu cair theconventional seni sebelumnya.

The methyl red test was performed by adding 5 drops of methyl red indicator to the
bacterial growth on the medium surface. Uji metil merah dilakukan dengan
menambahkan 5 tetes indikator metil merah untuk pertumbuhan bakteri di permukaan
media. The methyl red indicator was prepared by dissolving 0.1 g of methyl red in 300 ml
of 95% ethyl alcohol and diluting to 500ml with distilled water. Indikator metil merah
dibuat dengan melarutkan 0,1 g merah metil dalam 300 ml etil alkohol 95% dan
pengenceran untuk 500ml dengan air suling. A resultant red color is indicative of an
acidic medium and represents the positive result. Warna merah yang dihasilkan
merupakan indikasi dari media asam dan merupakan hasil yang positif. The Voges-
Proskauer test was performed by flooding the bacterial growth on the medium surface
with 0.6 ml of naphthol reagent followedby 0.2 ml of creatine-potassium hydroxide
(KOH) reagent. Uji Voges-Proskauer dilakukan oleh banjir pertumbuhan bakteri pada
permukaan media dengan 0,6 ml pereaksi naphthol followedby 0,2 ml creatine-kalium
hidroksida (KOH) reagen. The naphthol reagent consists of 5% alpha-naphthol in
absolute ethyl alcohol. Reagen naphthol terdiri dari 5%-naphthol alpha etil alkohol
absolut. The creatine-KOH reagent consists of 0.3% creatine and 40% KOH. Reagen
creatine-KOH terdiri dari 0,3 creatine% dan 40% KOH. The development of a red color
indicates thepresence of acetyl-methyl-carbinol and is the positive result. Pengembangan
warna merah menunjukkan thepresence asetil carbinol--metil dan merupakan hasil yang
positif.

The citrate test medium consists of the Simmons citrate agar as described in Simmons,
JS, J. Infectious Disease, 39, 209 (1926). Medium uji sitrat terdiri dari agar-agar sitrat
Simmons seperti yang dijelaskan dalam Simmons, JS, J. Penyakit Infeksi, 39, 209 (1926).
It consists of 0.2 g of magnesium sulfate, 1 g of monoammonium phosphate, 1 g of
dipotassium phosphate, 2 g ofsodium citrate, 5 g of sodium chloride, 0.08 g of Brom
Thymol Blue and 15 g of agar per liter of solution. Ini terdiri dari 0,2 g magnesium sulfat,
1 g fosfat monoamonium, 1 g fosfat dipotassium, 2 sitrat ofsodium g, 5 g natrium klorida,
0,08 g Brom timol Biru dan 15 g agar-agar per liter larutan. The medium was dissolved
by steaming and sterilized at 121° C. for 15 minutes. Medium dibubarkan dengan
dikukus dan disterilkan pada 121 ° C selama 15 menit. A positive result is indicated by
bacterial growth on themedium surface and a change in color of the medium from green
to deep blue. Sebuah hasil positif yang ditunjukkan oleh pertumbuhan bakteri pada
permukaan themedium dan perubahan warna medium dari hijau ke dalam biru.

(ii) The Improved IMViC Test Method (Ii) Peningkatan IMViC Metode Uji

Bacteria may be obtained from any source, eg foods, clinical samples or laboratory
cultures. Bakteri dapat diperoleh dari sumber apapun, misalnya makanan, sampel
laboratorium klinis atau budaya. The bacterial samples may be isolated using
conventional methods. Sampel bakteri dapat diisolasi menggunakan metode
konvensional. See Speck, ML, supra, and Association of Official Analytical Chemists,
supra. Lihat Speck, ML, supra, dan Asosiasi Kimiawan Resmi Analytical, supra. The
preferred isolation method comprises: (a) inoculating a tube containing LST broth with a
sample of bacteria and incubating the inoculated LST broth at 35° C. for 24 hours to
allow the bacteria to grow; then, (b) inoculating a tube containingEC broth with a sample
of bacteria taken from the LST culture and incubating the inoculated EC broth at 45.5° C.
for 24 hours to allow the bacteria to grow; and finally, (c) inoculating a plate containing
Levine EMB agar with a sample of bacteriataken from the EC culture and incubating the
inoculated EMB agar at 35° C. for 24 hours to allow the bacteria to grow. Metode isolasi
disukai terdiri dari: (a) inokulasi sebuah tabung berisi kaldu LST dengan sampel bakteri
dan inkubasi kaldu LST diinokulasi pada 35 ° C selama 24 jam untuk memungkinkan
bakteri untuk tumbuh, kemudian, (b) inokulasi tabung containingEC kaldu dengan
sampel bakteri yang diambil dari budaya LST dan inkubasi kaldu EC diinokulasi pada
45,5 ° C selama 24 jam untuk memungkinkan bakteri untuk tumbuh, dan akhirnya, (c)
inokulasi piring berisi agar-agar EMB Levine dengan sampel bacteriataken dari budaya
EC dan inkubasi pada agar-agar EMB diinokulasi pada 35 ° C selama 24 jam untuk
memungkinkan bakteri untuk tumbuh. A single, well-isolated colony of bacteria from the
EMB agar is used to inoculate the IMViC test plate of the presentinvention. Sebuah
koloni, baik tunggal bakteri terisolasi dari EMB agar-agar digunakan untuk menyuntik
piring IMViC uji presentinvention tersebut.

The test plate is prepared by pouring 4 ml of each of the IMViC test media of the
invention into separate compartments of a "X"-compartmented petri dish, ie a petri dish
having four compartments, and allowing the media to solidify. Pelat uji dibuat dengan
menuangkan 4 ml dari masing-masing media uji IMViC penemuan ke kompartemen
terpisah dari "X" cawan petri-compartmented, yaitu cawan petri yang memiliki empat
kompartemen, dan memungkinkan media untuk memperkuat. All fourtest media are
inoculated simultaneously as follows. Semua media fourtest yang diinokulasi secara
bersamaan sebagai berikut. A single, well-isolated colony is picked from the EMB agar
with an inoculating needle in a conventional manner. Sebuah koloni, tunggal terisolasi
baik diambil dari agar-agar EMB dengan jarum inokulasi dengan cara konvensional. A
single streak is made on the surface of each of the test media in succession
withoutreturning to the original colony. Sebuah garis tunggal dibuat pada permukaan dari
masing-masing media tes dalam suksesi withoutreturning untuk koloni asli. The citrate
test medium is inoculated first to avoid the introduction of extraneous carbon or nitrogen
sources from the other test media. Medium uji sitrat disuntikkan pertama untuk
menghindari pengenalan karbon asing atau sumber nitrogen dari media uji lainnya. The
remaining test media may be inoculated in any order. Media uji yang tersisa mungkin
akan diinokulasi dalam urutan apapun. However, it is moreconvenient to inoculate the
indole test medium second and finally to inoculate the methyl red and Voges-Proskauer
test media. Namun, moreconvenient untuk menyuntik medium uji indola kedua dan
akhirnya untuk menyuntik merah metil dan media Voges-Proskauer uji. The inoculated
test plate is incubated at 35° C. for 48 hours. Pelat uji diinokulasi adalah diinkubasi pada
35 ° C selama 48 jam. At this time the results of the tests are determined asdescribed
above. Pada saat ini hasil tes ditentukan asdescribed di atas.

The present invention will be more fully described by reference to the following
examples which represent a comparison of the present invention with the conventional
IMViC test method. Penemuan ini akan lebih lengkap dijelaskan dengan mengacu pada
contoh berikut yang merupakan perbandingan dari penemuan ini dengan metode
pengujian IMViC konvensional. The following examples are not intended to limit
theinvention disclosed except to the extent that limitations appear in the appended claims.
Contoh-contoh berikut tidak dimaksudkan untuk membatasi theinvention diungkapkan
kecuali sejauh bahwa keterbatasan muncul dalam klaim-klaim ditambahkan.

EXAMPLES CONTOH

In the following examples all incubations were at 35° C. for the period of time indicated.
Dalam contoh berikut semua incubations berada di 35 ° C selama periode waktu yang
ditunjukkan. The same test reagents were used in the comparisons of the examples.
Reagen uji yang sama digunakan dalam perbandingan contoh. A indicates a positive
reaction and a - indicates a negative reaction. Menunjukkan reaksi positif dan -
menunjukkan reaksi negatif. Several 's indicate the degree of reaction noted with being
the strongest reaction. s Beberapa 'menunjukkan tingkat reaksi mencatat dengan menjadi
reaksi terkuat. A .- . A .-. indicates a reaction which was initially slightly pink, but
doubtful after 4 hours. menunjukkan reaksi yang awalnya sedikit merah muda, tetapi
diragukan setelah 4 jam.

EXAMPLE 1 CONTOH 1

This example compares indole test medium containing 1% tryptone and 1.5% tryptone
both also containing 1% agar, as described above for five cultures of E. coli. Contoh ini
membandingkan medium uji indol mengandung Trypton 1% dan 1,5% Trypton keduanya
juga mengandung agar-agar 1%, seperti dijelaskan di atas selama lima budaya E. coli.
The samples were compared after incubation times of 24, 48, 72 and 96 hours at35° C.
The results were determined as described above. Sampel dibandingkan setelah masa
inkubasi jam 24, 48, 72 dan 96 at35 ° C. Hasil ditentukan seperti dijelaskan di atas. Table
2 shows the results obtained in this comparison. Tabel 2 menunjukkan hasil yang
diperoleh dalam perbandingan ini.

Table 2
________________________________________________________________________
__ COMPARISON OF 1% TRYPTONE WITH 1.5% TRYPTONE FOR PRODUCTION
OF INDOLE BY ESCHERICHIA COLI INDOLE TEST MEDIUM CONTAINING 1%
AGAR AND 1% TRYPTONE 1.5% TRYPTONE 24 48 72 96 24 48 72 96 CULTURE
hhhhhhhh
________________________________________________________________________
__ E. coli (NARADCOM) E. coli B2C E. coli FDA 4 - E. coli FDA 5 - E. coli
ROCKEFELLER - -
________________________________________________________________________
__ Tabel 2
________________________________________________________________________
__ PERBANDINGAN 1% Trypton DENGAN 1,5% Trypton UNTUK PRODUKSI
DENGAN AGAR MAMPU MENSINTESIS COLI COLI MAMPU MENSINTESIS
TEST MEDIUM MENGANDUNG 1% DAN 1% Trypton 1,5% Trypton 24 48 72 96 24
48 72 96 BUDAYA hhhhhhhh
________________________________________________________________________
__ E. coli (NARADCOM) E. coli E. coli B2C FDA 4 - E. coli FDA 5 - E. coli
Rockefeller - -
________________________________________________________________________
__

Referring to Table 2, both media yielded identical results for all five varieties through 72
hours of incubation, but the medium containing 1.5% tryptone was more sensitive at 96
hours. Mengacu pada Tabel 2, kedua media memberikan hasil yang identik untuk semua
lima varietas melalui 72 jam inkubasi, tetapi medium yang mengandung 1,5 Trypton%
lebih sensitif pada 96 jam. Since the 1.5% tryptone medium was slightly more
sensitivethan the 1% tryptone medium when all conditions were constant, the 1.5%
tryptone medium was selected as the preferred medium as a precaution to insure against
inadvertent false results thereby obtaining the best results. Karena media Trypton 1,5%
adalah sensitivethan sedikit lebih media Trypton 1% ketika semua kondisi adalah
konstan, media Trypton 1,5% dipilih sebagai media pilihan sebagai pencegahan untuk
memastikan terhadap hasil palsu disengaja sehingga mendapatkan hasil terbaik. For this
reason, the 1.5%tryptone medium is preferred even though the 1% tryptone medium is
probably adequate. Untuk alasan ini, media Trypton 1,5% lebih disukai meskipun sedang
Trypton 1% mungkin cukup.

EXAMPLE 2 CONTOH 2

This example compares the modified unbuffered glucose peptone medium of the present
invention with the buffered glucose peptone medium (see, Difco Manual, supra) of the
prior art to which 1% agar has been added. Contoh ini membandingkan unbuffered
glukosa diubah medium pepton dari penemuan ini dengan media pepton glukosa buffered
(lihat, Difco Manual, supra) dari seni sebelum agar-agar 1% yang telah ditambahkan. The
results were determined asdescribed above for both the methyl red and Voges-Proskauer
tests after incubations at 35° C. for 24, 48, 72 and 96 hours. Hasil ditentukan asdescribed
di atas untuk kedua merah metil dan tes Voges-Proskauer setelah incubations pada 35 ° C
selama 24 jam, 48, 72 dan 96. Fifteen cultures of bacteria of the family
Enterobacteriaceae were used in this comparison. Lima belas budaya bakteri dari
keluarga Enterobacteriaceae digunakan dalam perbandingan ini. Table 3 illustrates
thecomparison of the two methods for the methyl red test and Table 4 shows the
comparison of the Voges-Proskauer test for both methods. Tabel 3 menggambarkan
thecomparison dari dua metode untuk uji metil merah dan Tabel 4 menunjukkan
perbandingan uji Voges-Proskauer untuk kedua metode.

Table 3
________________________________________________________________________
__ COMPARISON OF METHYL RED TEST FOR COLIFORMS USING MODIFIED
UNBUFFERED GLUCOSE PEPTONE MEDIUM AND BUFFERED GLUCOSE
PEPTONE MEDIUM PLUS 1% AGAR METHYL RED TEST Modified Unbuffered
Glucose Peptone Buffered Glucose Medium Peptone Medium Culture 24h 48h 72h 96h
24h 48h 72h 96h
________________________________________________________________________
__ E. coli FDA 1 - - - - E. coli FDA 2 - E. coli FDA 3 - - - E. coli FDA 4 - - E. coli FDA
5 - - - E. coli Rockefeller - - - E. coli ATCC 11840 - - - E. coli B2C - - - - E. coli
NARADCOM - - E. aerogenes 1 - - - - - - - - E. aerogenes 2 - - - - - - - Enterobacter 3 - - -
- - - - K. pneumoniae DMV 2 - - - - - - - K.pneumoniae DM591 - - - - - - - K. pneumoniae
DM602 - - - - - - - Uninoculated Medium - - - - - - - -
________________________________________________________________________
__ Tabel 3
________________________________________________________________________
__ PERBANDINGAN METIL MERAH UJI UNTUK MENGGUNAKAN
MODIFIKASI coliforms Unbuffered GLUKOSA Peptone MENENGAH DAN buffered
GLUKOSA Peptone MENENGAH PLUS 1% AGAR METIL MERAH TEST
Modifikasi Unbuffered Peptone Buffered Glukosa Glucose Sedang Sedang Peptone 48
jam Budaya 24h 72h 96h 24h 72h 96h 48 jam
________________________________________________________________________
__ E. coli FDA 1 - - - - E. coli FDA 2 - E. coli FDA 3 - - - E. coli FDA 4 - - E. coli FDA
5 - - - E. coli Rockefeller - - - E. coli ATCC 11840 - - - E. coli B2C - - - - E. coli
NARADCOM - - E. aerogenes 1 - - - - - - - - E. aerogenes 2 - - - - - - - Enterobacter 3 - - -
- - - - K. pneumoniae DMV 2 - - - - - - - K.pneumoniae DM591 - - - - - - - K. DM602
pneumoniae - - - - - - - Menengah diinokulasi - - - - - - - -
________________________________________________________________________
__

Table 4
________________________________________________________________________
__ COMPARISON OF VOGES-PROSKAUER TEST FOR COLIFORMS USING
MODIFIED UN-BUFFERED BLUCOSE PEPTONE MEDIUM AND BUFFERED
GLUCOSE PEPTONE MEDIUM PLUS 1% AGAR VOGES-PROSKAUER TEST
Modified Un-Buffered Glucose Peptone Buffered Glucose- Medium Peptone Medium
Culture 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h
________________________________________________________________________
__ E. coli FDA 1 - - - - .- . Tabel 4
________________________________________________________________________
__ PERBANDINGAN TEST Voges-Proskauer UNTUK MENGGUNAKAN
MODIFIKASI coliforms BLUCOSE PBB-buffered MENENGAH Peptone DAN
MENENGAH GLUKOSA Peptone buffered PLUS 1% AGAR Voges-Proskauer TEST
Peptone Glukosa Modifikasi Un-Buffered Buffered Budaya Glukosa-Menengah
Menengah Peptone 48 jam 72h 96h 24h 24h 48 jam 72h 96h
________________________________________________________________________
__ E. coli FDA 1 - - - - .-. .- ..- . .- ..-. .- . .-. E. coli FDA 2 - - - - .- . E. coli FDA 2 - - -
- .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E. coli FDA 3 - - - - .- . E. coli FDA 3 - - - - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E.
coli FDA 4 - - - - .- . E. coli FDA 4 - - - - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E. coli FDA 5 - - - - .- . E.
coli FDA 5 - - - - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E. coli Rockefeller - - - - .- . E. coli Rockefeller - -
- - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E. coli 11840 -- - - .- . E. coli 11.840 - - - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E.
coli B2C - - - - .- . E. coli B2C - - - - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E. coli NARADCOM - - - - .- .
E. coli NARADCOM - - - - .-. .- . .-. .- . .-. .- . .-. E. aerogenes 1 E. aerogenes 2
Enterobacter 3 K. pneumoniae DMV2 .- . E. aerogenes 1 aerogenes E. 2 Enterobacter 3
K. pneumoniae DMV2 .-. - - - K. pneumoniae DM591 - - K. pneumoniae DM602 - - -
Uninoculated Medium No Reaction No Reaction
________________________________________________________________________
__ - - - K. pneumoniae DM591 - - K. DM602 pneumoniae - - - diinokulasi Menengah No
Reaksi No Reaksi
________________________________________________________________________
__

Tables 3 and 4 show that the buffered glucose medium with added agar was unsuitable
for both the methyl red and Voges-Proskauer tests whereas the modified un-buffered
glucose peptone medium of the present invention was suitable. Tabel 3 dan 4
menunjukkan bahwa media glukosa buffer dengan agar-agar ditambahkan tidak cocok
untuk kedua merah metil dan tes Voges-Proskauer sedangkan menengah un-buffered
pepton glukosa diubah dari penemuan ini cocok. Table 3 showsthat 48 hours were
required to give typical methyl red responses for all bacteria tested. Tabel 3 showsthat 48
jam diminta untuk memberikan tanggapan khas metil merah untuk semua bakteri uji. At
24 hours, five species of Enterobacter and Klebsiella gave false positive methyl red test
results which were correct at 48 hours. Pada 24 jam, lima spesies Enterobacter dan
Klebsiella memberikan hasil positif palsu tes metil merah yang benar pada 48 jam. Table
4 shows that properresponses for the Voges-Proskauer test was obtained after 24 hours of
incubation and was correct through 72 hours for all of the bacteria examined. Tabel 4
menunjukkan bahwa properresponses untuk uji Voges-Proskauer diperoleh setelah 24
jam inkubasi dan benar melalui 72 jam untuk semua bakteri diperiksa.

EXAMPLE 3 CONTOH 3

In comparing the improved IMViC test method of this invention to the method of the
prior art, conventional procedures and media were used as described by Speck, ML supra,
and Association of Analytical Chemists, supra. Dalam membandingkan metode IMViC
uji peningkatan penemuan ini dengan metode seni sebelumnya, prosedur konvensional
dan media yang digunakan seperti yang dijelaskan oleh Speck, supra ML, dan Asosiasi
Analytical Kimiawan, supra. The conventional testsusing liquid media for the indole,
methyl red and Voges-Proskauer tests and an agar slant for the citrate test were
performed in parallel with the present invention and all test reagents were the same for
both methods. Media konvensional cair testsusing untuk indol, merah metil dan tes
Voges-Proskauer dan miring agar untuk uji sitrat dilakukan secara paralel dengan
penemuan ini dan semua reagen uji yang sama untuk kedua metode. However, each
conventional tubedmedium was inoculated with a separate inoculum. Namun, setiap
tubedmedium konvensional diinokulasikan dengan inokulum terpisah. All incubations
were at 35° C. for 24 and 48 hours, and longer if required by the conventional method.
Semua incubations berada di 35 ° C selama 24 dan 48 jam, dan lebih lama jika diperlukan
dengan metode konvensional. All results were determined as described above. Semua
hasil ditentukan seperti dijelaskan di atas. Eighty-seven cultures of bacteria of thefamily
Enterobacteriaceae were used in this comparison and the results are shown in Table 5.
Delapan puluh tujuh budaya bakteri Enterobacteriaceae thefamily digunakan dalam
perbandingan ini dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 5.

Table 5
________________________________________________________________________
__ IMViC REACTIONS OF ENTEROBACTERIACAE USING THE IMPROVED
IMViC METHOD AND THE CONVENTIONAL METHOD Number of Strains Giving
Typical Reactions No. TypicalConven- of (correct) Improved tional Strains IMViC
Method Method a Tested Reactions 24h 48h 24h 48h
________________________________________________________________________
__ E. coli type 1 24 -- 24 24 22 b 24 E. coli type 2 4 - --4 4 4 4 Enterobacter sp. Tabel 5
________________________________________________________________________
__ IMViC REAKSI DARI ENTEROBACTERIACAE MENGGUNAKAN METODE
PENINGKATAN IMViC DAN METODE KONVENSIONAL Jumlah Strain
Memberikan Reaksi khas No TypicalConven-of (benar) Strain IMViC Metode Metode
yang
Diuji Peningkatan Reaksi internasional 24h 24h 48 jam 48 jam
________________________________________________________________________
__ E. coli tipe 1 24 - 24 24 22 b 24 E. coli tipe 2 4 - - 4 4 4 4 Enterobacter sp. 12 - - 3 c 12
4 c 8 c ,d E. agglomerans (14/73) 1 - - 1 1 1 1 K. pneumoniae (indole -) 9 -- 1 c 9 3 c 6 c ,d
K. pneumoniae (indole ) 4 - 2 c 4 c 3 d K. 12 - - 3 c 12 4 c 8 c, d E. agglomerans (14/73) 1 -
- 1 1 1 1 K. pneumoniae (indol -) 9 - 1 c 9 3 c 6 c, d K. pneumoniae ( indol) 4 - 2 c 4 c 3 d
K. ozaenae 2 - -- 2 2 2 2 K. rhinoscleromatis 2 - - - 2 2 2 2 C. freundii 3 - - 3 3 2 b 3 C.
diversum 1 - 0 1 0 1 Salmonella sp. ozaenae 2 - - 2 2 2 2 K. rhinoscleromatis 2 - - - 2 2 2
2 C. freundii 3 - - 3 3 2 b 3 C. diversum 1 - 0 1 0 1 Salmonella sp. 23 - - 23 23 21 e 21 e
Proteus sp. 23 - - 23 23 21 e 21 e Proteus sp. 2 -- 2 2 1 b 1 b
________________________________________________________________________
__ a All media were liquid except Simmons Citrate agar slant. b Remainder of cultures
gave false negative MR tests in MRVP broth. c Remainder of cultures gave falsepositive
MR tests. d One culture gave a false negative citrate test in 48 h but was positive after 96
h. e Two cultures gave equivocal MR reactions (orange). 02-2 Januari b 1 b
________________________________________________________________________
__ suatu Semua media yang cair kecuali Simmons. Slant agar-agar Sitrat 2 b Tersisa budaya
memberikan negatif tes MR palsu dalam kaldu MRVP palsu. C Tersisa budaya MR
falsepositive memberikan tes negatif. D Satu budaya memberikan sitrat tes dalam 48 jam
tetapi positif setelah 96 h. e Dua budaya memberikan reaksi MR samar-samar (oranye).
The typical IMViC reactions shown are for the indole, methyl red, Voges-Proskauer and
citrate tests respectively. The IMViC khas reaksi yang ditampilkan adalah untuk indol,
merah metil, Voges-Proskauer dan tes sitrat masing-masing. Klebsiella pneumoniae
indicated as indole in Table 5 represents K. pneumoniae Types I and II, whereas K.
pneumoniae indicated asindole - represents K. pneumoniae Type III. Klebsiella
pneumoniae diindikasikan sebagai indol pada Tabel 5 merupakan K. pneumoniae Tipe I
dan II, sedangkan K. pneumoniae menunjukkan asindole - merupakan K. pneumoniae
Tipe III. Table 5 shows that the bacterial strains of the Enterobacter species and
Klebsiella pneumonia yielded slightly better IMViC responses at 24 hours using the
conventional method whereas the remaining strains ofbacteria yielded slightly better
results at 24 hours using the improved method of this invention. Tabel 5 menunjukkan
bahwa strain bakteri dari spesies Enterobacter dan Klebsiella pneumonia yang dihasilkan
sedikit lebih baik tanggapan IMViC 24 jam dengan menggunakan metode konvensional
sedangkan sisanya ofbacteria strain menghasilkan hasil yang sedikit lebih baik di 24 jam
dengan menggunakan metode peningkatan penemuan ini. However, the improved method
yielded typical IMViC responses at 48 hours for all bacterial strains examined whereas
the conventional method sometimesrequired an incubation of 96 hours to give all of the
correct responses. Namun, metode peningkatan menuai tanggapan yang khas IMViC
pada 48 jam untuk semua jenis bakteri diperiksa sedangkan metode konvensional
sometimesrequired sebuah inkubasi 96 jam untuk memberikan semua jawaban yang
benar. The conventional method required additional incubation because of delayed
methyl red and citrate reactions. Metode konvensional yang diperlukan inkubasi
tambahan karena reaksi metil tertunda merah dan sitrat. It was also noted that less time
was required for the individualreactions to occur once the test reagents were added to the
IMViC test plate of this invention as compared with the conventional liquid medium. Hal
ini juga mencatat bahwa lebih sedikit waktu yang dibutuhkan untuk individualreactions
terjadi setelah reagen uji ditambahkan ke piring uji IMViC penemuan ini dibandingkan
dengan media cair konvensional.

CONCLUDING REMARKS PENUTUP

The more rapid methyl red and citrate tests of the present invention are attributed to a
larger surface area of the test medium which is exposed to atmospheric oxygen thus
resulting in faster growth of the bacterial culture. Merah metil lebih cepat dan uji sitrat
dari penemuan ini yang dikaitkan dengan luas permukaan yang lebih besar dari medium
uji yang terkena oksigen atmosfer sehingga menghasilkan pertumbuhan yang lebih cepat
dari kultur bakteri. This has also beenindicated by Barry, AL, et al, supra, and Difco
Manual, supra, for the methyl red and citrate tests respectively. Ini juga beenindicated
oleh Barry, AL, et al, supra, dan Difco Manual, supra, untuk metil merah dan tes sitrat
masing-masing. Since the methyl red and citrate tests of this invention give correct results
after 48 hours of incubation, the improved IMViC testmethod of this invention requires
48 hours less time for incubation than that required by the prior art. Karena merah metil
dan tes sitrat penemuan ini memberikan hasil yang benar setelah 48 jam inkubasi, IMViC
meningkatkan testmethod penemuan ini membutuhkan waktu 48 jam kurang untuk
inkubasi dari yang dibutuhkan oleh seni sebelumnya.
In the conventional method an additional step was required in the isolation of bacteria
from sources other than pure cultures. Dalam metode konvensional langkah tambahan
yang diperlukan dalam isolasi bakteri dari sumber selain kultur murni. This step was a 24
hour incubation of a single colony of bacteria from the EMB agar in a nutrient broth.
Langkah ini adalah 24 jam inkubasi koloni tunggal bakteri dari agar-agar EMB dalam
kaldu nutrisi. This wasnecessary to provide enough bacteria of a single colony to
inoculate the four separate tubes required for the conventional IMViC method.
wasnecessary ini untuk memberikan bakteri cukup dari koloni tunggal untuk menyuntik
empat tabung terpisah diperlukan untuk metode IMViC konvensional. Thus, since only a
single inoculum is required to inoculate the test plate of the present invention, an
additional24 hours can be saved in the overall process by eliminating the nutrient broth
culturing step. Jadi, karena hanya inokulum tunggal diperlukan untuk menyuntik pelat uji
dari penemuan ini, sebuah additional24 jam dapat disimpan dalam proses keseluruhan
dengan menghilangkan kaldu nutrisi kultur langkah. Therefore, a total savings of 72
hours can be achieved by using the method of this invention. Oleh karena itu, total
tabungan 72 jam dapat dicapai dengan menggunakan metode penemuan ini. FIG.
Gambar. 1 shows the flow charts for the isolation andidentification of the bacteria using
the conventional method and the method of this invention. 1 menunjukkan diagram alir
bagi andidentification isolasi bakteri menggunakan metode konvensional dan metode
penemuan ini. It illustrates the 72 hour time savings which can be accomplished by using
this invention. Ini menggambarkan penghematan waktu 72 jam yang dapat dicapai
dengan menggunakan penemuan ini. Moreover, the improved IMViC test method as
herein disclosed andclaimed simplifies the laboratory procedure by eliminating the
handling and inoculating of separate tubes, by requiring only a single inoculum to
inoculate all four test media, and by being able to add all of the reagents to a single plate
and readingthe results of the reactions thereon. Selain itu, peningkatan IMViC uji sebagai
diungkapkan di sini andclaimed menyederhanakan prosedur laboratorium dengan
menghilangkan penanganan dan inokulasi tabung terpisah, dengan hanya membutuhkan
inokulum tunggal untuk menyuntik semua empat media uji, dan mampu menambah
semua reagen ke plat tunggal dan hasil readingthe dari reaksi atasnya. Furthermore, the
present invention yields typical reaction responses for all bacteria examined after only a
48 hour incubation of the IMViC test plate. Selanjutnya, tanggapan reaksi hasil
penemuan ini khas untuk semua bakteri diperiksa setelah hanya inkubasi 48 jam pelat uji
IMViC.

An additional advantage of the present invention is that it enables the mass production of
a pre-measured test plate. Keuntungan tambahan dari penemuan ini adalah bahwa hal itu
memungkinkan produksi massal piring pre test-diukur. Since all of the IMViC test media
are solid as herein disclosed, it is now possible to prepare a test plate containing apre-
measured amount of the test media by mass production on a quality control basis. Karena
semua media uji IMViC yang solid sebagai diungkapkan di sini, sekarang mungkin untuk
mempersiapkan tes piring berisi jumlah apre-diukur dari media uji oleh produksi massal
secara kontrol kualitas. A pre-measured test plate is advantageous in that it eliminates the
time and avoids the messiness associated with preparing and pouring solutions of the test
media intoa test plate before using the improved IMViC test method herein disclosed and
thereby makes the procedure less laborious. Sebuah piring pre test-diukur adalah
menguntungkan dalam hal itu menghilangkan waktu dan menghindari kekacauan yang
terkait dengan penyusunan dan penuangan solusi dari pelat media uji intoa test sebelum
menggunakan metode IMViC uji ditingkatkan sini diungkapkan dan dengan demikian
membuat prosedur yang kurang sulit.

IMViC Test

The IMViC tests are useful for differentiating the Enterobacteriaceae, especially when
used alongside the urease test. Tes IMViC berguna untuk membedakan
Enterobacteriaceae, terutama bila digunakan bersama tes urease. When used alone, the
IMViC tests are particularly useful for differentiating Escherichia coli , Enterobacter
aerogenes , Enterobacter cloacae , and Klebsiella pneumoniae (although colonial
morphology and the presence of capsules can also be used to differentiate Klebsiella ).
Ketika digunakan saja, tes IMViC sangat berguna untuk membedakan Escherichia coli,
Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, dan Klebsiella pneumoniae (meskipun
morfologi kolonial dan keberadaan kapsul juga dapat digunakan untuk membedakan
Klebsiella).

The IMViC series includes four tests: Seri IMViC meliputi empat tes:

Indole production (for which we use SIM medium) Indol produksi

(untuk yang kita gunakan media SIM)

the methyl red test uji merah metil

the Voges-Proskauer test the-Proskauer tes Voges

and citrate production dan sitrat produksi

Except for the lowercase "i", which is added for ease of pronunciation, each of the letters
in "IMViC" stands for one of these tests. Kecuali untuk huruf kecil "i", yang ditambahkan
untuk kemudahan pengucapan, masing-masing huruf dalam "IMViC" singkatan untuk
salah satu tes. "I" is for indole; "M" is for methyl red; "V" is for Voges-Proskauer, and
"C" is for citrate. "Aku" adalah untuk indol; "M" adalah untuk merah metil; "V" adalah
untuk Voges-Proskauer, dan "C" adalah untuk sitrat.
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PRAKTIKUM I
A. JUDUL
Sterilisasi dengan Pembakaran
B. TUJUAN
Setelah mempelajari laporan ini mahasiswa dapat mengetahui cara sterilisasi berbagai
alat dengan pembakaran.
C. DASAR TEORI
Pemijaran langsung digunakan untuk mensterilkan spatula logam, batang gelas, filter
logam bekerfield dan filter bakteri lainnya. Mulut botol, vial, dan labu ukur, gunting,
jarum logam dan kawat, dan alat-alat lain yang tidak hancur dengan pemijaran langsung.
Papan salep, lumping dan alu dapat disterilisasi dengan metode ini. Dalam semua kasus
bagian yang paling kuat 20 detik. Dalam keadaan darurat ampul dapat disterilisasi dengan
memposisikan bagian leher ampul kearah bawah lubang kawat keranjang dan dipijarkan
langsung dengan api dengan hati-hati. Setelah pendinginan, ampul harus segera diisi dan
disegel.

D. ALAT DAN BAHAN

1. Jarum ose
2. Tabung reaksi
3. Lampu Bunsen
4. Korek api
5. Media padat dalam cawan Petri

E. LANGKAH KERJA
1. Menyalakan lampu Bunsen dan mengatur nyala apinya secara maksimal.
2. Untuk sterilisasi jarum ose. Mengambil jarum ose kemudian melakukan pembakaran
dengan api Bunsen mulai dari bagian pangkal kawat ose secara perlahan menuju ke ujung
kawat jarum ose. Pembakaran jarum ose dilakukan sampai kawatnya merah membara.
Jarum ose yang dibakar dibiarkan dingin, selanjutnya siap digunakan untuk mengambil/
menginokulasi mikrobia.
3. Untuk sterilisasi mulut tabung reaksi. Membuka sumbat kapas kemudian melewatkan
mulut tabung pada api. Hal ini dilakukan sebelum dan setelah mengambil/menginokulasi
biakan. Menutup kembali mulut tabung dengan kapas.
4. Untuk sterilisasi cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk diinokulasi maupun
cawan petri ditutup setelah diinokulasi, tepi cawan dilewatkan di api Bunsen.

F. HASIL PENGAMATAN
Alat yang digunakan telah disterilkan terlebih dahulu. Pada saat penggunaan alat ini
sudah dalam keadaan steril.
G. PEMBAHASAN
Sterilisasi dan penyiapan media adalah salah satu proses yang sangat penting dalam
penelitian tentang mikroorganisme. Sebab kedua factor ini adalah kunci utama
kesuksesan dalam tahap pengamatan. Kita ketahui bahwa dialam semesta ini banyak
sekali bertebaran mikroorganisme, mereka hampir terdapat disemua tempat. Tidak heran
jika kita bisa terkontaminasi dimana saja, meskipun kita menganggap tempat tersebut
sudah steril.
Dalam proses praktikum sebelum kita menuju kepersiapan media, maka yang harus kita
lakukan lebih dahulu adalah sterilisasi. Sterilisasi ini berlaku dimana saja terutama yang
berkaitan dengan kesehatan dan mikroorganisme. Dalam pelaksanaan operasi dalam
dunia kedokteran, semua alat yang akan digunakan disterilisasi terlebih dahulu. Tujuanya
agar alat-alat tersebut benar-benar steril dan bersih dari mikroorganisme yang
membahayakan, terutama bagi pasien yang akan dioperasi.
Sterilisasi yang kita lakukan dalam pengamatan ini ditujukan agar alat-alat tersebut steril
dari mikroorganisme lain yang akan menjadi kontaminan bagi mikroba yang akan kita
tumbuhkan. Sterilisasi yang kita lakukan adalah sterilisasi dengan pembakaran. Sterilisasi
ini selain bertujuan untuk menjaga mutu kebersihan dan pengamatan dilaboratorium juga
bertujuan untuk menjaga agar mikroba yang akan kita amati adalah benar-benar mikroba
yang kita inginkan.
Masalah yang sering kita hadapi dalam laboratorium adalah tingkat kesterilan alat-alat
yang akan digunakan, bahkan yang lebih parah lagi adalah alat yang akan digunakan
untuk mensterilkan benda-benda tersebut juga malah tidak berfungsi dengan baik.
Sehingga dalam hal ini akan memacu tingkat kegagalan dalam pengamatan.
Seperti yang telah dikemukakan diatas tadi bahwa sterilisasi yang dipakai pada praktikum
ini adalah sterilisasi dengan pembakaran dengan tujuan mengetahui cara sterilisasi
berbagai alat dengan pembakaran. Pada praktikum ini terlebih dahulu yang di lakukan
adalah menyalakan lampu Bunsen dan mengatur nyala api secara maksimal. Kemudian
setelah itu, ambil jarum ose yang telah tersediah kemudian lakukan pembakaran dengan
api Bunsen mulai dari bagian pangkal kawat ose secara parlahan menuju ke ujung kawat
jarum ose. Pembakaran ini dilakukan sampai jarum osenya merah membara. Setelah itu
dinginkan jarum ose, selanjutnya jarum ose siap di gunakan untuk mengambil /
menginokulasi bakteri. Tujuan untuk mendinginkan jarum ose yaitu agar mikroba yang
kita ambil tidak mati dengan jarum ose yang panas. Sehingga itu di perlukan jarum ose
yang sudah dingin. Kemudian untuk mensterilisasi mulut tabung reaksi, buka sumbat
kapas kemudian lewatkan mulut tabung pada api. Hal ini dilakukan sebelum dan setelah
mengambil / menginokulasikan biakan. Kemudian tutup kembali mulut tabung dengan
kapas. Kemudian untuk sterilisasi cawan petrik, sebelum cawan Petri dibuka untuk
diinokulasi maupun cawan petrin ditutup setelah inokulasi, tepi cawan dilewatkan di api
bunsen. Keberhasilan dalam pengamatan mikroba ini sangat bergantung pada bagaimana
kita mensterilakan alat, dan bagaimana komposisi media yang kita buat. Sebab komposisi
media juga menentukan tingkat keberhasilan mikroba tersebut tumbuh dalam media.
Sehingga kedua hal ini harus benar-benar diperhatikan ketika kita akan membiakkan
mikroba didalam laboratorium, sebab jika terkontaminasi sedikit saja, maka
kemungkinan gagal akan angat besar.
Tehnik pembakaran langsung merupakan tehnik sterilisasi yang tercepat dan 100 %
efektif. Kelemahan tehnik ini terbatas penggunaannya. Caranya adalah dengan membakar
peralatan sampai pijar. Proses ini di laboratorium untuk mensterilkan alat penamaan
bakteri ( ose, tugal ), mulut tabung reaksi sewaktu membuat kultur, dan lain-lain.
Prosedur ini sangat efektif membunuh bentuk spora maupun toksin yang dihasilkan oleh
bakteri.
Peralatan laboratorium yang dapat disterilkan dengan cara pembakaran langsung hanya
alat-alat yang terbuat dari logam dan kaca. Pembakaran langsung dapat juga dilakukan
terhadap bangakai binatang percobaan yang telah mati. Tehnik ini ini dapat digunakan
untuk mensterilkan bahan-bahan terbuat dari karet, plastik, kertas, dan media
mikrobiologis.
H. KESIMPULAN
Metode sterilisasi yaitu :
Pemanasan kering
Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai
kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan
mikrobanya mati.
- Pemijaran langsung
Digunakan untuk sterilisasi alat logam, bahan yang terbuat dari porselen, tidak cocok
untuk alat yang berlekuk karena pemanasannya tidak rata. Suhu yang digunakan 500-
600oC dalam waktu beberapa detik, untuk alat logam sampai berpijar.
I. JAWABAN PERTANYAAN
1. Mengapa semua alat di atas harus dilewatkan pada api Bunsen?
Jawaban :
sterilisasi dalam mikrobiologi merupakan pembebasan tiap benda atau substansi dari
semua kehidupan dalam bentuk apapun.
Semua alat yang digunakan pada saat akan melakukan sterilisasi harus dilewatkan pada
api bunsen, agar alat yang akan dipakai dalam keadaan steril. Prosedur ini sangat efektif
membunuh bentuk spora maupun toksin yang dihasilkan oleh bakteri.

J. DAFTAR PUSTAKA
Lay. B. W. 1994. Analisis Mikrobiologi da Laboraorium. Raja Grafindo Persada. Jakarta
Muhiddin, 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Biologi FMIPA
Universitas Haluoleo. Kendari
Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta
Waluyo. 2005. Mikrobiologi Umum. UMPress. Malang
Wesley & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar jilid I. Erlangga. Jakarta
Diposkan oleh warna di 01:54
PRAKTIKUM II
A. JUDUL
STERILISASI DENGAN PANAS KERING ( OVEN )
B. TUJUAN
Setelah mahasiswa mempelajari laporan ini mahasiswa dapat mengetahui berbagai cara
sterilisasi berbagai alat dengan panas kering.
C. DASAR TEORI
Sterilisasi panas kering
Prinsip kerja.
Prinsip membunuh kuman dengan panas kering adalah menyebabkan denaturasi protein
dan efek toksik akibat kenaikan kadar elektrolit. Cara kerja dari panas tersebut adalah
bahwa panas akan membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim-
enzim dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi-oksidasi
komponen sel.cara yang dapat dilakukan adalah dengan pembakan dengan oksidasi. Cara
ini dapat dipakai bila selama strerilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat
temperature tinggi atau tekanan tinggi. Cara membunuh mikroba ini dengan memakai
panas (thermal kill ) daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah . bila biakan
mikroba dimasukkan dalam air mendidih akan cepat mati dibandingkan dengan dipanasi
secara kering.
Sterilisasi dengan panas kering kurang efisien dari sterilisasi panas basah dan
membutuhkan waktu lama dan suhu yang lebih tinggi tertentu. Waktu dan suhu tersebut
harus ditentukan untuk tiap jenis bahan yang disterilkan itu. Faktor keamanan biasanya
ditambahkan untuk memungkinkan untuk variabel-variabel yang mempengaruhi efisiensi
metode sterilisasi. Kelembaban lingkungan sterilisasi serta kelembaban organisme
sebelum panas tampaknya mempengaruhi efisiensi sterilisasi panas kering. Suhu tinggi
dan waktu yang lebih singkat dapat digunakan untuk bahan tahan panas beban.
Bahan yang karena karakteristik fisikanya tidak dapat disterilisasi dengan uap destilasi
dalam udara panas-oven. Yang termasuk dalam bahan ini adalah minyak lemak, paraffin,
petrolatum cair, gliserin, propilen glikol. Serbuk steril seperti talk, kaolin dan ZnO, dan
beberapa obat yang lain.
Sebagai tambahan sterilisasi panas kering adalah metode yang paling efektif untuk alat-
alat gelas dan banyak alat-alat bedah.
Ini harus ditekankan bahwa minyak lemak, petrolatum, serbuk kering dan bahan yang
sama tidak dapat disterilisasi dalam autoklaf. Salah satu elemen penting dalam sterilisasi
dengan menggunakan uap autoklaf. Atau dengan adanya lembab dan penembusannya ke
dalam bahan yang telah disterilkan. Sebagai contoh, organisme pembentuk spora dalam
medium anhidrat tidak dibunuh oleh suhu sampai 121o C (suhu yang biasanya digunakan
dalam autoklaf bahkan setelah pemanasan sampai 45 menit). Untik alasan ini, autoklaf
merupakan metode yang tidak cocok untuk mensterilkan minyak, produk yang dibuat
dengan basis minyak, atau bahan-bahan lain yang mempunyai sedikit lembab atau tidak
sama sekali.
D. ALAT DAN BAHAN
1. Cawan petri
2. Tabung reaksi
3. Pipet ukur
4. Kapas
5. Kertas bungkus
6. Benang
7. Oven
E. LANGKAH KERJA
1. Menangkupkan cawan petri bagian bawah dan tutupnya, kemudian dibungkus dengan
kertas dan disusun cawan petri ( 5-10 ) buah dan diikat dengan benang.
2. Menganbil tabung reaksi yang masing-masing ditutup dengan kapas , beberapa tabung
( 5-10 tabung ) diikat jadi satu dan dibungkus kertas kemudian diikat kembali.
3. Pipet ukur ujung atas di beri sedikit sumbat kapas ( agak longgar ) kemudian
dibungkus dengan kertas dan diikat.
4. Semua alat tersebut masukkan ke dalam oven.
5. Menyalakan oven pada suhu 175 ˚C. Dilakukan selama 24 jam.
6. Setelah selesai pemanasan, semua peralatan didinginkan dan pada hari berikutnya dan
pada hari berikutnya siap dipakai.
7.
F. HASIL PENGAMATAN
Alat-alat yang telah digunakan telah disterilkan lebi dahulu. Sehingga alat sudah siap
untuk dipakai
G. PEMBAHASAN
Pemanasan Kering
Udara Panas Oven
Bahan yang karena karakteristik fisikanya tidak dapat disterilisasi dengan uap destilasi
dalam udara panas-oven. Yang termasuk dalam bahan ini adalah minyak lemak, paraffin,
petrolatum cair, gliserin, propilen glikol. Serbuk steril seperti talk, kaolin dan ZnO, dan
beberapa obat yang lain. Sebagai tambahan sterilisasi panas kering adalah metode yang
paling efektif untuk alat-alat gelas dan banyak alat-alat bedah.
Ini harus ditekankan bahwa minyak lemak, petrolatum, serbuk kering dan bahan yang
sama tidak dapat disterilisasi dalam autoklaf. Salah satu elemen penting dalam sterilisasi
dengan menggunakan uap autoklaf. Atau dengan adanya lembab dan penembusannya ke
dalam bahan yang telah disterilkan. Sebagai contoh, organisme pembentuk spora dalam
medium anhidrat tidak dibunuh oleh suhu sampai 121o C (suhu yang biasanya digunakan
dalam autoklaf bahkan setelah pemanasan sampai 45 menit). Untik alasan ini, autoklaf
merupakan metode yang tidak cocok untuk mensterilkan minyak, produk yang dibuat
dengan basis minyak, atau bahan-bahan lain yang mempunyai sedikit lembab atau tidak
sama sekali.
Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan
dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan
sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang
dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan. Saat sterilisasi di bawah
uap panas dipaparkan pada suhu 121°C selama 12 menit adalah efektif. Sterilisasi panas
kering membutuhkan pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam.
Suhu yang biasa digunakan pada sterilisasi panas kering 160°C paling cepat 1 jam, tapi
lebih baik 2 jam. Suhu ini digunakan secara khusus untuk sterilisasi minyak lemak atau
cairan anhidrat lainnya. Bagaimanapun juga range 150-170°C digunakan untuk streilisasi
panas kering dan lain-lain, sebagai contoh : bahan-bahan gelas, dapat disterilkan pada
suhu 170oC. dimana beberapa serbuk seperti sulfonilamid harus disterilkan pada suhu
rendah dan waktu yang lebih lama.
Secara umum, panas kering digunakan untuk sterilisasi bahan – bahan melalui proses
pengabuan dari mikroorganisme. Proses ini merupakan kelanjutan atau sekumpulan
proses yang dilakukan dalam sebuah oven dengan temperatur sekelilingnya 170°C untuk
sterilisasi atau 250°C untuk depirogenisasi. Panas kering digunakan untuk
sterilisasi/depirogenisasi alat-alat gelas yang akan digunakan untuk proses produksi
secara aseptik. Suhu yang digunakan ini, terlalu tinggi untuk wadah-wadah plastik. Sama
seperti sterilisasi uap air, prosesnya dapat diprediksi dan hasilnya dapat dikontrol.
Sterilisasi panas kering biasa digunakan untuk depirogenisasi alat-alat gelas dan bahan-
bahan lain yang memiliki kemampuan bertahan pada suhu yang digunakan. Secara
umum, validasi untuk alur depirogenisasi untuk proses panas kering selalu termasuk
proses sterilisasinya.
Panas kering pada temperatur lebih 160oC efektif menghancurkan mikroorganisme hidup
dengan sebuah proses kehilangan kelembaban secara inversible. Proses ini berjalan relatif
lambat, mengisyaratkan sedikitnya 1 jam pada suhu 160oC tetapi lebih cepat pada
temperatur yang tinggi. Panas kering ini sering merugikan beberapa produk.
Penerapan panas dengan keberadaan lembab lebih fektif untuk pembunuhan
mikroorganisme diisyaratkan 15 menit pada suhu 121oC.
Beberapa bahan yang tidak dapat disterilkan dengan uap, paling baik disterilkan dengan
panas kering,. Misalnya petrolatum jelly, minyak mineral, lilin, wax, serbuk talk. Karena
panas kering kurang efisien dibanding panas lembab, pemaparan lama dan temperatur
tinggi dibutuhkan. Range luas waktu inaktivasi dalam temperatur bervariasi telah
diterapkan berdasarkan tipe indikator steril yang digunakan, kondisi kelembaban dan
faktor lain. Jumlah air dalam sel mikroba diketahui mempengaruhi resistensinya terhadap
destruksi panas kering. Umumnya, ini diterima bahwa sel mikroba dalam daerah yang
betul-betul kering menunjukkan resistensi terhadap inaktivasi panas kering. Ini jelas
bahwa perhatian harus diberi untuk mendisain siklus sterilisasi panas kering untuk
produk-produk rumah sakit dan validasi sistematis sterilisasi dengan metode sterilisasi
standar.
Oven digunakan untuk sterilisasi panas kering biasanya secara panas dikontrol dan
mungkin gas atau elektrik gas.
Beberapa waktu dan suhu yang umum digunakan pada oven :
• 170°C (340 F) sampai 1 jam
• 160°C (320 F) sampai 2 jam
• 150°C (300 F) sampai 2,5 jam
• 140°C (285 F) sampai 3 jam

H. KESIMPULAN
Metode sterilisasi yaitu :
Pemanasan kering
Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai
kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan
mikrobanya mati.
- Udara panas oven
Digunakan untuk sterilisasi alat gelas yang tidak berskala, alat bedah, minyak lemak,
parafin, petrolatum, serbuk stabil seperti talk, kaolin, ZnO. Suhu sterilisasi yang
digunakan adalah 170¬¬¬¬¬¬¬oC selama 1 jam, 160¬¬¬¬¬¬¬oC selama 2 jam,
150¬¬¬¬¬¬¬oC selam 3 jam.

I. JAWABAN PERTANYAAN
1. Alat- alat lain yang bisa disterilkan dengan panas kering :
• Sterilisasi alat logam, bahan yang terbuat dari porselen, digunakan pada metode
pemijaran langsung.. Suhu yang digunakan 500-600oC dalam waktu beberapa detik,
untuk alat logam sampai berpijar.
• sterilisasi alat bedah seperti gunting bedah sebagai lubrikan menjaga ketajaman alat,
bahan kimia stabil dalam ampul. Ini digunakan pada metode minyak dan penangas lain.
Bahan atau alat dicelupkan dalam penangas dicelupkan dalam penangas yang berisi
minyak mineral pada suhu 160¬¬¬¬¬¬¬oC. Larutan natrium atau amonium klorida jenuh
dapat digunakan pula sebagai pengganti minyak mineral.
2. Media agar tidak bisa disterilisasi dengan panas kering, sebab sterilisasi panas kering
hanya berlaku untuk peralatan laboratorium serta materi-materi lain yang berbentuk
powder dan minyak. Adapun alat-alat yang akan disterilkan ditempatkan dalam oven
dimana suhunya dapat mencapai 1600C-1800C. sedangkan media agar dapat membeku
pada suhu 450C.

J. DAFTAR PUSTAKA
Scoville’s : The Art of Compounding, Glenn L. Jenkins et.all., 1957, New York : MC-
Graw Hill Book Companies.
Pharmaceutical Technology, Eugene L. Parrott, 1974, Minneapolis : Burgess Publishing
Company.
Teori dan Praktek Farmasi Industri (terjemahan), Leon Lachmann et.all., 1998, jakarta :
UI-Press.
Remington’s Pharmaceutical Sciences 18 th Edition, A.R. Gennaro, 1990,
Pennsylvania :Mack Publishing Company.
Parenteral Manual Technology, Michael J. groves, 1988, USA : Interpharm Press Inc.
Validation of Pharmaceutical Processes (electronic version), James Agalloco, 2008, USA
: Informa Healthcare Inc.

PRAKTIKUM III
A. Judul Praktikum:
STERILISASI DENGAN PANAS BASAH BERTEKANAN TINGGI (AUTOKLAF )
B. Tujuan Praktikum :
Mengetahui berbagai cara sterilisasi bahan / media pertumbuhan mikroorganisme
C. Dasar teori
Sterilisasi merupakan suatu proses yang bertujuan untuk menghilangkan dan
membebaskan semua alat dan media dari gangguan organisme mikrobia, termasuk virus,
bakteria dan spora dan fungi beserta sporanya. Sterilisasi merupakan suatu metode atau
cara yang digunakan untuk mengeliminasi semua mikroorganisme. Semua bahan dan alat
dalam media kultur maupun dalam kegiatan praktikum harus dalam keadaan steril.
Termasuk dengan media yang penting dalam kultur dan juga alat-alat yang menunjang
seperti pipet, tabung, jarum inokulasi dan peralatan lainnya serta area kerja.
Sterilisasi umumnya dilakukan menggunakan autoklaf untuk yang menggunakan panas
bertekanan tinggi. Cara ini paling baik karena suhu yang dicapainya tinggi dan air untuk
koagulasi protein banyak. Dengan alat ini besarnya tekanan uap air yang diperlukan dapat
di atur. Makin besar tekanan uap airnya, makin tinggi pula suhu yang di capainya.
Lamanya pemanasan bergantung pada tekanan uap yang dipergunakan, serta besar dan
macamnya benda yang akan diseterilkan.
Autoklaf serupa tangki minyak yang dapat di isi dengan uap air. Dalam otoklaf, yang
mensterilkannya adalah panas basah, bukan tekanannya. Oleh karena itu setelah air di
dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka uap air ini akan mengalir ke
ruang pensteril guna mendesak keluar semua udara di dalamnya. Pada tekanan uap 2
atmosfer di mana suhu yang dicapai 120°C, lama pemanasannya cukup selama 10-20
menit. Dengan cara ini, baik bentuk vegetatif maupun spora akan mati, sehingga
mencapai steril sempurna.

D. Alat Dan Bahan :

1. autoklaf
2. Media potato Dextose Agar ( PDA ) atau Nutrien Agar ( NA) dalam Erlenmeyer.
3. Cawan petri steril
4. inkubator.

E. Prosedur kerja
1. Menutup Erlenmeyer yang berisi PDA atau NA dengan kapas.

2. Mengisi autoklaf dengan akuades sampai permukaan air dibawah ansang / keranjang
autoklaf.

3. Menyambungkan autoklaf dengan sumber listrik dan nyalakan autoklaf.

4. Memasukkan Erlenmeyer yang telah berisi PDA atau NA ke dalam angsang /
keranjang autoklaf.

5. Menutup autoklaf dan kencangkan penutupnya dengan kuat.

6. Mengatur suhu, waktu dan tekanan yan g diperlukan untuk sterilisasi . Sterilisasi
umumnya dilakukan pada 120 derajat celcius dan tekanan 15 pounds selama 15 menit.

7. Setelah sterilisasi berakhir , membuka tutup autoklaf dan mengambil media yang telah
diseterilkan dan di tuang pada cawan petri steril, selanjutnya diinkubasi pada incubator.
F. Hasil Pengamatan
Alat – alat yang telah di sterilkan dengan panas bertekanan tinggi yang menggunakan alat
Autoklaf telah dapat dipakai dalam praktikum mengenai bahan makanan yang akan di uji
coba apakah makanan tersebut mengandung mikroba atau tidak. Dan alat ini di gunakan
untuk proses sterilisasi air mineral untuk membunuh kuman atau mikroba yang ada dalam
air mineral.alat yang telah digunakan telah disterilkan terlebih dahulu sehingga siap untuk
dipakai.

G.Pembahasan
Sterilisasi umumnya dilakukan menggunakan autoklaf untuk yang menggunakan panas
bertekanan. Cara ini paling baik karena suhu yang dicapainya tinggi dan air untuk
koagulasi protein banyak. Dengan alat ini besarnya tekanan uap air yang diperlukan dapat
di atur. Makin besar tekanan uap airnya, makin tinggi pula suhu yang di capainya.
Lamanya pemanasan bergantung pada tekanan uap yang dipergunakan, serta besar dan
macamnya benda yang akan diseterilkan.
Dalam otoklaf, yang mensterilkannya adalah panas basah, bukan tekanannya. Oleh
karena itu setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka uap air
ini akan mengalir ke ruang pensteril guna mendesak keluar semua udara di dalamnya.
Pada tekanan uap 2 atmosfer di mana suhu yang dicapai 120°C, lama pemanasannya
cukup selama 10-20 menit. Dengan cara ini, baik bentuk vegetatif maupun spora akan
mati, sehingga mencapai steril sempurna.
H. Kesimpulan
Dengan alat ini besarnya tekanan uap air yang diperlukan dapat di atur. Makin besar
tekanan uap airnya, makin tinggi pula suhu yang di capainya. Lamanya pemanasan
bergantung pada tekanan uap yang dipergunakan, serta besar dan macamnya benda yang
akan diseterilkan. Pada tekanan uap 2 atmosfer di mana suhu yang dicapai 120°C, lama
pemanasannya cukup selama 10-20 menit. Dengan cara ini, baik bentuk vegetatif maupun
spora akan mati, sehingga mencapai steril sempurna.
I. Jawaban Pertanyaan
1. Karena sterilisasi umumnya dilakukan menggunakan autoklaf untuk yang
menggunakan panas bertekanan tinggi. Cara ini paling baik karena suhu yang dicapainya
tinggi dan air untuk koagulasi protein banyak. Dengan alat ini besarnya tekanan uap air
yang diperlukan dapat di atur. Makin besar tekanan uap airnya, makin tinggi pula suhu
yang di capainya. Lamanya pemanasan bergantung pada tekanan uap yang dipergunakan,
serta besar dan macamnya benda yang akan diseterilkan.Dan dengan cara ini, baik bentuk
vegetatif maupun spora akan mati, sehingga mencapai steril sempurna.

J. Daftar Pustaka
Entjang Indan, Dr. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi. CV YRAMA WIDYA,
Bandung, Indonesia.
Irianto Koes, Drs. 2007. Mikrobiologi. CV YRAMA WIDYA, Bandung, Indonesia.
http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol60/volume60.pdf
PRAKTIKUM IV
A. Judul Praktikum
PEMBUATAN MEDIA
B. Tujuan Praktikum :
1) Mengetahui cara – cara membuat media.
2) Mengetahui macam dan kegunaan media.
C. Dasar Teori
Media merupakan suatu bahan yang terdiri dari campuran zat hara (nutrient) yang
berguna untuk membiakkan dan pertumbuhan mikroba. Fungsi media antara lain, untuk
isolasi, untuk memperbanyak, untuk pengujian sifat-sifat fisiologi, untuk perhitungan
jumlah mikroba.
Agar mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak di dalam media, diperlukan
persyaratan tertentu bagi media, yaitu :
1. Harus mengandung semua unsur hara yang dibutuhkan untuk pertumbuhan dan
perkembangan mikroorganisme.
2. Mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai dengan
kebutuhan mikroorganisme.
3. Dalam keadaan steril, artinya sebelum diinokulasi mikroorganisme yang dimaksud,
tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme yang tidak diinginkan.
Bentuk, dan susunan media ditentukan oleh: senyawa penyusun media, prosentase
campuran, dan tujuan pengggunaan.Media dapat digolongkan berdasarkan bentuk,
susunan kimia, dan fungsinya. Berdasarkan bentuk atau konsistesinya media terdiri dari :
a. Media padat (solid medium / medium NA), tidak mengandung agen cair
b. Media cair (liquid medium / medium Broth )
c. Media semi padat (semi solid medium), medium cair yang di tambah dengan agar solid
yang disebut agar.
Berdasarkan susunan bahan kimianya media dapat digolongkan menjadi :
1. Media sintetik / media siap saji, adalh media yang dibuat dari bahan-bahan yang
susunan kimianya diketahui dengan pasti, media inidiproduksi dan dibuat oleh pabrik /
industri seperti : Difco, oxoid, dan merck.
2. Media non sintetik / media alami, adalah bahn yang dibuat dari bahan-bahan yang
susunan kimianya belum diketahui secara pasti, misalnya bahan-bahan alami seperti,
daging, kentang, tauge, dll.
Berdasarkan fungsinya media terdiri dari beberapa jenis, yaitu :
1) Media Pengaya, adalah Media yang ditambah zat-zat tertentu (misalnya : serum, darah,
ekstrak tumbuhan) sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof
tertentu. Misal : medium buatan loeffler ditambah serum (memiara basil difteri); medium
ditambah air tomat untuk menumbuhkan lactobacillus
2) Media Khusus, adalah media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan
kemampuannya untuk mengadakan perubahan kimia tertentu.
3) Media Penguji, adalah media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian
vitamin-vitamin, asam amino, antibiotik dan sebagainya .
4) Media Selekif, adalah media yang ditambah zat-zat tertentu yang bersifat selektif
untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain. Misal : Kristal violet menumbuhkan bakteri
Gram negatif saja, menghambat bakteri Gram positf.
5) Media Differensial, adalah Media yang ditambah zat kimia tertentu, suatu mikroba
membentuk pertumbuhan tertentu, dapat untuk membedakan tipe-tipenya misal : Darah
Agar dapat membedakan bakteri hemolitik dan bakteri non hemolitik.
6) Media Perhitungan Mikroba, adalah media yang spesifik untuk perhitungan jumlah
mikroba
Media yang umum digunakan adalah Natrium Agar (NA), yang berbahan baku agar.
Agar adalah ekstrak dari rumput laut yang merupakan karbohidrat. Kompleks penyusun
utamanya adalah galaktosa, tidak mengandung nutrisi. Medium solid membutuhkan agar
sekitar 1,5 hingga 1,8 %. Sedangkan konsentrasi kurang dari 1 % dari ketentuan tersebut,
akan menjadi medium semi solid. Agar bertindak sebagai agen pemadat yang sangat baik
karena pada suhu 1000 C berupa larutan sedangkan pada suhu 400 C memadat. Oleh
Karena itu organisme terutama yang patogen dapat dikultivasi pada temperatur 37,50 C
atau sedikit lebih tinggi tanpa rasa kuatir medium akan meleleh. Medium solid
mempunyai keuntungan karena dapat memadat sehingga dapat ditumbuhi
mikroorganisme dengan menggunakan teknik khusus untuk mengisolasi koloni yang
berlainan.
D. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Beaker glass
b. Gelas ukur
c. Batang pengaduk
d. Kapas
e. Pembakar
f. Autoklaf
g. Cawan petri
h. Inkubator
i. Erlenmeyer
2. Bahan
a) NA ( Nutrien Agar )
b) Aquades
E. Prosedur Kerja
1. Mengambil media NA secara aseptis di timbang sebanyak 0,42 gr lalu dilarutkan
dalam 15 ml aquades.
Memasukkan Na kedalam aquades dan melarutkannya.

2. Memanaskan pada kompor listrik sampai mendidih dan mengaduk secara perlahan –
lahan.

3. Setelah larut sempurna kemudian mengangkat dan menuangkan pada Erlenmeyer dan
menutup dengan aluminium foil.
4. Mensterilkan dalam autoklaf dengan suhu 120 0 C dengan tekanan 15 pounds selama
15 menit.

5. Menuangkan 15 ml medium ke dalam cawan petri dan pengisian dilakukan sebelum

medium dingin dan mengental.

6. Melakukan inkubasi selama 1 x 24 jam.

7. Media dapat di simpan dalam lemari Es dengan di bumgkus dengan aluminium foil
sampai diperlukan.
F. Hasil pengamatan
Media dalam bentuk agar dan setalah dinggin media di masukkan ketempat incubator.
Media yang di masukkan ke dalam incubator dan telah dituangkan ke dalam cawan petri
G. Pembahasan
Pembiakan mikroba dalam laboraturium memerlukan medium yang berisi zat hara serta
lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme. Zat hara yang digunakan
oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan,sintesis sel, keperluan energi dalam
metabolisme, dan pergerakan. Lazimnya, medium biakan berisi air, sumber energi, zat
hara sebagai sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen, serta unsur –
unsur sekelumit ( trace element ). Dalam bahan dasar medium dapat pula ditambahkan
faktor pertumbuhan berupa asam amino, vitamin atau nukleotida.
Medium biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme dalam bentuk
padat, semi padat,dan cair. Medium padat diperoleh dengan menambahkan agar. Agar
bersal dari ganggang merah. Agar digunakan sebagai pemadat karena tidak dapat
diuraikan oleh mikrobadan membeku diatas 45o C. Kandungan agar sebagai bahan
pemadat dalam medium adalah 1 – 2 %.
Setelah medium biakan disiapkan, harus disterilkan lebih dahulu sebelum digunakan
untuk membiakkan mikroba. Bila medium biakan yang disiapkan tidak disterilkan,
mikroba pencemar akan tumbuh menyebabkan kekeruhan medium. Adanya mikroba
pencemar menyebabkan kita tidak dapat mengetahui apakah perubahan yang terjadi
dalam medium disebabkan mikrobe yang tumbuh ataukah oleh mikroba pencemar.
Di laboratorium,sterilisasi medium menggunakan otoklaf dengan tekanan uap air,
sehingga suhu dapat mencapai 121o C dan tekanan 15 lbs atau 1 atm selama 15
menit.Cairan yang tidak tahan panas, dapat disterilkan dengan menggunakan berbagai
macam saringan. Contoh cairan yang tidak tahan panas adalah urea, berbagai macam
karbohidrat, dan serum. Lazimnya, saringan yang digunakan memiliki pori – pori 0,45
μm.
Perbedaan sifat – sifat mikroba terhadap induk semangnya akan berpengaruh terhadap
medium apa yang akan dipakai. Berdasarkan pada hal terebut, media terbagi menjadi 2
golongan besar :
a. Media hidup
Media hidup umumnya dipakai dalam Laboratorium Virologi untuk pembiakan berbagai
virus, sedangakan dalam laboratorium bakteriologi hanya beberapa kuman tertentu saja,
dan terutama pada hewan percobaan. Contoh media hidup adalah hewan percobaan
termasuk manusia, telur berembrio, biakan jaringan, dan sel – sel biakan bakteri tertentu
untuk penelitian bakteriofage.
b. Media mati
Media mati terbagi menjadi beberapa macam, yakni :
Berdasarkan susunan kimia
a. Media sintetik
komposisi kimiawi medium diketahui dengan pasti .
contoh : Nutrien Broth ( digunakan untuk menumbuhkan bakteri )
Nutrien Agar ( digunakan untuk menumbuhkan bakteri )
Potato Dextrosa Agar ( digunakan untuk menumbuhkan kapang )
b. Media non sintetik
komposisi kimiawi tidak diketahui dengan pasti.
Contoh : Ekstrak daging, Ekstrak kentang, dan Ekstrak taoge
● Berdasarkan Konsistensinya
a. Media cair (Liquid medium)
digunakan untuk perbanyakan mikroba. Contoh : Nutien Broth
b.Media padat (Solid medium)
Digunakan sebagai pemadat dan melihat morfologi koloni mikroba.
Contoh : Agar
c. Media semi padat (Semi solid medium)
Digunakan untuk uji motilitas mikroba
Contoh : gelatin
Berdasarkan Fungsinya
a. Media diperkaya
Media yang ditambah zat-zat tertentu (misalnya : serum, darah, ekstrak tumbuhan)
sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu.
Contoh :
- medium buatan loeffler ditambah serum
(memiara basil difteri)
- medium ditambah air tomat untuk
menumbuhkan lactobacillus
b. Media penguji
Media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin-vitamin, asam
amino, antibiotik dan sebagainya.
c. Media Selektif
Media yang ditambah zat-zat tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan
mikroba lain.
Contoh : Kristal violet menumbuhkan bakteri Gram negatif saja, menghambat bakteri
Gram positif
d. Media Khusus
Media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikrobia dan kemampuannya untuk
mengadakan perubahan kimia tertentu.
e. Media diferensial
Media yang ditambah zat kimia tertentu, suatu mikrobia membentuk pertumbuhan
tertentu, dapat untuk membedakan tipe-tipenya
Contoh : Darah Agar dapat membedakan bakteri hemolitik dan bakteri non hemolitik.
f. Media untuk perhitungan jumlah yang spesifikmenghitung jumlh mikroba
H. Kesimpulan
Media dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu :
• Berdasarkan susunan kimia
a. Media sintetik
b. Media non sintetik
• Berdasarkan konsistensinya
a. Media cair
b. Media padat
c. Media semi padat
• Berdasarkan fungsinya
a. Media diperkaya
b. Media penguji
c. Media Selektif
d. Media Khusus
e. Media diferensial
f. Media untuk perhitungan jumlah mikroba
I. Jawaban pertanyaan
1.diagram pengolongan media
No Jenis Media Macam media
1 Berdasarkan susunan kimia media anorganik, media organik, media sintetik, media non
sintetik (Alami)
2 Berdasarkan konsistensinya media cair, media padat, media semi padat.
3 Berdasarkan fungsinya media diperkaya, media selektif, media diferensial, media
penguji, media untuk perhitungan jumlah mikroba.
4 Media umum NA, PDA
5 Media pengaya Mempercpt pertumb yg lain
6 Media selektif SSA, EMBA
7 Media deferensial Agar darah
8 Media penguji menguji antibiotika
9 Media perhitungan umum/selektif
2.contoh susunan media
NA, PDA, SSA, MBA, Agar Darah.
3.NA gram = 10 x 15 x 20
1000
= 3 gram
NA ml = 10 x 15 = 150 m.
J. Daftar Pustaka
Dwidjoseputro, D. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Penerbit Djambatan, Jakarta
Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Dasar 1, PT Gramedia, Jakarta
Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press
: Yogyakarta
Suriawiria, U., 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum, Penerbit Angkasa, Bandung
Waluyo,Lud.Drs.M.Kes.2004.Mikrobiologi Umum.Universitas Muhammadiyah Press :
Malang.

PRAKTIKUM V
A. Judul Praktikum:
UJI KUANTITATIF BAKTERI PADA BAHAN MAKANAN DENGAN METODE
POUR PLATE
B. Tujuan Praktikum
Untuk mengetahui jumblah bakteri pada bahan makanan dengan metoda pour plate
C. Dasar Teori
Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan
khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan
mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam
fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga
pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat
dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi
cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Sekitar 1 ml suspensi
dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur
(nutrien agar) steril hangat (40-50oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam
inkubator (37oC) selama 1-2 hari.
Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjdi
kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di
laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium
dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain
mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media
panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga
mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media
agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat
kemudian diletakkan dalam incubator.
Pada metode pour plate volume kultur sebanyak 0,1-1,0 ml diambil dan dimasukkan
kedalam cawan petri steril. Kemudian ditambahkan media agar cair dan dilakukan
pencampuran antara kultur dan media dengan memutar cawan petri secara pelan pada
permukaan yang rata. Karena sampel dicampur dengan media agar cair maka volume
kultur yang digunakan dapat lebih tinggi dibanding dengan metode spread plate. Pada
pengujian dengan metode pour plate, kultur/sampel mikroba yang digunakan harus dapat
bertahan hidup pada saat media agar dengan suhu sekitar 45 0C ditambahkan. Didalam
penggunaan metode spread plate dan pour plate sangat penting jika jumlah koloni yang
tumbuh pada media agar tidak terlalu banyak, karena pada petri yang ditumbuhi koloni
yang banyak, beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal sehingga dapat
menimbulkan perhitungan yang salah. Jumlah koloni yang sangat sedikit juga tidak
diharapkan karena secara statistik keakuratan hasil perhitungan jumlah koloni ini sangat
rendah. Dalam penerapannya, secara statistik yang paling baik adalah menghitung jumlah
koloni hanya jika pada media agar terdapat koloni antara 30 – 300 koloni.
Untuk memperoleh jumlah koloni yang tepat, sampel yang akan dianalisa harus selalu
diencerkan terlebih dahulu. Karena dalam penerapannya sangat sulit dilakukan
pendugaan jumlah sel maka biasanya sangat penting untuk melakukan pengenceran lebih
dari satu.
D. Alat dan Bahan
1. Alat : Vortex, petridish, Erlenmeyer , Dispo, incubator, autoklaf, mortar, Colini
counter, Bunsen, Neraca Ohaus, dan Tabung reaksi.
2. Bahan : NaCL fisiologis, aquades steril, NA ( Nutrien Agar ), alcohol 70 % dan bahan
makanan ( daging, ikan kaleng ,telur, ikan asin, ikan asap. ).
E. Prosedur Kerja
1. Mengambil bahan makanan yang akan di uji seberat 1 gram lalu masukkan ke dalam
mortar steril dan menghaluskan, lalu mengambil bahan makanan yang sudah dihaluskan
tadi sebanyak 1 gr kemudian memasukkannya kedalam larutan NaCL fisiologi steril
sebanyak 10 ml, suspensi yang diperoleh dipindahkan kedalam tabung steril dan di vortex
sampai homogen.

2. Dari suspensi yang tersedia diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan dispo dan
mengencerkan menjadi 1 ; 10 dengan menambahkan NaCL fisiologi sebanyak 9 ml,
selanjutnya dibuat pengenceran 1 : 100 , yaitu mengambil 1 ml dari hasil pengenceran
sebelumnya ( 1 : 10 ) dan ditambahkan NaCL fisiologi sebanyak 9 ml. demikian
seterusnya dibuat sampai pengenceran yang diinginkan.

3. Setelah itu dari masing – masing pengenceran di ambil suspense sebanyak 1 ml dan
memindahkan kedalam cawan petri kemudian memasukkan media NA yang bersuhu ± 45
0C kemudian digerakkan perlahan – lahan agar suspense tersebut tercampur rata ke
dalam media.

4. Selanjutnya menginkubasi dalam incubator dengan suhu 37 0C selama 1 x 24 jam

dengan posisi cawan petri dalam keadaan terbaik.

5. Menghitung jumlah koloni yang terdapat di cawan petri kemudian hitung jumlah sel
bakteri pada bahan makan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
Koloni per ml / per gr = jumlah koloni percawan x 1
Factor pengenceran
F. Hasil Pengamatan
Cawan petri yang telah di inkubasi didalamnya terdapat mikroba.
Dari percobaan yang kami lakukan kami maendapatkan hasil :

PENGENCERAN JUMLAH KOLONI BENTUK PERMUKAAN BENTUK PINGGIR

10-1 40 Datar Agak Bergerigi & melengkung
10-2 20 Datar Agak Bergerigi & melengkung
10-3 13 Datar Melengkung
G. Pembahasan
Pada metode pour plate volume kultur sebanyak 0,1-1,0 ml diambil dan dimasukkan
kedalam cawam petri steril. Kemudian ditambahkan media agar cair dan dilakukan
pencampuran antara kultur dan media dengan memutar cawan petri secara pelan pada
permukaan yang rata. Karena sampel dicampur dengan media agar cair maka volume
kultur yang digunakan dapat lebih tinggi dibanding dengan metode spread plate.
Pada pengujian dengan metode pour plate, kultur/sampel mikroba yang digunakan harus
dapat bertahan hidup pada saat media agar dengan suhu sekitar 45 0C ditambahkan.
Didalam penggunaan metode spread plate dan pour plate sangat penting jika jumlah
koloni yang tumbuh pada media agar tidak terlalu banyak, karena pada petri yang
ditumbuhi koloni yang banyak, beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal sehingga
dapat menimbulkan perhitungan yang salah. Jumlah koloni yang sangat sedikit juga tidak
diharapkan karena secara statistik keakuratan hasil perhitungan jumlah koloni ini sangat
rendah. Dalam penerapannya, secara statistik yang paling baik adalah menghitung jumlah
koloni hanya jika pada media agar terdapat koloni antara 30 – 300 koloni. Untuk
memperoleh jumlah koloni yang tepat, sampel yang akan dianalisa harus selalu
diencerkan terlebih dahulu. Karena dalam penerapannya sangat sulit dilakukan
pendugaan jumlah sel maka biasanya sangat penting untuk melakukan pengenceran lebih
dari satu.
Untuk membuat pengenceran 10-1 maka kita dapat melakukan pencampuran antara 0.5
ml sampel dengan 4.5 ml larutan pengencer atau dengan pencampuran 1.0 ml sampel
dengan 9.0 ml larutan pengencer. Untuk membuat pengenceran 10-2 maka kita dapat
melakukan pengenceran 0.05 ml sampel dengan 4.95 larutan pengencer atau 0.1 sampel
dengan 9.9 ml larutan pengencer atau sebagai alternatif pengenceran 10-2 dapat dibuat
dengan melakukan pencampuran 1,0 sampel (yang diambil dari pengenceran 10-1)
dengan 9,0 ml larutan pengencer, dan begitu seterusnya hingga didapatkan pengenceran
yang diperkirakan dapat memberikan hasil antara 30-300 koloni. Jumlah koloni dalam
sampel dapat dihitung sebagai berikut :
Koloni per ml / per gr = jumlah koloni percawan x 1
Factor pengenceran
Pada pengenceran 10-1 dengan jumlah 40 koloni dapat dihitung koloni dalam sampel
yaitu :
40 x 1 = 400 koloni/ml
10-1
H. Kesimpulan
Jumlah koloni yang diperoleh dengan menggunakan metode ini tidak hanya bergantung
pada jumlah inokulum tetapi juga kesesuaian media dan kondisi inkubasi yang digunakan
dan juga bergantung pada lama waktu inkubasi. Sel yang ditumbuhkan pada media tidak
seluruhnya akan tumbuh menjadi koloni pada tingkat yang sama, dan jika waktu inkubasi
yang digunakan pendek maka jumlah koloni yang diperoleh mungkin lebih rendah dari
jumlah maksimum koloni yang dapat terbentuk. Sebagai catatan sangat mungkin dua atau
lebih sel dapat membentuk hanya satu koloni, sehingga untuk menggambarkan hasil yang
didapatkan maka viable count lebih dinyatakan sebagai jumlah colony-forming unit
dibanding dinyatakan sebagai jumlah viable cell (karena koloni yang terbentuk mungkin
mengandung lebih dari satu sel mikroba)

I. Jawaban pertanyaan
1. kelebihan dan kekurangan dari metode pour plate

Kelebihan Kelemahan
Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
 Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
 HasilDapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba perhitungan tidak
menunjukkan jumlah sel sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin akan
membentuk satu koloni
Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda
Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk
koloni yang jelas
Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relative lama sehingga pertumbuhan koloni
dapat dihitung
2. Aturan-aturan dalam standar plate count (SPC)
- Jumlah Koloni 30—300 koloni
- Beberapa jumlah koloni yang bergabung dihitung satu koloni
- Gabungan satu garis tebal dihitung satu koloni
- Jika lebih kecil dari 30 koloni, pengenceran terendah yg dihitung
- Jika lebih besar dari 300 koloni, pengenceran tertinggi yg dihitung
- Jika antara 30-300 dari dua tingkat pengenceran dan perbandingan antara hasil tertinggi
dan terendah dari pengenceran tsb lebih kecil atau = 2, dilaporkan rata-ratanya. Jika lebih
besar dari 2 maka yang dilaporkan adalah hasil yang terkecil.
J. Daftar pustaka
GAUTHIER . M and BLAIS. B.W. 2005. CLOTH-BASED HYBRIDIZATION ARRAY
SYSTEM FOR DETECTION OF TOXIN GENES ASSOCIATED WITH MAJOR
FOODBORNE PATHOGENIC BACTERIA. Journal of Rapid Methods and Automation
in Microbiology 13 (2005) 243–256. Blackwell Publishing
HSIN-YI PU and SHAW-JYE WU. 2005. A MICROTRAY-BASED AGGREGATION
ASSAY FOR THE RAPID DETECTION OF POLYMERASE CHAIN REACTION
AMPLICONS PRODUCED FROM BACTERIAL PATHOGENS. Journal of Rapid
Methods and Automation in Microbiology 13 (2005) 257–268. Blackwell Publishing.
Irwin. P, et al. 2005. LUMINESCENT METHODS TO DETECT VIABLE AND
TOTAL
Campylobacter jejuni IN GROUND BEEF. Journal of Rapid Methods and Automation in
Microbiology 13 (2005) 57–70. Blackwell Publishing

PRAKTIKUM VI
A. Judul Praktikum
PERHITUHGAN BAKTERI Coliform PADA AIR DENGAN METODE MOST
PROBABLE NUMBER (MPN)
B. Tujuan Praktikum
Untuk mengetahui jumlah bakteri coliform pada air dengan menggunakan uji penduga
metode most probable number (MPN).
C. Dasar Teori
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif
koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa
dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan
analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri
koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan
secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup
akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagi jumlah
organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada
percobaan ini.
Beratus-ratus spesies dapat menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk
mulut, saluran pencernaan, dan kulit . Koliform merupakan kelompok bakteri yang
digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik
terhadap air, makanan dan produk-produk susu. Bakteri koliform dapat dibedakan atas
dua kelompok yaitu koliform fekal (Escherchia coli) dan koliform non fekal
(Enterobacter aerogenes). E. coli adalah bakteri koliform yang ada pada kotoran manusia,
maka E. coli sering disebut sebagai koliform fekal. Pengukuran kuantitatif populasi
mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis.
Berbagai macam cara dapat dilakukan untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan
tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung.
Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat
preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan
penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak
langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih
hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan
pada cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan
jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau
turbidimetri).
Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk
penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah
mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh
sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi
syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah
organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni
yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan. Metode
perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri
yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri
ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman,
sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah
amonium menjadi nitrat .
D. Alat dan Bahan
1. Tabung Reaksi
2. Tabung Durham
3. Pipet Volume
4. Cawan Petri
5. Aquadest
6. Kaldu nutrisi agar
7. Kapas
8. Sampel air (aquades, air kran, air limbah)
9. Laktosa Broth
E. Prosedur Kerja
1. Membuat pengenceran dari sampel yang akan diperiksa mulai dari pengenceran 10-1,
10-2, 10-3 atau 10-4, 10-5, 10-6.

2. Menyediakan 12 tabung reaksi, 3 tabung berisi 9 ml aquades steril, 9 tabung berisi 9

ml laktosa broth (LB).
3. Memasukan 1 ml sampel kedalam tabung pertama (isi aquades), kocok sampai
homogen, hingga larutan dalam tabung pertama menjadi 10-1.
4. Mengambil 1 ml dari tabung pertama masukkan kedalam tabung kedua, mengocoknya
sampai homogen, hingga konsentrasi larutan didalam tabung kedua menjadi 10-2, dan
dibuat juga pengenceran 10-3.
5. Mengambil larutan dari tabung 10-1, sebanyak masing-masing 1 ml untuk 3 tabung (isi
LB 9 ml) 10-1, kemudian mengambil larutan dari tabung 10-2, sebanyak masing-masing
1 ml untuk 3 tabung 10-2, juga untuk pengenceran 10-3.
6. Inkubasi dengan suhu 22-370 C selam 2 x 24 jam.

7. Menghitung jumlah tabung reaksi yang positif kemudian hitung nilai MPN dengan
menggunakan rumus sebagai berikut.
MPN Sampel = Nilai MPN tabel x 1
Faktor pengenceran di tengah

F. Hasil Pengamatan

Ket : warna kuning dan bergelembung = positif( + mengandung bakteri Coli form)
Warna hijau dan bergelembung = positif( + mengandung bakteri Coli form)
Pengenceran Hasil pengenceran 10 -1 Hasil pengenceran 10 -2 Hasil pengenceran 10 -3
10 -1 + + +
10 -2 + + +
10 -3 + + -

G.Pembahasan
Teknik most probable number (MPN) dilakukan dengan pengenceran. Suatu larutan yang
mengandung mikroba diencerkan terus- menerus. Misalnya dengan larutan yang berisi
1.000 sel/mL, diencerkan 10 kali menjadi larutan yang berisi 100 sel/mL. Lalu
diencerkan lagi 10 kali, sehingga jumlah sel adalah 10 sel/mL, dan diencerkan 10 kali
lagi, sehingga hanya terdapat 1 sel/mL, dan diencerkan lagi 10 kali tinggal 0,1 sel/mL.
Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi
(confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Output metode MPN adalah nilai
MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit
pembentuk–koloni (colony–forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai
MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan,
umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam
sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya
mengandung 10 coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut
makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum.
Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN,
terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Krisna, 2005).Metode
MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi
(confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama,
keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji
ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Prosedur perhitungan adalah
dengan penumbuhan dalam agar. Sampel suspensi sel diinokulasi ke dalam media agar
nutrien dan diinkubasi. Lantas jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Satu koloni yang
terbentuk dari satu sel, maka jumlah koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan
asalnya. Prosedur ini hanya menghitung sel-sel yang hidup.
Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran
pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri
patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fecal adalah bakteri
indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi
indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan
keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan
sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain.
Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas air minum.
Kelompok bakteri coliform, antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan
Citrobacter fruendii. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukkan tingkat
sanitasi rendah. Keberadaan bakteri ini juga menunjukkan adanya bakteri patogen lain,
misalnya, Shigella, yang menyebabkan diare hingga muntahber . Salah satu anggota
kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada
kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform
jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji
penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli.
Berdasarkan uji coba yang kami lakukan terhadap air got tenyata air got mengandung
bakteri coliform hal ini di buktikan dengan adanya perubahan warna pada air yang telah
dilakukan uji MPN . Mengenai metode MPN dari setiap pengenceran dimasukan 1ml
masing – masing kedalam tabung yang berisi medium, diamana untuk setiap pengenceran
digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung
jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau ditandai dengan timbulnya
kekeruhan atau gas pada tabung durham. Contohnya : suatu bahan pangan dilakukan
pengenceran secra desimal, dari masing – masing pengenceran dimasukan 1 ml ke dalam
tabung yang berisi Lactosa Broth dan tabung durham. Untuk setiap pengenceran
digunakan tiga seri tabung, setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dilihat dari
tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi mikroba yang dapat ditandai dengan
terbentuknya gas didalam tabung durham misalnya pada gambar berikut ini :

10 -1 10-2 10-3

10-1 10-2 10-3

332
Keterangan ;
- Pada pengenceran 10-1, ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positif
- Pada pengenceran 10-2, ketiga tabung positif
- Pada pengenceran 10-3, dua tabung positif dan satu tabung negative
Berdasarkan percobaan diatas kombinasi yang didapat adalah kombinasi 3, 3,2 maka :
kombinasi = 3, 3, 2
Nilai MPN dari table MPN 3 seri = 1,50
MPN mikroba = nilai MPN dari 1/ pengenceran tabung table yang tengah
= 1,50 x 1/10-2
= 1,5 x 102
H. Jawaban Pertanyaan
1. Keuntungan dan kelebihan dari metode MPN disbanding dengan metode yang lain
dalam penentuan jumlah bakteri.

Kelebihan Kekurangan
• Cukup mudah untuk dilakukan
• Dapat menentukan jumlah spesifik mikrobia tertentu dengan menggunakan media yang
sesuai
• Metode ini dipilih untuk menetukan densitas bakteri coliform fekal • Membutuhkan alat
gelas dalam jumlah yang banyak
• Tidak dapat digunakan dalam pengamatan morfologi dari suatu mikroorganisme
2. Bagan langkah-langkah pengujian sampel dengan menggunakan metode MPN.
3 Tahapan uji MPN

1. Uji Penduga
10 -1 10-2 10-3

10-1 10-2 10-3

2. uji penguat

3. Uji Biokimia
Uji gula-gula (glukosa, fruktosa, laktosa, maltosa)
 Uji IMViC (indol,methyl-red,voges-proskauer dan citrat) untuk:
Membedakan kel bakteri Enterobakteriaceae (Klebsiela, Enterobacter, Salmonella, E.
Coli, Proteus, dll)
Contoh: E. Coli IMViC + + - -

I. Kesimpulan
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif
koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa
dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan
analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif coliform.
Jumlah masing-masing cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk
penghitungan koloni ialah yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlah
mikroorganisme dalam sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperoleh
sekurang-kurangnya satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhi
syarat tersebut maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah
organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni
yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN,
terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi .Metode MPN terdiri dari
tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji
kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih
dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat
fermentatif coliform dalam sampel. Prosedur perhitungan adalah dengan penumbuhan
dalam agar. Sampel suspensi sel diinokulasi ke dalam media agar nutrien dan diinkubasi.
Lantas jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Satu koloni yang terbentuk dari satu sel,
maka jumlah koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan asalnya. Prosedur ini hanya
menghitung sel-sel yang hidup.

J. Daftar Pustaka
Alaerts, G. dan Santika, S.S., 1987. Metode Penelitian Air,
Penerbit Usaha Nasional, Surabaya
Copyright © 2009 SIDIK JARI • Corporate theme by StudioPress • Log in
Get a Blog • WordPress • Log in
Dwidjoseputro, D. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Penerbit
Djambatan, Jakarta
PRAKTIKUM VII
A. Judul Praktikum
UJI PENGUAT BAKTERI E. COLI PADA AIR DENGAN METODE MOST
PROBABLE NUMBER ( MPN )
B. Tujuan
Untuk mengetahui Bakteri E. coli pada sampel air dengan menggunakan uji penguat
metode most probable number.
C. Dasar Teori
Pada metode MPN ini digunakan medium cair didalam tabung reaksi, dimana
perhitungann dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi
oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tetentu. Pengamatan tabung yang
positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas
didalam tabung durham untuk mikroba pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada
umumnya digunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan
menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih
banyak.
Cara melihat jumlah bakteri dapat ditentukan dengan rumus sbb :
Jumlah bakteri = Nilai MPN ( dari table ) x 1/pengenceran tabung yang ditengah.
Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik didalam contoh
yang berbentuk cair, meskipun dapat digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan
terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari sampel. Grup mikroba yang dapat dihitung
dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk
pertumbuhan.
Dalam metode MPN, dari setiap pengenceran dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam
tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran digunakan tiga seri tabung.
Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu dilakukan penghitungan jumlah tabung
yang positif (ditandai dengan timbulnya kekeruhan). Misalnya pada pengenceran pertama
ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran dua tabung positif,
pada pengenceran ketiga satu tabung positif dan pada pengenceran terakhir tidak ada
tabung positif. Kombinasinya menjadi 3, 2, 1, 0 dan jika diambil dari tiga pengenceran
pertama kombinasinya akan menjadi 3, 2, 1.
D. Alat dan Bahan
1. Cawan petri
2. Jarum ose
3. EMBA
E. Prosedur Kerja
1. Jarum ose diseterilkan terlebih dahulu
2. Mengambil sampel pada uji penduga yang positif.

3. Mengoreskan pada media EMBA dengan goresan sinambung.

4. Menginkubasi selama 24 jam pada suhu 37 derajat celcius.

5. Apabila koloni bakteri berwarna hijau metalik dinyatakan positif E. coli.

F. Hasil Pengamatan

Kami mengambil sample pada uji penduga yang positif dan menggoreskan pada media
EMBA dengan goresan sinambung. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC
kami memperoleh koloni bakteri yang berwarna hijau metalik dari goresan tersebut.
Sehinnga dinyatakan bahwa koloni bakteri tersebut positif E. coli
G. Pembahasan
Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN,
terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Krisna, 2005).Metode
MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi
(confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama,
keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji
ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Prosedur perhitungan adalah
dengan penumbuhan dalam agar. Sampel suspensi sel diinokulasi ke dalam media agar
nutrien dan diinkubasi. Lantas jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Satu koloni yang
terbentuk dari satu sel, maka jumlah koloni menunjukkan jumlah sel dalam larutan
asalnya. Prosedur ini hanya menghitung sel-sel yang hidup.
Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran
pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri
patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fecal adalah bakteri
indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi
indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan
keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan
sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain.
Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting bagi kualitas air minum.
Kelompok bakteri coliform, antara lain Eschericia coli, Enterrobacter aerogenes, dan
Citrobacter fruendii. Keberadaan bakteri di dalam air minum itu menunjukkan tingkat
sanitasi rendah. Keberadaan bakteri ini juga menunjukkan adanya bakteri patogen lain,
misalnya, Shigella, yang menyebabkan diare hingga muntahber . Salah satu anggota
kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada
kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform
jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji
penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli.
Berdasarkan uji coba yang kami lakukan terhadap air got tenyata air got mengandung
bakteri coliform hal ini di buktikan dengan adanya perubahan warna pada air yang telah
dilakukan uji MPN.

10 -1 10-2 10-3

++++++++-

Kami mengambil sample pada uji penduga yang positif dan menggoreskan pada media
EMBA dengan goresan sinambung. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC
kami memperoleh koloni bakteri yang berwarna hijaumetalik dari goresan tersebut.
H. Jawaban Pertanyaan
1. Keuntungan dan kelebihan dari metode MPN disbanding dengan metode yang lain
dalam penentuan jumlah bakteri.
Kelebihan Kekurangan
• Cukup mudah untuk dilakukan
• Dapat menentukan jumlah spesifik mikrobia tertentu dengan menggunakan media yang
sesuai
• Metode ini dipilih untuk menetukan densitas bakteri coliform fekal • Membutuhkan alat
gelas dalam jumlah yang banyak
• Tidak dapat digunakan dalam pengamatan morfologi dari suatu mikroorganisme

2. Bagan langkah-langkah pengujian sampel dengan menggunakan metode MPN.

3 Tahapan uji MPN

1. Uji Penduga
10-1 10-2 10-3
24 x1 /10-2
2,4 x 103 sel/ ml

10-1 10-2 10-3

333

2. Uji Penguat

3. Uji Biokimia
Uji gula-gula (glukosa, fruktosa, laktosa, maltosa)
 Uji IMViC (indol,methyl-red,voges-proskauer dan citrat) untuk:
Membedakan kel bakteri Enterobakteriaceae (Klebsiela, Enterobacter, Salmonella, E.
Coli, Proteus, dll)
Contoh: E. Coli IMViC + + - -
I. Kesimpulan
Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif
terbentukasam dan gas terutama pada masa inkubasi 1x 24 jam, suspensi ditanamkan
pada media Eosin Methylen Biru Agar ( EMBA ) secara aseptik dengan menggunakan
jaruminokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh ber-warna merah kehijauan
dengan kilat metalik atau koloni berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok
koliform lainnya.
J. Daftar Pustaka
Alaerts, G. dan Santika, S.S., 1987. Metode Penelitian Air,
Penerbit Usaha Nasional, Surabaya
Copyright © 2009 SIDIK JARI • Corporate theme by StudioPress • Log in
Get a Blog • WordPress • Log in
Dwidjoseputro, D. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Penerbit
Djambatan, Jakarta

PRAKTIKUM VIII
A. Judul Praktikum
SENSITIVITAS BAKTERI (RESISTENSI BAKTERI)
B. Tujuan Praktikum
Untuk menentukan sensitivitas tidaknya suatu bakteri terhadap berbagai macam zat anti
mikroba.
C. Dasar Teori
Telah diketahui bahwa ekstrak daun Psidium guajava L. mempunyai daya antidiare.
Karena infeksi Salmonella typhimurium merupakan salah satu penyebab diare, maka
perlu diuji kepekaan kuman ini terhadap ekstrak daun Psidium guajava L. Uji sensitivitas
kuman dilakukan dengan metode pengenceran tabung (Tube Dilution Method).
Kerapatan populasi bakteri diperoleh berdasarkan pengamatan kekeruhan dan
pengukuran kerapatan optic (Optical Density) bakteri dengan spektrofotometer.
Penelitian membuktikan adanya kepekaan kuman Salmonella typhimurium terhadap
ekstrak daun Psidium guajava secara in vitro. Jumlah bakteri hidup yang ditunjukkan
oleh pertumbuhan koloni menggambarkan penurunan yang cukup linier dari konsentrasi
200 mg/ml sampai 6,25 mg/ml. Ini menunjukkan bahwa daun Psidium guajava
mengandung bahan aktif yang bersifat antibakteri terhadap Salmonella typhimurium.
Kata kunci : Salmonella typhimurium, Psidium guajava , uji sensitivitas
Penyakit infeksi merupakan penyakit yang banyak diderita masyarakat Indonesia sejak
dulu, diantaranya adalah infeksi usus (diare). Diare adalah suatu gejala klinis dari
gangguan pencernaan (usus) yang ditandai dengan bertambahnya frekuensi defekasi lebih
dari biasanya dan berulang-ulang yang
disertai adanya perubahan bentuk dan konsistensi feses menjadi lembek atau cair.
Salah satu faktor penyebab terjadinya diare antara lain karena infeksi kuman penyebab
diare. Brooks et al (1996) telah menginventarisasi 12 jenis bakteri, yaitu: Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus, Clostridium perferingens, Escherichia coli, Vibrio cholerae,
Shigella sp., Salmonella sp.,
Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Yersinia enterolitica, Klebsiella pnemoniae,
Vibrio haemolyticus. Namun menurut Dzulkarnain (1996) kasus diare di Indonesia lebih
sering disebabkan oleh Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae,
Salmonella sp., selain Shigella sp., dan
Campylobacter. Dari percobaan binatang yang diinfeksi dengan Salmonella typhimurium
menunjukkan perubahan-perubahan pada cairan ileum, transport elektrolit dan terjadi
perangsangan enzim adenil siklase dan peningkatan siklik AMP intraseluler sehingga
menyebabkan sekresi cairan dan diare.
Pengobatan diare dilakukan dengan pengobatan simtomatik dan pengobatan kausatif.
Untuk pengobatan kausatif kuman penyebabnya dimatikan dengan zat antibakteri. Hasil
survei kesehatan rumah tangga antara lain menunjukkan bahwa penggunaan tumbuhan
obat untuk mengobati diare pada anak Balita sebesar 4% (Anonim, 1992 dalam Winarno
& Sundari, 1996). Tumbuhan obat tersebut menurut Lozoya et al (1994) antara lain
adalah daun Psidium guajava L.
Penelitian tentang efek spasmolitik telah dilakukan oleh Morales et al. (1994), tentang
penghambatan ileum pada marmut oleh Lozoya et al. (1994). Tampaknya daun Psidium
guajava L. telah terbukti sebagai antidiare. Akan tetapi karena diare dapat disebabkan
oleh infeksi kuman, apakah daun tersebut juga mampu untuk mematikan kuman
penyebabnya. Ajizah (1998) telah membuktikan bahwa Enteropathogenic Escherichia
coli dapat dihambat pertumbuhannya oleh ekstrak daun Psidium guajava L.
Dipertanyakan apakah kemampuan ini juga berakibat terhadap pertumbuhan Salmonella
typhimurium,
mengingat kedua kuman ini sama-sama tergolong dalam Enterobacteriaceae.
D. Alat dan Bahan
Cawan petri, pembakar bunsen, beaker glass, gelas ukur, gelas pengaduk, pinset, gunting,
kertas cakram, incubator, penggaris, nutrient agar, aquades, bahan uji.
E. Prosedur Kerja
1. Inokulasi jenis bakteri yang akan diuji ke dalam cawan petri yang berisi media NA cair
yang bersuhu ± 450C lalu diratakan agar suspensi tercampur rata dengan media NA.

2. Mengambil kertas cakram dengan pinset, kemudian celupkan pada bahan uji yang telah
di sediakan.

3. Meletakkan kertas cakram yang te;ah direndam tadi pada lempeng agar sebanyak 3
buah dan perhatikan jarak antara cakram harus cukup jauh.

4. Lakukan inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 370C.

5. Mengamati pertumbuhan koloni pada lempeng agar, dengan mengukur diameter
bagian yang tidak ditumbuhi bakteri disekitar kertas cakram.
6. Menentukan apakah jenis bkteri tersebut peka atau resisten.
F. Hasil Pengamatan

Hasil pengukuran kerapatan optik bakteri Salmonella typhimurium dengan

spektrofotometer disetarakan terlebih dulu dengan jumlah mikroorganisme (CFU/ml)
untuk memperoleh jumlah hitung bakteri hidup,semakin kecil konsentrasi, yang berarti
semakin sedikit jumlah zat aktif yang terlarut di dalam ekstrak, semakin rendah
kemampuan dalam menghambat pertumbuhan suatu bakteri.dan dari hasil pengamatan
kami dengan menggunakan antibiotik amoxixilin kami tidak melihat adanya resistensi
bakteri terhadap ekstrat tersebut , tapi hal ini dikarenakan kurang telitinya kami dalam
melakukan praktikum karena kertas cakram yang akan kami funakan kami hanya
merendamnya sesingkat mungkin jadi itu yang membuat bakteri tetap bisa menembus
dinding antibiotik amoxixilin.
G. Pembahasan
Kelinieran nilai kerapatan optik bakteri terhadap konsentrasi ekstrak mengindikasikan
bahwa keragaman variabel kerapatan optik bakteri disebabkan perubahan variabel
konsentrasi perlakuan. Semakin tinggi konsentrasi semakin kecil kerapatan optik, yang
berarti semakin sedikit jumlah bakteri yang mampu bertahan hidup. Ini menunjukkan
bahwa dengan meningkatnya konsentrasi semakin besar kadar bahan aktif yang berfungsi
sebagai antibakteri, sehingga kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri
juga semakin besar. Kemampuan suatu bahan antimikroba dalam meniadakan
kemampuan hidup mikroorganisme tergantung pada konsentrasi bahan antimikroba itu .
Artinya jumlah bahan antimikroba dalam suatu lingkungan kuman sangat menentukan
kehidupan kuman yang terpapar.
Hal ini terlihat pada konsentrasi ekstrak bawah putih nilai kerapatan optik paling rendah
(0%) .
Selain faktor konsentrasi, jenis bahan antimikroba juga menentukan kemampuan
menghambat pertumbuhan kuman. Dalam penelitian ini diduga kepekaan bakteri
Salmonella typhimurium karena adanya kandungan zat kimiawi dalam ekstrak daun
Psidium guajava yang dapat bersifat antibakteri.
Daun Psidium guajava mengandung antara lain tanin, minyak atsiri, flavonoid, ursolic,
oleanolic, karoten, vitamin B1, B2, B3, B6, dan vitamnin C serta resin, selain avicularin
dan guaijaverin .Adanya minyak atsiri dalam kunyit diduga bersifat antibakteri. Minyak
atsiri dapat menghambat pertumbuhan atau mematikan kuman dengan mengganggu
proses terbentuknya membran dan/atau dinding sel;
membran atau dinding sel tidak terbentuk atau terbentuk tidak sempurna. Tanin
mempunyai sifat sebagai pengelat berefek spasmolitik, yang menciutkan atau
mengkerutkan usus sehingga gerak peristaltik usus berkurang. Akan tetapi, efek
spasmolitik ini juga mungkin dapat mengkerutkan dinding sel atau membran sel sehingga
mengganggu permeabilitas sel itu sendiri. Akibat terganggunya permeabilitas, sel tidak
dapat melakukan aktivitas hidup sehingga pertumbuhannya terhambat atau bahkan mati.
Dengan demikian diduga penghambatan pertumbuhan Salmonella typhimurium juga
mungkin oleh adanya kandungan alkaloid pada antibiotik amoxixilint . Flavonoid
merupakan kelompok senyawa fenol terbesar di alam. Flavonoid dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Diduga penghambatan pertumbuhan
Salmonella typhimurium juga karena ada efek fenolik dari flavonoid yang terdapat di
dalam antibiotik amoxixilin. Senyawa avicularin dan guaijaverin, yaitu suatu glikosida
dari quersetin juga diduga turut mempengaruhi penghambatan pertumbuhan Salmonella
typhimurium, namun belum diketahui dengan pasti mekanismenya.
H. Jawaban Pertanyaan
1. Sensivitas bakteri adalah kepekaan kuman terhadap antibiotika dari bahan klinik.
I. Kesimpulan
Pertumbuhan Salmonella typhimurium secara in vitro dapat dihambat dengan ekstra
kunyit dan pada antibiotik amoxixilin ternyata bakteri tidak resisten terhadap ekstrat
tersebut hal ini di buktikan dengan masih adanya bakteri yang tumbuh disekitar ekstra
tersebut.
J. Daftar Pustaka
Achmad SA. 1986. Kimia Organik Bahan Alam. Penerbit Karunika, Jakarta.
Ajizah A. 1998. Sensitivitas Enteropathogenic Escherichia coli terhadap Daun
Psidium guajava L. secara in Vitro. FKIP Unlam Banjarmasin (tidak
dipublikasikan).
Anonim, 1985. Cara Pembuatan Simplisia. Depkes RI. Jakarta.
Anonim, 1995. Farmakope Indonesia. Edisi ke-4. Departemen Kesehatan RI,
Jakarta
PRAKTIKUM IX
A. Judul Praktikum:
Pembuatan Sediaan Mikroskopik
B. Tujuan Praktikum :
Mempelajari cara menyiapkan sediaan mikroskopik dengan baik, sebagai prasyarat untuk
berbagai pewarnaan.
C. Dasar Teori
Pewarnaan mikroba sangat bergantung pada sedian mikroskopik ini sehingga untuk
melakukannya membutuhkan ketelitian dan juga pengalaman. Olesan yang dibuat jangan
terlalu tebal atau tipis. Pada olesan – olesan yang tebal sel – sel bakteri akan bertumpuk –
tumpuk sehingga sulit untuk menentukan bentuk sel secara individu. Olesan juga tidak
boleh terlalu tipis karena dapat menyulitkan pengamatan secara mikroskopik. Jika
menggunakan biakan yang berasal dari medium padat maka olesannya cenderung tebal
sedangkan jika menggunakan biakan yang berasal dari medium cair maka olesannya
cenderung tipis.
Selain pembuatan preparat oles hal lain yang dapat mempengaruhi pewarnaan mikroba
adalah tempat untuk meletakkan olesan tadi ( kaca objek ). Yang perlu diperhatikan pada
kaca objek ini adalah goresan yang terdapat pada permukaannya. Sebaiknya kaca objek
yang digunakan tidak memiliki goresan dan juga harus dalam keadaan steril sehingga
sebelum digunakan kaca objek harus dibersihkan dulu dengan menggunakan alkohol.
Jika kaca objek tidak dalam keadaan steril maka akan menganggu proses pengamatan
karena akan mikroba – mikroba yang terdapat pada kaca objek yang tidak bersih akan
bercampur dengan mikroba yang akan diteliti sehingga pengamatan akan menjadi kacau.
Setelah proses pembuatan preparat oles selesai langkah selanjutnya adalah memfiksasi
olesan tersebut diatas api dari pembakar Bunsen. Fiksasi perlu dilakukan karena
berfungsi sebagai berikut :
1. Merekatkan sel mikroba pada gelas objek
2. Membunuh mikroba tanpa merusak struktur dan bentuknya
3. Mengubah afinitas ( daya ikat ) zat warna
4. Membuat sel – sel mikroba lebih kuat ( keras )
5. Melepaskan granuler ( butiran ) protein menjadi gugus reaktif ( NH3+) yang akan
bereaksi dengan gugus OH- dari zat warna
6. Mencegah otolisi sel
7. Mempertinggi sifar reaktif gugus tertentu
D. Alat dan Bahan
Objek gelas, biakan bakteri muda (24-48 jam). Alcohol, kapas, jarum inokulasi, pipet
tetes, pembakar Bunsen.
E. Prosedur kerja
1. Membersihkan objek gelas hingga bebas lemak dengan kapas beralkohol.

2. Meneteskan satu tetes aquades dengan menggunakan pipet tetes pada objek gelas
tersebut.

3. Memijarkan jarum inokulasi dan dinginkan.

4. Mengambil biakan bakteri dengan jarum inokulasi tersebut, kemudian campurkan

dengan tetesan aquades pada objek gelas, sebarkan suspense tersebut sehingga menjadi
sediaan yang tipis dalam bentuk lingkaran kira-kira sebesar uang logam 25 rupiah.

5. Mengeringkan sediaan tersebut dengan melewatkan objek gelas bagian bawahnya

diatas api sebanyak 3 kali, cara ini disebut fiksasi panas. Ada juga sediaan yang difiksasi
dengan motif alcohol atau bahan kimia lain.

6. Mengunakan sediaan mkroskopik di atas untuk proses pewarnaan selanjutnya.

F. Hasil Pengamatan

Gambar di atas merupakan gambar dari media yang siap untuk dilakukan uji coba.
G. Pembahasan
Media mikroskopik adalah media yang digunakan untuk mendeteksi jenis bakteri dengan
cara pewarnaan bakteri baik bakteri gram positif maupun gram negative bahkan
digunakan juga untuk pewarnaan endospora.
Setelah media dibuat dan diseterilkan media siap untuk digunakan dalam percobaan
pewarnaan gram dan pewarnaan endospora.
H. Jawaban Pertanyaan
Fiksasi Panas adalah suatu cara yang digunakan untuk menseterilkan media dengan cara
melewatkan meletakkan sel pd gelas obyek tujuannya adalah untuk membunuh mikroba
dan mikroba yang mati lebih mudah diwarnnai dan tidak merusak mikroba.
I. Kesimpulan
Pembuatan media mikroskopik dilakukan dengan cara fiksasi panas. Fiksasi Panas adalah
suatu cara yang digunakan untuk menseterilkan media dengan cara melewatkan media di
atas api yang membara. Dan tujuan dari fiksasi panas adalah untuk memetikan bakteri
tanpa merusak bakteri tersebut.
Setelah media dipanaskan dengan cara fiksasi panas media siap dipakai untuk percobaan
dalam pewarnaan gram dan pewarnaan endospora.

J. Daftar Pustaka
Dwidjoseputro, D. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Penerbit
Djambatan, Jakarta
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta.
K. Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang
Prescott, LM; John PH; Donald AK. 2002. Microbiology 5th edition. McGraw-Hill
Company. New York.
Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press
: Yogyakarta
PRAKTIKUM X
A. Judul Praktikum:
PEWARNAAN GRAM
B. Tujuan Praktikum :
Mengetahui perbedaan bakteri gram positif dengan gram negatif
C. Dasar Teori
Bila suatu jenis bakteri dilihat dengan mikroskpop tanpa diwarnai, memang dapat dilihat,
tetapi karena ukurannya kecil dan bening (tidak berwarna) maka sukar sekali untuk bisa
dilihat dengan teliti. Agar dapat dilihat dengan jelas, supaya dapat dipelajari dengan
sebaik-baiknya, maka sebelum dilihat bakteri harus diwarnai terlebih dahulu.
Salah satunya dengan pewarnaan gram.
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini,
olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal
violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya
berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus
dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi
menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri
Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi
zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan
tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur
kimiawi dinding selnya.
Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal
dibandingkan pada dinding gram negatif.
Tujuan dari pewarnaan yaitu:
Mempermudah melihat bentuk jasad bakteri, ragi atau jamur.
Memperjelas ukuran dan btk jasad
Melihat struktur luar atau dalam
Melihat reaksi jasad terhdp pewarnaan
D. Alat dan Bahan
1. Alkohol 96 %,
2. Aquades,
3. Lugol ( mordan ),
4. Ungu violet,
5. Dan safranin.
E. Prosedur Kerja
1. Menetesi sediaan dengan 2 – 3 tetes ungu violet, larutan zat warna harus menutupi
seluruh permukaan sediaan dan membiarkannya selama 1 menit.

2. Membilas sediaan dengan air kemudain mengeringkan sediaan tersebut di udara atau
dengan menggunakan kertas isap.

3. Menetesi dengan larutan lugol ( mordan ) dan membiarkan selama 2 menit, mencuci
dengan air dan mengeringkannya.

4. Kemudian mencuci dengan larutan peluntur ( entanol 95 % ) selama ± 30 detik .

5. Memberi larutan cap penutup ( safranin ) selama 30 detik , mencuci dengan air lalu
mengeringkannya di udara.

6. Mengamati sediaan dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif dengan

perbesaran besar yang terlebih dulu menetesi sediaan dengan minyak imersi.
F. Hasil Pengamatan

Waktu pengamatan Warna bakteri/perbesaran Bentuk bakteri/perbesaran

22 april 2010 Bakteri berwarna merah keunguan hampir merah muda dengan
menggunakan perbesaran 100x Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk
dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang
dengan menggunakan perbesaran 100x
G. Pembahasan
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif
dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga
pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai
dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula
penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora
Pada prokariota umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana.
Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan
menjadi dua kelompok yaitu :
1. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang
tebal dan asam teichoic.
2. Bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan
lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan
membran sitoplasmik).
Pada bakteri patogen (pembawa penyakit) biasanya terdapat kapsul atau lapisan lendir
yang membantu pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan biofilm formation. Bakteri
juga memiliki kromosom, ribosom dan beberapa spesies lainnya memiliki granula
makanan, vakuola gas dan magnetosom.
Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:
• Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai
beberapa variasi sebagai berikut:
o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal
o Diplococcus, jka bergandanya dua-dua
o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujursangkar
o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus
o Staphylococcus, jika bergerombol
o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai
• Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan
mempunyai variasi sebagai berikut:
o Monobasil, jika hanya berbentuk satu batang
o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua
o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai
• Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi
sebagai berikut:
o Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran
o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan teknik pewarnaan gram yang ditujukan
untuk mengetahui perbedaan bakteri gram positif dan gram negative. Yang menjadi
bakteri sebagai bahan uji pada praktikum kali ini adalah bakteri Escherichia coli .
Pewarnaan gram ini menggunakan 4 macam pewarna dengan fungsi yang berbeda. Proses
perwarnaan itu sendiri dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup
dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades
steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah
diamati dan difiksasi Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat
menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api yang
bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan
struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas
pewarna (Tortora, 2002).
Proses pewarnaan bakteri diawali dengan kristal violet dan didiamkan selama satu menit.
pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri
sehingga pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah perlakuan
pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan atu dengan
menggunakan kertas isap. Setelah itu ditetesi dengan lugol dan dibiarkan selama 2 menit,
kemudian dicuci dan dikeringanginkan, setelah itu tetesi dengan larutan peluntur (etanol
95%) atu dapat menggunakan alcohol 75 %, tetes demi tetes. Hal ini dimaksudkan karena
alkohol dapat membuat bakteri tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat
sebelumnya, dilakukan selama 30 detik agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak
ada yang tersisa. dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera
kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang
baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 x agar dapat
mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu,
sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.
Sesuai dengan tujuan pewarnaan gram tersebut praktikan mendapatkan hasil :
Bakteri Escherichia coli setelah diwarnai menunjukkan warna keunguan yang hampir
menyerupai merah muda. Berdasarkan literatur hal ini menandakan bahwa bakteri
Escherichia coli merupakan bakteri dengan gram negatif karena gram negatif tidak
mempertahankan zat warna metil ungu. Pewarna penimbal setelah diberikan metil ungu
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Karakter warna yang berbeda ini terjadi karena terdapatnya perbedaan struktur dinding
sel masing-masing bakteri dan responnya terhadap sifat asam-basanya. Karena pada
dasarnya pewarnaan ini melibatkan adanya ion antara komponen selular dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan
adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.Pewarna asam
dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna
asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna.
Sementara Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga
akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat.
Selain digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif ,
percobaan ini juga ditujukkan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susunan
sel. Berdasarkan hasil pengamatan, didapat bahwa :
Bakteri Escherichia coli Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan
jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang, sesuai
dengan karakteritik Escherichia coli berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai
bakteri yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif (kenneath,
2008) Koloninya tersusun seperti rantai memanjang sama seperti yang terlihat di kaca
preparat dengan pembesaran 100x.
Klasifikasi Escherichia coli.
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escheriachia
Spesies : E. coli
H. Jawaban Pertanyaan:
1.) Fiksasi : - meletakkan sel pd gelas obyek
-membunuh mikroba yg mati lbh mudah diwarnai
Peluntur warna : - Melunturkan warna yg sudah diwarnai agar menghslkan warna kontras
dan membedakan kel mikroba(alkohol, KOH, HCl)
Subtrat : -Tergantung kand sel: KH, prot, lemak dan asam nukleat
-sel asidofilik, sel basidofilik dan sudanofilik.
Intensifikasi pewarnaan : - Mempercepat pewarnaan mikroba
- penambahan mordan
2.) 2 mekanisme pewarnaan mikroba yaitu:
a. Pewarnaan Sederhana: dengan satu warna
Ex: Metylin blue
b. Pewarnaan Bertingkat: dengan beberapa warna
Ex: Pewarnaan Gram, struktur sel,tahan asam

I. Kesimpulan
• Untuk mengelompokkan bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dapat dilakukan
dengan teknik pewarnaan yang disebut pewarnaan gram. Dengan pewarnaan gram bakteri
dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.
Teknik pewarnaan gram berproses pada kemampuan sel yang menahan (mengikat) warna
ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi dengan alkohol. Bakteri gram positif
tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet sehigga
pada tahap akhir bakteri gram positif berwarna ungu seperti contohnya Staphlococcus
aereus sedangkan bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol sehingga
pada tahap akhir pewarnaan terwarnai menjadi kemerahan karena bakteri gram negatif
tidak mempertahankan zat warna ungu kristal violet seperti contohnya Escherichia coli.
• Dengan pewarnaan gram ini juga dapat membedakan bentuk-bentuk bakteri. Ada yang
berbentuk bola (coccus) dan ada juga yang berbentuk batang/ silinder (bacillus).
• -Dalam teknik pewarnaan gram ini dilakukan dengan melalui:
1. Pewarnaan primer menggunakan kristal violet.
2. Pengikatan warna dengan cara didiamkan.
3. Pencucian warna menggukan air.
4. Pewarna pengganti menggunakan larutan lugol.
5. pencucian dengan larutan peluntur (etanol 95%)
6. pemberian larutan penutup (safranin)

J. Daftar Pustaka
Pelczar J. Michael dan e.s.c Chan, 2006, dasar-dasar mikrobiologi, UIP : Jakarta
http://otetatsuya.wordpress.com/2008/12/24/efek-antibakteri-ekstrak-jahe-zingiber-
officinale-roxb-dalam-menghambat- pertumbuhan-koloni-bakteri-escherichia-coli-dan-
bacillus-subtilis/ , diakses pada tanggal 25 oktober 2009
http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20090426032325AA0leMk, diakses
pada tanggal 25 oktober 2009
http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 25
oktober 2009
http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 27
oktober 2009
http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/, diakses pada tanggal
27 oktober 2009
PRAKTIKUM XI

A. Judul : PEWARNAAN ENDOSPORA

B. Tujuan Praktikum
Mengetahui adanya endospora pada bakteri
C. Dasar Teori
Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan
terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri.
Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi genetik, dan ribosom. Dinding
endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap
kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan
menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru (mapok, 2008).
Anggota Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya.
Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya
bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering,
dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah
membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan
tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan
sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel
vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora.
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali
diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode
pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai
dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green
dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat
berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci
dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau
pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya .
D. Alat dan Bahan
1. Gelas objek,
2. Gelas penutup,
3. Akuades steril,
4. Lampu Bunsen,
5. Penangas air,
6. Mikroskop,
7. Jarum ose,
8. Biakan Bacillus sp
9. Pewarna malakit hijau,
10. Dan pewarna safranin.
E. Prosedur Kerja
1. Membuat sediaan mikroskopik seperti pada pewarnaan gram.
2. Menetesi sediaan tersebut pewarna malakit hijau. Memasukkan pewarna ini kedalam
endospora di bantu dengan cara memanaskan preparat sediaan ini dengan melekatkan
pada ram kawat di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air. Pemanasan dapat
juga langsung dilakukan di atas api Bunsen sampai beruap.

3. Pemanasan diatur supaya jangan sampai mendidih atau mengering. Selama pemanasan
dapat ditambahkan beberapa tetes larutan pewarna untuk menjaga dari kekeringan.

4. Preparat ini harus terjaga dalam keadaan tergenang pewarnaan malakit hijau panas
selama 10 menit.

5. Meletakkan preparat yang telah diwarnai tersebut di atas rak dan membiarkan sampai
dingin.
6. Mencuci kelebihan pewarna dengan air mengalir dari botol semprot, kemudian
dikeringkan.
7. Mengenangi preparat dengan pewarna safranin selam 1- 2 menit , mencuci dengan air
mengalir seperti diatas kemudian dikeringkan.
8. Meniriskan kaca objek dan menyerapkan sisa air dari preparat dengan kertas hisap.
9. Mengamati struktur spora.Endospora akan tampak berwarna hijau sedangkan sel
vegetatif berwarna merah.

F. Hasil Pengamatan
Waktu pengamatan Warna endospora/perbesaran Bentuk bakteri/perbesaran
22 april 2010 Spora Bakteri Bacillus sp berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah
dengan menggunakan perbesaran 100x Berbentuk batang (bacillus) yang terbentuk
dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang
dengan menggunakan perbesaran 100x

G. Pembahasan
Bacillus sp smerupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus sp tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap
stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative
kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi
seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR).
4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu
mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel.
Berdasarkan hasil pengamatan terhadap pewarnaan endospora diketahui bahwa
endospora berwarna merah, dindingnya tebal dan dinding yang tebal ini digunakan untuk
melindunginya dari kondisi kekeringan, cahaya, dan suhu yang tidak menguntungkan.
Endospora tumbuh pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan, dan jika kondisi
sudah stabil akan membentuk sel vegetatif.
Endospora merupakan fase istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan
terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri.
Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi genetik, dan ribosom. Dinding
endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap
kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan
menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru (edukasi, 2008)
Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk
identifikasi. Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau
tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal
memiliki penngertian letak vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe
subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif.
Endospora dapat berukuran lebih besar ataupun kecil dari sel vegetatif yang terdiri dari
lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi
terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan
pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk
reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletk di subterminal
(Ncbi, 2008). Endospora berperan penting bagi kesehatan manusia dan dalam industri
pangan. Hal ini disebabkan ketahanannya terhadap proses yang secara normal akan
membunuh sel bakteri vegetatif, seperti proses pemanasan, pembekuan, pengeringan,
penggunaan bahan kimia (disinfektan) dan radiasi. Kebanyakan sel vegetatif akan mati
dengan temperatur di atas 70° Celsius, sedangkan endospora dapat bertahan hidup dalam
air mendidih untuk beberapa jam atau lebih (Naim, 2008).
Lapisan paling luar dari spora yaitu eksosporium, bervariasi dalam ukuran di antara
spesies bakteri pembentuk spora. Di bawah eksosporium terdapat coat. Kompleksitas dari
struktur coat juga bervariasi di antara spesies. Coat akan melindungi korteks spora (spore
cortex) dari kerusakan yang disebabkan oleh enzim-enzim yang bersifat melisis. Coat
juga kemungkinan berfungsi sebagai pertahanan awal terhadap bahan-bahan kimia seperti
agen oksidasi. Di bawah coat adalah outer forespore membrane. Membran ini merupakan
membran fungsional dalam perkembangan forespore dan mungkin juga dalam
perkembangan spora. Membran ini kemungkinan memiliki peran besar pada sifat
impermeabilitas ekstrem dari spora terhadap molekul-molekul kecil. Komposisi protein
dari membran ini berbeda dari komposisi protein pada inner forespore membrane. Di
bawah outer forespore membrane merupakan korteks spora.
Korteks mengandung lapisan peptidoglikan yang tebal yang strukturnya mirip dengan
peptidoglikan dinding sel vegetatif, tetapi memiliki beberapa perbedaan. Peptidoglikan
korteks selalu mengandung diaminopimelic acid, sedangkan peptidoglikan dinding sel
vegetatif mengandung lisin. Korteks spora merupakan struktur yang bertanggung jawab
terhadap dehidrasi dari spore core dan resistensi spora. Di antara korteks dan inner
forespore membrane terdapat germ cell wall. Strukturnya mungkin identik dengan yang
terdapat pada sel vegetatif. Struktur selanjutnya adalah inner forespore membrane,
merupakan barrier permeabilitas yang sangat kuat terhadap molekul hidrofilik dan
molekul dengan berat molekul $> 150 (Naim, 2008).
Bagian sentral dari spora yang disebut dengan core mengandung materi genetik DNA,
ribosom, enzim, dipicolinic acid, dan kation divalen seperti kalsium. Kandungan air pada
core sangat rendah, bila pada sel vegetatif kandungan airnya 4 gram per gram berat
kering, maka pada core hanya 0.4 sampai 1 gram per gram berat kering. Kandungan air
yang rendah ini diduga memiliki peran utama bagi spora untuk bertahan hidup dalam
keadaan dormant dan juga untuk resistensi spora terhadap sejumlah agen (Naim, 2008).
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali
diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode
pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai
dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green
dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat
berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci
dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau
pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya .

H. Jawaban Pertanyaan
1. Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik terhadap bahan kimia,
sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan cara dpanaskan.
Pemanasan ini menyebabkan lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat
masuk.
I. Kesimpulan
Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan
terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri.
Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi genetik, dan ribosom. Dinding
endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap
kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan
menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru (mapok, 2008).
Bakteri Bacillus sp memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam
keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun.
Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai,
spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin
tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna
yang diberikan kemudian.
Metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora.
menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya .

J. Daftar Pustaka
Dwidjoseputro, D. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Penerbit
Djambatan, Jakarta
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta.
Prescott, LM; John PH; Donald AK. 2002. Microbiology 5th edition. McGraw-Hill
Company. New York.
Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press
: Yogyakarta
Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang
Diposkan oleh Cindra di 02.03
http://cindradoankymailcom.blogspot.com/2010/07/laporan-praktikum-
mikrobiologi.html

The IMViC Tests The IMViC Pengujian

The IMViC tests are used to differentiate the enterics (Family Enterobacteriaceae).
Tes IMViC digunakan untuk membedakan enterics (Keluarga Enterobacteriaceae).
These are the Indole test (tryptone broth), the Methyl Red and Voges-Proskauer
tests (MRVP broth) and the Citrate test (Citrate agar slants). Ini adalah uji indol
(kaldu Trypton), Red dan Methyl-Proskauer tes Voges (MRVP kaldu) dan uji Sitrat
(Sitrat miring agar-agar). For these IMViC tests use the enterics Untuk tes ini
IMViC menggunakan enterics
E. coli and Enterobacter. Work in groups of 4-5 students. E. coli dan Enterobacter.
Bekerja dalam kelompok 4-5 siswa.
The significance of these tests is that when testing drinking water for the presence of
the sewage indicator E. Arti penting dari tes ini adalah bahwa ketika pengujian air
minum untuk kehadiran indikator limbah E. coli , one must be able to rule out
Enterobacter aerogenes . coli, seseorang harus mampu menyingkirkan Enterobacter
aerogenes.
E. aerogenes is not always associated with sewage, and its presence in water would
not necessarily indicate sewage contamination. aerogenes E. tidak selalu
berhubungan dengan limbah, dan kehadirannya di air tidak akan selalu
menunjukkan kontaminasi limbah.

CONTROLS Indole Methyl Red VP Citrate KONTROL VP Sitrat Indole Metil Merah

Escherica. Escherica. coli coli + ++ +- - - -

Enterobacter. Enterobacter. aerogenes - - - - + ++ +
aerogenes

===============================================================
======= ==================================================
====================

1. Indole test (tryptone broth) 1. Indole test (kaldu Trypton)

Procedure: Inoculate a loopful of bacteria into a tryptone broth. Prosedur:

Menyuntik loopful bakteri ke dalam kaldu Trypton. Incubate 48 hours.
Menetaskan 48 jam.

Description: Tryptophan hydrolysis -Some bacteria split

tryptophan into indole and pyruvic acid using the hydrolase called
tryptophanase. Keterangan: hidrolisis Tryptophan-Beberapa
bakteri split triptofan ke dalam dan piruvat asam indol
menggunakan hidrolase tryptophanase disebut. Indole can be
detected with Kovac's reagent (Indole reagent). Indol dapat
dideteksi dengan reagen Kovac's (Indole reagen). This test is very
important in differentiating E. Tes ini sangat penting dalam
membedakan E. coli (indole positive) from some closely related
enteric bacteria. coli (indol positif) dari beberapa enterik bakteri
terkait erat. It also differentiates Proteus mirabilis (indole
negative) from all other Proteus species (indole positive). Ini juga
membedakan Proteus mirabilis (indol negatif) dari semua spesies
Proteus lainnya (indol positif). Tryptone broth is used for this test
as it contains a large amount of tryptophan. Trypton kaldu
digunakan untuk tes ini karena mengandung sejumlah besar
triptofan.
 Interpretation: After incubation : The broth must be turbid.
Interpretasi: Setelah inkubasi: kaldu harus keruh. A clear broth
indicates that your organism did not grow and cannot be tested.
Sebuah kaldu jelas menunjukkan bahwa organisme Anda tidak
tumbuh dan tidak dapat diuji. Add a few drops of Indole reagent
to the broth culture (tryptone broth). Tambahkan beberapa tetes
pereaksi Indole ke budaya kaldu (kaldu Trypton). DO NOT
SHAKE THE TUBE. JANGAN SHAKE THE TUBE. A positive
result has a red layer at the top. Hasil positif memiliki lapisan
merah di bagian atas. A negative result has a yellow or brown
layer. Sebuah hasil negatif memiliki lapisan kuning atau coklat.

2. Methyl Red test (MRVP broth) 2 Merah. Metil uji (MRVP kaldu)

Procedure: Inoculate a loopful of bacteria into MRVP broth. Prosedur:

Menyuntik loopful bakteri ke dalam kaldu MRVP. Incubate 3 to 5 days.
Menetaskan 3 sampai 5 hari.

Description: Mixed acid fermentation - Many gram-negative

intestinal bacteria can be differentiated based on the products
produced when they ferment the glucose in MR-VP medium.
Escherichia, Salmonella , and Proteus ferment glucose to produce
lactic, acetic, succinic, and formic acids and CO 2 , H 2 , and
ethanol. Keterangan: Campuran fermentasi asam - Banyak negatif
usus bakteri gram dapat dibedakan berdasarkan produk yang
dihasilkan ketika mereka memfermentasi glukosa dalam medium
MR-VP asam. Coli, Salmonella, Proteus fermentasi dan glukosa
untuk laktat, asetat, suksinat dan formiat menghasilkan dan CO 2,
H 2, dan etanol. The large amounts of acids produced lowers the
pH of the medium - Methyl red (a pH indicator) will turn red
when added to the medium if the organism was a mixed acid
fermenter. Jumlah besar asam dihasilkan menurunkan pH medium
- Metil merah (indikator pH) akan berubah menjadi merah bila
ditambahkan ke media jika organisme adalah fermentasi asam
campuran. Many of these organisms also produce gas. Banyak
dari organisme ini juga menghasilkan gas.

Interpretation: After incubation : The broth must be turbid.

Interpretasi: Setelah inkubasi: kaldu harus keruh. A clear broth
indicates that your organism did not grow and cannot be tested.
Sebuah kaldu jelas menunjukkan bahwa organisme Anda tidak
tumbuh dan tidak dapat diuji. Remove 1 ml of broth and place into
 a sterile tube before performing the methyl red test if you are
going to use the same broth for the VP test. Hapus 1 ml kaldu dan
tempat ke dalam tabung steril sebelum melakukan uji merah metil
jika Anda akan menggunakan kaldu yang sama untuk uji VP. Add
3-4 drops of methyl red to the original broth. Tambahkan 3-4 tetes
metil merah ke kaldu asli. DO NOT SHAKE THE TUBE.
JANGAN SHAKE THE TUBE. A positive result has a distinct
red layer at the top of the broth. Hasil positif memiliki lapisan
merah yang berbeda di bagian atas kaldu. A negative result has a
yellow layer. Sebuah hasil negatif memiliki lapisan kuning.

3. Voges-Proskauer test 3. Voges-Proskauer tes  

Procedure: Inoculate a loopful of bacteria into MRVP broth. Prosedur:

Menyuntik loopful bakteri ke dalam kaldu MRVP. Incubate 3 to 5 days.
Menetaskan 3 sampai 5 hari.

Description: Organisms that are negative in the methyl red test

may be producing 2, 3 butanediol and ethanol instead of acids.
Keterangan: Organisme yang negatif dalam uji merah metil
mungkin memproduksi 2, 3 butanadiol dan etanol bukan asam.
These non-acid products do not lower the pH as much as acids do.
Enterobacter, Serratia and some species of Bacillus produce these
substances. Ini produk non-asam tidak menurunkan pH sebanyak
asam lakukan. Enterobacter, Serratia dan beberapa spesies dari
Bacillus menghasilkan zat-zat ini. There is no satisfactory test for
determining production of 2, 3 butanediol. Tidak ada tes yang
memuaskan untuk menentukan produksi 2 3 butanadiol,. A
precursor of 2,3 butanediol called acetoin can be detected with
Barritt's reagent. Sebuah prekursor 2,3 acetoin disebut butanadiol
dapat dideteksi dengan reagen Barritt's.

Interpretation: After incubation : Read the VP test when you

have good turbidity. Interpretasi: Setelah inkubasi: Baca uji VP
ketika Anda memiliki kekeruhan yang baik. A clear broth
indicates that your organism did not grow and cannot be tested.
Sebuah kaldu jelas menunjukkan bahwa organisme Anda tidak
tumbuh dan tidak dapat diuji. Barritt's reagent A (VP A) contains
naphthol and Barritt's B (VP B) contains KOH. Teman-reagen
Barritt A (VP A) berisi naphthol dan Barritt's B (VP B) berisi
KOH. Test 1 ml of your culture from the MRVP broth. Test 1 ml
budaya Anda dari kaldu MRVP. If you have already conducted
 the methyl red test, you should have already placed 1 ml of
untested broth in a sterile tube. Jika Anda telah melakukan uji
merah metil, Anda seharusnya sudah ditempatkan 1 ml kaldu
belum teruji dalam tabung steril. If you haven ' t done this, do so
now. Jika Anda 't haven melakukan hal ini, lakukan sekarang. Add
the entire contents of the VP A reagent (15 drops) and 5 drops of
the VP B reagent to the 1 ml of your broth culture. Tambahkan isi
seluruh VP A reagen (15 tetes) dan 5 tetes reagen B VP untuk ml
kaldu 1 budaya Anda. SHAKE WELL. SHAKE WELL. This
reaction will take a few minutes before you will see a color
change. Reaksi ini akan memakan waktu beberapa menit sebelum
Anda akan melihat perubahan warna. SHAKE the tube every few
minutes for best results. SHAKE tabung setiap beberapa menit
untuk hasil terbaik. With a positive reaction the medium will
change to pink or red indicating that acetoin is present. Dengan
reaksi positif media tersebut akan berubah menjadi merah muda
atau merah menunjukkan acetoin yang hadir. With a negative
reaction the broth will not change color or will be copper colored.
Dengan reaksi negatif kaldu tidak akan berubah warna atau akan
tembaga berwarna. Wait at least 15 minutes for color to develop
before calling the test negative. Tunggu minimal 15 menit untuk
warna untuk mengembangkan sebelum memanggil tes negatif.

4. Citrate test (Simmon's Citrate slant) 4. Sitrat tes (Simmon's Citrate miring)

Procedure: Streak a loopful of bacteria onto a citrate agar slant, do

not stab the butt. Prosedur: Streak suatu loopful bakteri pada suatu
pandangan agar-agar sitrat, jangan menusuk pantat. Incubate 24 to
48 hours, longer for Bacillus species. Menetaskan 24 sampai 48
jam, lebih lama bagi spesies Bacillus. Incubate with a loose cap.
Mengeram dengan topi longgar.

Description: Simmon's citrate agar tests for the ability of an

organism to use citrate as its sole source of carbon. Deskripsi:
Agar tes sitrat's Simmon untuk kemampuan organisme untuk
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tunggal. This media
contains a pH indicator called bromthymol blue. Media ini berisi
indikator pH disebut biru bromthymol. The agar media changes
from green to blue at an alkaline pH. Media agar-agar perubahan
dari hijau ke biru pada pH basa.
 Interpretation: After incubation : A positive reaction is indicated
by a slant with a Prussian blue color. Interpretasi: Setelah
inkubasi: Sebuah reaksi positif ditunjukkan dengan kemiringan
dengan warna biru Prusia. A negative slant will have no growth of
bacteria and will remain green. Sebuah pandangan negatif akan
memiliki pertumbuhan bakteri dan akan tetap hijau.

5. Other media: (not part of the IMViC test) . 5 Media lain: (bukan bagian
dari tes IMViC)

Eosine Methylene Blue (EMB) Agar Eosine Metilen Blue (EMB) Agar

Procedure: Streak for isolation. Prosedur: Streak untuk isolasi.

Description: A selective medium for gram-negative bacteria.

Keterangan: Sebuah media selektif untuk bakteri gram-negatif.
Levine ' s EMB agar contains methylene blue, which inhibits
gram-positive bacteria. Levine 's agar-agar EMB berisi biru
metilen, yang menghambat bakteri gram positif. Differential for
enterics: will differentiate lactose fermenters from nonfermenters.
Diferensial untuk enterics: akan membedakan fermentor laktosa
dari nonfermenters.

Interpretation: After incubation : Lactose nonfermenters will

have cream colored colonies. Interpretasi: Setelah inkubasi:
nonfermenters Laktosa akan memiliki koloni berwarna krim.
Lactose fermenters will have pinkish colonies, sometimes with
dark centers. E. fermentor Laktosa akan memiliki koloni merah
muda, kadang-kadang dengan pusat gelap. E. coli often has a
greenish metallic sheen. coli sering memiliki kilau metalik
kehijauan.

Eosine Methylene Blue (EMB) Agar Eosine Metilen Blue (EMB) Agar
This media selects for gram-negative organisms. Media ini memilih untuk organisme gram-negatif.
Lactose fermenters can be differentiated from nonfermenters by the color of the colonies. fermentor
Laktosa dapat dibedakan dari nonfermenters oleh warna koloni. Nonfermenters have a creamish
white colony. Nonfermenters memiliki koloni putih creamish. Fermenters have pink colonies often
with dark centers. Escherichiacoli often has a metallic green sheen, as seen on this Plate. Fermentor
memiliki koloni merah muda seringkali dengan pusat gelap. Escherichiacoli sering memiliki
kemilau hijau metalik, seperti yang terlihat pada Plate ini.
This is a lactose fermenter that does not produce the metallic green sheen. Ini adalah fermentor
laktosa yang tidak menghasilkan kemilau hijau metalik.

IMViC Tests Results Hasil

IMViC
Pengujian
Indole Test Uji indol
Bacteria were grown in tryptone
broth. Bakteri ditumbuhkan dalam
kaldu Trypton.
The uninoculated tube is on the left.
Tabung diinokulasi di sebelah kiri.
The positive indole test is in the
center. Uji indol positif di tengah.
The negative indole test is on the
right. Uji indol negatif adalah di
sebelah kanan.
Methyl Red (MR) Test Methyl Red
(MR) Test
Bacteria were grown in MRVP
broth. Bakteri ditumbuhkan dalam
kaldu MRVP.
The uninoculated tube is on the left.
Tabung diinokulasi di sebelah kiri.
The positive MR test is in the center.
Uji MR positif di tengah.
The negative MR test is on the right.
Uji MR negatif adalah di sebelah
kanan.
Voges-Praskauer (VP) Test Voges-
Praskauer (VP) Test
Bacteria were grown in MRVP
 broth. Bakteri ditumbuhkan dalam
kaldu MRVP.
The uninoculated tube is on the left.
Tabung diinokulasi di sebelah kiri.
The positive VP test in in the center.
Uji positif VP di di tengah.
The negative VP test is on the right.
Uji VP negatif adalah di sebelah
kanan.

Citrate test Sitrat uji

Bacteria were grown on Citrate
Agar slants. Bakteri ditumbuhkan
pada Agar miring Sitrat.
The uninoculated tube is on the left.
Tabung diinokulasi di sebelah kiri.
The positive Citrate test in in the
center. Uji positif Sitrat di di tengah.

The negative Citrate test is on the

right. Uji Sitrat negatif adalah di
sebelah kanan.

Motility Test Uji Motilitas

The two tubes on the left contain a nonmotile bacterial species. Kedua tabung di
sebelah kiri berisi spesies bakteri nonmotile. Notice the clearly visible line of
growth (streak line). Perhatikan garis terlihat jelas dari pertumbuhan (garis
gores).

The two tubes on the right contain a motile bacterial species. Kedua tabung di
sebelah kanan berisi spesies bakteri dapat bergerak. Notice the cloudy media and
the less distinct line of growth. Perhatikan berawan media dan garis yang
berbeda kurang pertumbuhan.