Anda di halaman 1dari 14

Bioteknologi Farmasi:

Polymerase chain reaction


Prof. Dr. Harrizul Rivai, M.S.
Guru Besar Kimia Farmasi
Fakultas Farmasi
Universitas Andalas

Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode yang banyak digunakan dalam biologi
molekuler untuk secara cepat menghasilkan jutaan hingga miliaran salinan sampel DNA
spesifik yang memungkinkan para ilmuwan mengambil sampel DNA yang sangat kecil dan
memperkuatnya ke jumlah yang cukup besar untuk dipelajari secara terperinci. PCR
ditemukan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis. Ini penting untuk banyak pengujian genetik
termasuk analisis sampel DNA purba dan identifikasi agen infeksi. Dengan menggunakan
PCR, salinan sekuens DNA dalam jumlah sangat kecil secara eksponensial diperkuat dalam
serangkaian atau siklus perubahan suhu. PCR sekarang merupakan teknik umum dan
seringkali sangat diperlukan yang digunakan dalam laboratorium medis dan penelitian
laboratorium klinis untuk berbagai aplikasi termasuk penelitian biomedis dan forensik
kriminal.[1] [2]

Sepotong terdari dari delapan tabung PCR, masing-masing berisi campuran reaksi 100 μl

Sebagian besar metode PCR mengandalkan siklus termal. Siklus termal memperlihatkan
reaktan ke siklus berulang pemanasan dan pendinginan untuk memungkinkan berbagai reaksi
bergantung pada temperatur - khususnya, peleburan DNA dan replikasi DNA yang
digerakkan oleh enzim. PCR menggunakan dua reagen utama - primer (yang merupakan
fragmen DNA untai tunggal pendek yang dikenal sebagai oligonukleotida yang merupakan
sekuens komplementer untuk daerah DNA target) dan DNA polimerase. Pada langkah
pertama PCR, dua untai heliks ganda DNA secara fisik dipisahkan pada suhu tinggi dalam
proses yang disebut denaturasi asam nukleat. Pada langkah kedua, suhu diturunkan dan
primer mengikat urutan sekuensing DNA. Kedua untai DNA kemudian menjadi templat

1
untuk DNA polimerase untuk secara enzimatik merakit untai DNA baru dari nukleotida
bebas, blok bangunan DNA. Ketika PCR berlangsung, DNA yang dihasilkan itu sendiri
digunakan sebagai templat untuk replikasi, mengatur reaksi berantai di mana templat DNA
asli diperkuat secara eksponensial.

Menempatkan strip delapan tabung PCR ke dalam siklus termal

Hampir semua aplikasi PCR menggunakan DNA polimerase yang tahan panas, seperti Taq
polimerase, enzim yang awalnya diisolasi dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Jika
polimerase yang digunakan rentan terhadap panas, ia akan mengalami denaturasi pada suhu
tinggi dari tahap denaturasi. Sebelum menggunakan Taq polimerase, DNA polimerase harus
secara manual ditambahkan setiap siklus, yang merupakan proses yang membosankan dan
mahal.[3]
Aplikasi teknik ini termasuk kloning DNA untuk sekuensing, kloning dan manipulasi gen,
mutagenesis gen; konstruksi filogeni berbasis DNA, atau analisis fungsional gen; diagnosis
dan pemantauan penyakit keturunan; amplifikasi DNA kuno;[4] analisis sidik jari genetik
untuk profiling DNA (misalnya, dalam sains forensik dan pengujian induk); dan deteksi
patogen dalam tes asam nukleat untuk diagnosis penyakit menular.
BAHAN KULIAH
1. Prinsip PCR
a. Prosedur
b. Tahapan
2. Optimasi
3. Aplikasi
a. Isolasi DNA selektif
b. Amplifikasi dan kuantifikasi DNA
c. Aplikasi medis dan diagnostik
d. Aplikasi penyakit menular
e. Aplikasi forensik
f. Aplikasi penelitian
4. Keuntungan
5. Keterbatasan

2
• Prinsip PCR
PCR menguatkan wilayah spesifik untai DNA (target DNA). Sebagian besar metode PCR
memperkuat fragmen DNA dengan panjang antara 0,1 dan 10 kilo basa (kbp), meskipun
beberapa teknik memungkinkan untuk memperbesar fragmen hingga 40 kbp.[5] Jumlah
produk yang diperkuat ditentukan oleh substrat yang tersedia dalam reaksi, yang menjadi
terbatas ketika reaksi berlangsung.[6]
Pengaturan PCR dasar memerlukan beberapa komponen dan reagen,[7] termasuk:
• templat DNA yang berisi wilayah target DNA untuk diperkuat
• DNA polimerase; enzim yang mempolimerisasi untai DNA baru; tahan panas Taq
polimerase sangat umum,[8] karena lebih cenderung tetap utuh selama proses
denaturasi DNA suhu tinggi
• dua primer DNA yang melengkapi ujung 3 '(tiga prima) dari masing-masing helai
indera dan anti-indra dari target DNA (DNA polimerase hanya dapat mengikat dan
memanjang dari daerah DNA beruntai ganda; tanpa primer di sana) tidak ada situs
inisiasi beruntai ganda di mana polimerase dapat mengikat);[9] primer spesifik yang
melengkapi wilayah target DNA dipilih sebelumnya, dan sering dibuat khusus di
laboratorium atau dibeli dari pemasok biokimia komersial.
• deoxynucleoside triphosphate, atau dNTPs (kadang-kadang disebut "deoxynucleotide
triphosphate"; nukleotida yang mengandung gugus trifosfat), blok bangunan tempat
DNA polimerase mensintesis untai DNA baru
• larutan penyangga yang menyediakan lingkungan kimia yang cocok untuk aktivitas
dan stabilitas optimal dari DNA polymerase
• kation bivalen, biasanya ion magnesium (Mg) atau mangan (Mn); Mg2+ adalah yang
paling umum, tetapi Mn2+ dapat digunakan untuk mutagenesis DNA yang dimediasi
PCR, karena konsentrasi Mn2+ yang lebih tinggi meningkatkan tingkat kesalahan
selama sintesis DNA[10]; dan kation monovalen, biasanya ion kalium (K+)
Reaksi umumnya dilakukan dalam volume 10-200 μL dalam tabung reaksi kecil (0,2-0,5 mL
volume) dalam siklus termal. Siklus termal memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi
untuk mencapai suhu yang diperlukan pada setiap langkah reaksi (lihat di bawah). Banyak
siklus termal modern memanfaatkan efek Peltier, yang memungkinkan pemanasan dan
pendinginan blok yang menahan tabung PCR hanya dengan membalikkan arus listrik.
Tabung reaksi berdinding tipis memungkinkan konduktivitas termal yang baik untuk
memungkinkan kesetimbangan termal yang cepat. Sebagian besar siklus termal memiliki
tutup yang dipanaskan untuk mencegah kondensasi di bagian atas tabung reaksi. Siklus
termal yang lebih lama tanpa tutup yang dipanaskan membutuhkan lapisan minyak di atas
campuran reaksi atau bola lilin di dalam tabung.

3
Siklus termal untuk PCR

Siklus termal tiga suhu yang lebih lama untuk PCR


1.1 Prosedur PCR
Biasanya, PCR terdiri dari serangkaian 20-40 perubahan suhu berulang, yang disebut siklus
termal, dengan setiap siklus biasanya terdiri dari dua atau tiga langkah suhu diskrit (lihat
gambar di bawah). Siklus sering didahului oleh satu langkah suhu tunggal pada suhu yang
sangat tinggi (> 90 °C (194 °F)), dan diikuti oleh satu penahan di ujungnya untuk
perpanjangan produk akhir atau penyimpanan singkat. Suhu yang digunakan dan lamanya
waktu mereka diterapkan dalam setiap siklus tergantung pada berbagai parameter, termasuk
enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion bivalen dan dNTP dalam reaksi,
dan suhu leleh (Tm) primer.[11] Langkah-langkah individual yang umum untuk kebanyakan
metode PCR adalah sebagai berikut:
• Inisialisasi: Langkah ini hanya diperlukan untuk DNA polimerase yang memerlukan
aktivasi panas oleh PCR yang baru mulai.[12] Ini terdiri dari memanaskan ruang reaksi
ke suhu 94-96 °C (201-205 °F), atau 98 °C (208 °F) jika polimerase yang sangat
termostabil digunakan, yang kemudian ditahan selama 1–10 menit.
• Denaturasi: Langkah ini adalah siklus reguler pertama dan terdiri dari memanaskan
ruang reaksi hingga 94–98 °C (201–208 °F) selama 20–30 detik. Ini menyebabkan

4
peleburan DNA, atau denaturasi, dari templat DNA untai ganda dengan memutus
ikatan hidrogen antara basa komplementer, menghasilkan dua molekul DNA untai
tunggal.
• Annealing: Pada langkah berikutnya, suhu reaksi diturunkan menjadi 50-65 °C (122–
149 °F) selama 20-40 detik, memungkinkan annealing primer untuk masing-masing
templat DNA untai tunggal. Dua primer yang berbeda biasanya dimasukkan dalam
campuran reaksi: satu untuk masing-masing dari dua pelengkap beruntai tunggal yang
mengandung daerah target. Primer adalah urutan untai tunggal sendiri, tetapi jauh
lebih pendek dari panjang wilayah target, hanya melengkapi urutan sangat pendek di
ujung 3' dari setiap untai.
Sangat penting untuk menentukan suhu yang tepat untuk langkah annealing karena efisiensi
dan spesifisitas sangat dipengaruhi oleh suhu annealing. Temperatur ini harus cukup rendah
untuk memungkinkan hibridisasi primer ke untai, tetapi cukup tinggi untuk hibridisasi
menjadi spesifik, yaitu, primer harus mengikat hanya pada bagian komplemen sempurna dari
untai, dan tidak di tempat lain. Jika suhunya terlalu rendah, primer dapat mengikat secara
tidak sempurna. Jika terlalu tinggi, primer mungkin tidak mengikat sama sekali. Suhu
annealing yang khas adalah sekitar 3-5 °C di bawah Tm dari primer yang digunakan. Ikatan
hidrogen yang stabil antara basa komplementer terbentuk hanya ketika urutan primer sangat
cocok dengan urutan template. Selama langkah ini, polimerase berikatan dengan hibrid
primer-templat dan memulai pembentukan DNA.
• Ekstensi/perpanjangan: Suhu pada langkah ini tergantung pada DNA polimerase yang
digunakan; suhu aktivitas optimal untuk polimerase DNA termostabil dari Taq
(Thermus aquaticus) polimerase adalah sekitar 75–80 °C (167–176 °F),[13] [14]
meskipun suhu 72 °C (162 °F) adalah umum digunakan dengan enzim ini. Pada
langkah ini, DNA polimerase mensintesis untai DNA baru yang saling melengkapi
dengan untai templat DNA dengan menambahkan dNTPs bebas dari campuran reaksi
yang komplementer dengan templat dalam arah 5' -ke- 3 ', mengkondensasi gugus 5'-
fosfat dari dNTPs dengan gugus 3'-hidroksi di ujung untai DNA yang baru lahir
(memanjang). Waktu tepat yang diperlukan untuk perpanjangan tergantung pada
DNA polimerase yang digunakan dan pada panjang daerah target DNA untuk
diperkuat. Sebagai aturan praktis, pada suhu optimal, sebagian besar polimerase DNA
mempolimerisasi seribu basa per menit. Dalam kondisi optimal (mis., Jika tidak ada
batasan karena membatasi substrat atau reagen), pada setiap langkah
perluasan/perpanjangan, jumlah urutan target DNA menjadi dua kali lipat. Dengan
setiap siklus yang berurutan, untaian templat asli ditambah semua untai yang baru
dihasilkan menjadi untai templat untuk putaran perpanjangan berikutnya, yang
mengarah ke amplifikasi eksponensial (geometris) dari wilayah target DNA spesifik.
Proses denaturasi, annealing dan perpanjangan merupakan satu siklus. Diperlukan
beberapa siklus untuk memperkuat target DNA menjadi jutaan salinan. Rumus yang
digunakan untuk menghitung jumlah salinan DNA yang terbentuk setelah sejumlah siklus
tertentu adalah 2n, di mana n adalah jumlah siklus. Dengan demikian, reaksi yang
ditetapkan untuk 30 siklus menghasilkan 230, atau 1073741824, salinan daerah target
DNA untai ganda.

5
• Perpanjangan akhir: Langkah tunggal ini opsional, tetapi dilakukan pada suhu 70-74
°C (158–165 °F) (kisaran suhu yang diperlukan untuk aktivitas optimal sebagian besar
polimerase yang digunakan dalam PCR) selama 5–15 menit setelah siklus PCR
terakhir untuk memastikan bahwa DNA untai tunggal yang tersisa sepenuhnya
memanjang.
• Penahanan terakhir: Langkah terakhir mendinginkan ruang reaksi hingga 4–15 °C
(39–59 °F) untuk waktu yang tidak terbatas, dan dapat digunakan untuk penyimpanan
jangka pendek produk PCR.

Untuk memeriksa apakah PCR berhasil menghasilkan wilayah target DNA yang diantisipasi
(juga kadang-kadang disebut sebagai amplimer atau amplikon), elektroforesis gel agarosa
dapat digunakan untuk pemisahan ukuran produk PCR. Ukuran produk PCR ditentukan
dengan perbandingan dengan tangga DNA, penanda berat molekul yang mengandung
fragmen DNA dengan ukuran yang diketahui dijalankan pada gel di samping produk PCR.

Produk PCR bernoda etidium bromida setelah elektroforesis gel. Dua set primer digunakan
untuk memperkuat urutan target dari tiga sampel jaringan yang berbeda. Tidak ada
amplifikasi dalam sampel # 1; Pita DNA dalam sampel # 2 dan # 3 menunjukkan
keberhasilan amplifikasi urutan target. Gel juga menunjukkan kontrol positif, dan tangga
DNA yang mengandung fragmen DNA dengan panjang yang ditentukan untuk mengukur
band pada PCR eksperimental.

6
1.2 Tahapan Reaksi PCR
Seperti halnya reaksi kimia lainnya, laju reaksi dan efisiensi PCR dipengaruhi oleh faktor
pembatas. Dengan demikian, seluruh proses PCR selanjutnya dapat dibagi menjadi tiga tahap
berdasarkan kemajuan reaksi:
• Amplifikasi eksponensial: Pada setiap siklus, jumlah produk digandakan (dengan
asumsi efisiensi reaksi 100%). Setelah 30 siklus, satu salinan DNA dapat ditingkatkan
hingga 1.000.000.000 (satu miliar) salinan. Maka, dalam arti tertentu, replikasi untai
diskrit DNA sedang dimanipulasi dalam tabung dalam kondisi yang terkendali.[15]
Reaksi ini sangat sensitif: hanya sejumlah kecil DNA yang harus ada.
• Tahap meratakan: Reaksi melambat ketika DNA polimerase kehilangan aktivitas dan
karena konsumsi reagen, seperti dNTP dan primer, menyebabkan mereka menjadi
lebih terbatas.
• Plateau: Tidak ada lagi produk yang terakumulasi karena kelelahan reagen dan enzim.

7
2. Optimasi PCR
Dalam praktiknya, PCR dapat gagal karena berbagai alasan, sebagian karena sensitivitasnya
terhadap kontaminasi yang menyebabkan amplifikasi produk DNA palsu. Karena itu,
sejumlah teknik dan prosedur telah dikembangkan untuk mengoptimalkan kondisi PCR.[16] [17]
Kontaminasi dengan DNA asing diatasi dengan protokol dan prosedur laboratorium yang
memisahkan campuran pra-PCR dari kontaminan DNA potensial.[7] Ini biasanya melibatkan
pemisahan spasial bidang-bidang pengaturan PCR dari bidang-bidang untuk analisis atau
pemurnian produk-produk PCR, penggunaan perangkat plastik sekali pakai, dan pembersihan
secara menyeluruh permukaan kerja di antara pengaturan reaksi. Teknik desain primer
penting dalam meningkatkan hasil produk PCR dan dalam menghindari pembentukan produk
palsu, dan penggunaan komponen penyangga alternatif atau enzim polimerase dapat
membantu dengan amplifikasi daerah DNA yang lama atau bermasalah. Penambahan reagen,
seperti formamide, dalam sistem buffer dapat meningkatkan spesifisitas dan hasil PCR.[18]
Simulasi komputer dari hasil PCR teoretis (PCR Elektronik) dapat dilakukan untuk
membantu dalam desain primer.[19]
3. Aplikasi PCR
3.1 Isolasi DNA selektif
PCR memungkinkan isolasi fragmen DNA dari DNA genom dengan amplifikasi selektif dari
wilayah DNA tertentu. Penggunaan PCR ini menambah banyak cara, seperti menghasilkan
probe hibridisasi untuk hibridisasi Selatan atau utara dan kloning DNA, yang membutuhkan
jumlah DNA yang lebih besar, mewakili wilayah DNA tertentu. PCR memasok teknik-teknik
ini dengan jumlah DNA murni yang tinggi, memungkinkan analisis sampel DNA bahkan dari
bahan awal yang jumlahnya sangat sedikit.
Aplikasi PCR lainnya termasuk sekuensing DNA untuk menentukan sekuens amplifikasi
PCR yang tidak diketahui di mana salah satu primer amplifikasi dapat digunakan dalam
sekuensing Sanger, isolasi sekuens DNA untuk mempercepat teknologi DNA rekombinan
yang melibatkan penyisipan sekuens DNA ke dalam plasmid, fag , atau kosmid (tergantung
pada ukuran) atau materi genetik organisme lain. Koloni bakteri (seperti E. coli) dapat
dengan cepat disaring oleh PCR untuk mendapatkan konstruksi vektor DNA yang benar.[20]
PCR juga dapat digunakan untuk sidik jari genetik; teknik forensik yang digunakan untuk
mengidentifikasi seseorang atau organisme dengan membandingkan DNA eksperimental
melalui berbagai metode berbasis PCR.
Beberapa metode 'sidik jari' PCR memiliki kekuatan diskriminatif yang tinggi dan dapat
digunakan untuk mengidentifikasi hubungan genetik antara individu, seperti orang tua-anak
atau antara saudara kandung, dan digunakan dalam pengujian ayah (Gambar). Teknik ini juga
dapat digunakan untuk menentukan hubungan evolusi antara organisme ketika jam molekuler
tertentu digunakan (yaitu, gen 16S rRNA dan gen recA dari mikroorganisme).[21]

8
Gambar elektroforesis fragmen DNA yang diamplifikasi PCR. (1) Ayah. (2) Anak. (3) Ibu.
Anak itu telah mewarisi beberapa, tetapi tidak semua sidik jari dari masing-masing orang
tuanya, memberinya sidik jari baru yang unik.
3.2 Amplifikasi dan kuantifikasi DNA
Karena PCR memperkuat daerah DNA yang ditargetkan, PCR dapat digunakan untuk
menganalisis jumlah sampel yang sangat kecil. Ini sering penting untuk analisis forensik,
ketika hanya sejumlah kecil DNA yang tersedia sebagai bukti. PCR juga dapat digunakan
dalam analisis DNA purba yang berusia puluhan ribu tahun. Teknik berbasis PCR ini telah
berhasil digunakan pada hewan, seperti mammoth berusia empat puluh ribu tahun, dan juga
pada DNA manusia, dalam aplikasi mulai dari analisis mumi Mesir hingga identifikasi tsar
Rusia dan jasad Raja Inggris Richard III.[22]
PCR kuantitatif atau PCR Real Time (qPCR,[23] tidak dibingungkan dengan metode RT-PCR)
memungkinkan estimasi jumlah urutan tertentu yang ada dalam sampel — suatu teknik yang
sering diterapkan untuk secara kuantitatif menentukan tingkat ekspresi gen. PCR kuantitatif
adalah alat mapan untuk kuantifikasi DNA yang mengukur akumulasi produk DNA setelah
setiap putaran amplifikasi PCR.
qPCR memungkinkan kuantifikasi dan deteksi urutan DNA spesifik secara waktu nyata
karena mengukur konsentrasi saat proses sintesis berlangsung. Ada dua metode untuk deteksi
dan kuantifikasi simultan. Metode pertama terdiri dari menggunakan pewarna fluorescent
yang dipertahankan secara tidak spesifik di antara untaian ganda. Metode kedua melibatkan
probe yang mengkode untuk urutan tertentu dan diberi label fluoresensi. Deteksi DNA
menggunakan metode ini hanya dapat dilihat setelah hibridisasi probe dengan DNA
komplementernya terjadi. Kombinasi teknik yang menarik adalah PCR waktu-nyata dan
transkripsi balik. Teknik canggih ini, yang disebut RT-qPCR, memungkinkan untuk
kuantifikasi sejumlah kecil RNA. Melalui teknik gabungan ini, mRNA dikonversi menjadi
cDNA, yang selanjutnya dikuantifikasi menggunakan qPCR. Teknik ini menurunkan
kemungkinan kesalahan pada titik akhir PCR,[24] meningkatkan peluang untuk mendeteksi

9
gen yang terkait dengan penyakit genetik seperti kanker.[4] Laboratorium menggunakan RT-
qPCR untuk tujuan mengukur regulasi gen secara sensitif.
3.3 Aplikasi medis dan diagnostik
Calon orang tua dapat dites sebagai pembawa genetik, atau anak-anak mereka mungkin dites
untuk terkena penyakit.[1] Sampel DNA untuk pengujian prenatal dapat diperoleh dengan
amniosentesis, pengambilan sampel chorionic villus, atau bahkan dengan analisis sel-sel janin
langka yang beredar dalam aliran darah ibu. Analisis PCR juga penting untuk diagnosis
genetik praimplantasi, di mana sel-sel individu dari embrio yang sedang berkembang diuji
mutasi.
• PCR juga dapat digunakan sebagai bagian dari tes sensitif untuk mengetahui jenis
jaringan, penting untuk transplantasi organ. Pada 2008, bahkan ada proposal untuk
menggantikan tes tradisional berbasis antibodi untuk golongan darah dengan tes
berbasis PCR.[25]
• Banyak bentuk kanker melibatkan perubahan pada onkogen. Dengan menggunakan
tes berbasis PCR untuk mempelajari mutasi ini, rejimen terapi kadang-kadang dapat
disesuaikan secara individual untuk pasien. PCR memungkinkan diagnosis dini
penyakit ganas seperti leukemia dan limfoma, yang saat ini merupakan yang paling
berkembang dalam penelitian kanker dan sudah digunakan secara rutin. Tes PCR
dapat dilakukan secara langsung pada sampel DNA genom untuk mendeteksi sel-sel
ganas spesifik translokasi pada sensitivitas yang setidaknya 10.000 kali lebih tinggi
daripada metode lain.[26] PCR sangat berguna dalam bidang medis karena
memungkinkan isolasi dan amplifikasi penekan tumor. PCR kuantitatif misalnya,
dapat digunakan untuk mengukur dan menganalisis sel tunggal, serta mengenali
DNA, mRNA, serta konfirmasi dan kombinasi protein.[24]
3.4 Aplikasi penyakit menular
PCR memungkinkan diagnosis penyakit menular yang cepat dan sangat spesifik, termasuk
yang disebabkan oleh bakteri atau virus.[27] PCR juga memungkinkan identifikasi
mikroorganisme yang tidak dapat ditanami atau tumbuh lambat seperti mikobakteri, bakteri
anaerob, atau virus dari uji kultur jaringan dan model hewan. Dasar untuk aplikasi diagnostik
PCR dalam mikrobiologi adalah deteksi agen infeksius dan diskriminasi non-patogenik dari
strain patogen berdasarkan gen tertentu.[27] [28]
Karakterisasi dan deteksi organisme penyakit menular telah direvolusi oleh PCR dengan cara
berikut:
• Human immunodeficiency virus (atau HIV), adalah target yang sulit ditemukan dan
diberantas. Tes paling awal untuk infeksi bergantung pada adanya antibodi terhadap
virus yang beredar di aliran darah. Namun, antibodi tidak muncul sampai beberapa
minggu setelah infeksi, antibodi ibu menutupi infeksi bayi yang baru lahir, dan agen
terapeutik untuk melawan infeksi tidak mempengaruhi antibodi. Tes PCR telah
dikembangkan yang dapat mendeteksi sedikitnya satu genom virus di antara DNA
lebih dari 50.000 sel inang.[29] Infeksi dapat dideteksi lebih awal, darah yang
disumbangkan dapat diskrining langsung untuk virus, bayi yang baru lahir dapat
segera diuji untuk infeksi, dan efek perawatan antivirus dapat diukur.

10
• Beberapa organisme penyakit, seperti untuk TBC, sulit untuk diambil sampelnya dari
pasien dan lambat tumbuh di laboratorium. Tes berbasis PCR memungkinkan deteksi
sejumlah kecil organisme penyakit (baik hidup atau mati), dalam sampel yang mudah.
Analisis genetik terperinci juga dapat digunakan untuk mendeteksi resistensi
antibiotik, memungkinkan terapi segera dan efektif. Efek terapi juga dapat segera
dievaluasi.
• Penyebaran organisme penyakit melalui populasi hewan peliharaan atau liar dapat
dipantau dengan pengujian PCR. Dalam banyak kasus, kemunculan sub-jenis virulen
baru dapat dideteksi dan dipantau. Sub-jenis organisme yang bertanggung jawab atas
epidemi sebelumnya juga dapat ditentukan dengan analisis PCR.
• DNA virus dapat dideteksi oleh PCR. Primer yang digunakan harus spesifik untuk
sekuens yang ditargetkan dalam DNA virus, dan PCR dapat digunakan untuk analisis
diagnostik atau sekuensing DNA genom virus. Sensitivitas PCR yang tinggi
memungkinkan deteksi virus segera setelah infeksi dan bahkan sebelum timbulnya
penyakit.[27] Deteksi dini semacam itu dapat memberi dokter waktu tenggang yang
signifikan dalam perawatan. Jumlah virus ("viral load") pada pasien juga dapat
dikuantifikasi dengan teknik kuantisasi DNA berbasis PCR (lihat di bawah).
• Penyakit seperti pertusis (atau batuk rejan) disebabkan oleh bakteri Bordetella
pertussis. Bakteri ini ditandai oleh infeksi saluran pernapasan akut yang serius yang
menyerang berbagai hewan dan manusia dan telah menyebabkan kematian banyak
anak kecil. Racun pertusis adalah protein eksotoksin yang berikatan dengan reseptor
sel oleh dua dimer dan bereaksi dengan berbagai jenis sel seperti limfosit T yang
berperan dalam imunitas sel.[30] PCR adalah alat pengujian penting yang dapat
mendeteksi urutan yang ada dalam gen toksin pertusis. Ini karena PCR memiliki
sensitivitas tinggi untuk toksin dan telah menunjukkan waktu penyelesaian yang
cepat. PCR sangat efisien untuk mendiagnosis pertusis jika dibandingkan dengan
biakan.[31]
3.5 Aplikasi forensik
Pengembangan protokol sidik jari genetik (atau DNA) berbasis PCR telah terlihat aplikasi
luas dalam forensik:
• Dalam bentuknya yang paling diskriminatif, sidik jari genetik dapat secara unik
membedakan siapa pun dari seluruh populasi dunia. Sampel DNA yang kecil dapat
diisolasi dari TKP, dan dibandingkan dengan yang dilakukan oleh tersangka, atau dari
basis data DNA dari bukti atau narapidana sebelumnya. Versi-versi yang lebih
sederhana dari tes-tes ini sering digunakan untuk secara cepat mengesampingkan
tersangka selama investigasi kriminal. Bukti dari kejahatan puluhan tahun dapat diuji,
mengkonfirmasi atau membebaskan orang-orang yang awalnya dihukum.
• Penentuan jenis DNA forensik telah menjadi cara yang efektif untuk mengidentifikasi
atau membebaskan tersangka kriminal karena analisis bukti yang ditemukan di TKP.
Genom manusia memiliki banyak daerah berulang yang dapat ditemukan dalam
urutan gen atau di daerah non-coding genom. Secara khusus, hingga 40% dari DNA
manusia berulang.[4] Ada dua kategori berbeda untuk wilayah berulang yang tidak
dikode ini dalam genom. Kategori pertama disebut variable number tandem repeats
(VNTR), yang panjangnya 10-100 pasangan dan kategori kedua disebut pengulangan

11
tandem pendek (short tandem repeat = STR) dan ini terdiri dari bagian berpasangan 2-
10 yang berulang. PCR digunakan untuk memperkuat beberapa VNTR dan STR
terkenal menggunakan primer yang mengapit masing-masing daerah berulang.
Ukuran fragmen yang diperoleh dari setiap individu untuk masing-masing STR akan
menunjukkan alel mana yang hadir. Dengan menganalisis beberapa STR untuk
seorang individu, sekumpulan alel untuk setiap orang akan ditemukan bahwa secara
statistik cenderung unik.[4] Para peneliti telah mengidentifikasi urutan lengkap genom
manusia. Urutan ini dapat dengan mudah diakses melalui situs web NCBI dan
digunakan dalam banyak aplikasi kehidupan nyata. Sebagai contoh, FBI telah
menyusun satu set situs penanda DNA yang digunakan untuk identifikasi, dan ini
disebut database DNA Combined DNA Index System (CODIS).[4] Menggunakan
database ini memungkinkan analisis statistik digunakan untuk menentukan
probabilitas bahwa sampel DNA akan cocok. PCR adalah alat analisis yang sangat
kuat dan signifikan untuk digunakan untuk mengetik DNA forensik karena peneliti
hanya membutuhkan sejumlah kecil DNA target yang akan digunakan untuk analisis.
Sebagai contoh, satu rambut manusia dengan folikel rambut yang terpasang memiliki
cukup DNA untuk melakukan analisis. Demikian pula, beberapa sperma, sampel kulit
dari bawah kuku, atau sejumlah kecil darah dapat menyediakan DNA yang cukup
untuk analisis konklusif.[4]
• Bentuk-bentuk sidik jari DNA yang kurang diskriminatif dapat membantu dalam
pengujian paternitas DNA, di mana seorang individu dicocokkan dengan kerabat
dekatnya. DNA dari sisa-sisa manusia tak dikenal dapat diuji, dan dibandingkan
dengan yang dari orang tua, saudara kandung, atau anak-anak. Pengujian serupa dapat
digunakan untuk mengkonfirmasi orang tua kandung dari anak yang diadopsi (atau
diculik). Ayah biologis sebenarnya dari bayi yang baru lahir juga dapat dikonfirmasi
(atau dikesampingkan).
• Desain PCR AMGX/AMGY telah terbukti tidak hanya memfasilitasi dalam
memperkuat urutan DNA dari jumlah genom yang sangat kecil. Namun itu juga dapat
digunakan untuk penentuan jenis kelamin real time dari sampel tulang forensik. Ini
memberi kita cara yang ampuh dan efektif untuk menentukan jenis kelamin tidak
hanya dari spesimen kuno tetapi juga tersangka dalam kejahatan saat ini.[32]
3.6 Aplikasi penelitian
PCR telah diterapkan pada banyak bidang penelitian dalam genetika molekuler:
• PCR memungkinkan produksi cepat potongan-potongan DNA pendek, bahkan ketika
tidak lebih dari urutan kedua primer diketahui. Kemampuan PCR ini menambah
banyak metode, seperti menghasilkan probe hibridisasi untuk hibridisasi blot Selatan
atau utara. PCR memasok teknik-teknik ini dengan sejumlah besar DNA murni,
kadang-kadang sebagai untaian tunggal, memungkinkan analisis bahkan dari sejumlah
kecil bahan awal.
• Tugas pengurutan DNA juga bisa dibantu oleh PCR. Segmen DNA yang diketahui
dapat dengan mudah diproduksi dari pasien dengan mutasi penyakit genetik.
Modifikasi pada teknik amplifikasi dapat mengekstraksi segmen dari genom yang
sama sekali tidak diketahui, atau dapat menghasilkan hanya satu untai tunggal dari
bidang yang diminati.

12
• PCR memiliki banyak aplikasi untuk proses kloning DNA yang lebih tradisional. Ini
dapat mengekstraksi segmen untuk dimasukkan ke dalam vektor dari genom yang
lebih besar, yang mungkin hanya tersedia dalam jumlah kecil. Dengan menggunakan
satu set 'vektor primer', ia juga dapat menganalisis atau mengekstraksi fragmen yang
telah dimasukkan ke dalam vektor. Beberapa perubahan pada protokol PCR dapat
menghasilkan mutasi (umum atau diarahkan-situs) dari fragmen yang dimasukkan.
• Situs yang diberi tag urutan adalah proses di mana PCR digunakan sebagai indikator
bahwa segmen tertentu dari genom hadir dalam klon tertentu. Proyek Genom Manusia
menemukan aplikasi ini penting untuk memetakan klon kosmid yang mereka
sekuensing, dan mengoordinasikan hasil dari berbagai laboratorium.
• Aplikasi PCR yang menarik adalah analisis filogenik DNA dari sumber-sumber
purba, seperti yang ditemukan pada tulang Neanderthal yang dipulihkan, dari jaringan
mamut yang beku, atau dari otak mumi Mesir. Telah diamplifikasi dan diurutkan.[15]
Dalam beberapa kasus, DNA yang sangat terdegradasi dari sumber-sumber ini
mungkin dirakit ulang selama tahap awal amplifikasi.
• Aplikasi umum PCR adalah studi pola ekspresi gen. Jaringan (atau bahkan sel-sel
individual) dapat dianalisis pada tahap yang berbeda untuk melihat gen mana yang
menjadi aktif, atau yang telah dimatikan. Aplikasi ini juga dapat menggunakan PCR
kuantitatif untuk mengukur tingkat ekspresi aktual.
• Kemampuan PCR untuk secara bersamaan memperkuat beberapa lokus dari sperma
individu[33] telah sangat meningkatkan tugas pemetaan genetik yang lebih tradisional
dengan mempelajari crossover kromosom setelah meiosis. Peristiwa crossover langka
antara lokus yang sangat dekat telah diamati secara langsung dengan menganalisis
ribuan sperma individu. Demikian pula, penghapusan, penyisipan, translokasi, atau
inversi yang tidak biasa dapat dianalisis, semua tanpa harus menunggu (atau
membayar) untuk proses pembuahan, embriogenesis, dan sebagainya yang panjang
dan melelahkan, dll.
• Mutagenesis terarah situs: PCR dapat digunakan untuk membuat gen mutan dengan
mutasi yang dipilih oleh para ilmuwan sesuka hati. Mutasi ini dapat dipilih untuk
memahami bagaimana protein menyelesaikan fungsinya, dan untuk mengubah atau
meningkatkan fungsi protein.

4. Keuntungan PCR
PCR memiliki sejumlah keunggulan. Ini cukup sederhana untuk dipahami dan digunakan,
dan menghasilkan hasil dengan cepat. Teknik ini sangat sensitif dengan potensi untuk
menghasilkan jutaan hingga miliaran salinan produk tertentu untuk diurutkan, dikloning, dan
dianalisis. qRT-PCR berbagi keuntungan yang sama dengan PCR, dengan keuntungan
tambahan dari kuantifikasi produk yang disintesis. Oleh karena itu, ia memiliki kegunaan
untuk menganalisis perubahan tingkat ekspresi gen pada tumor, mikroba, atau keadaan
penyakit lainnya.[34]
PCR adalah alat penelitian yang sangat kuat dan praktis. Urutan etiologi yang tidak diketahui
dari banyak penyakit sedang dipecahkan oleh PCR. Teknik ini dapat membantu
mengidentifikasi urutan virus yang sebelumnya tidak diketahui terkait dengan yang sudah
diketahui dan dengan demikian memberi kita pemahaman yang lebih baik tentang penyakit
itu sendiri. Jika prosedur ini dapat lebih disederhanakan dan sistem deteksi non radiometrik

13
yang sensitif dapat dikembangkan, PCR akan mengambil tempat yang menonjol di
laboratorium klinis untuk tahun-tahun mendatang.[15]
5. Keterbatasan PCR
Salah satu keterbatasan utama PCR adalah bahwa informasi sebelumnya tentang urutan target
diperlukan untuk menghasilkan primer yang memungkinkan amplifikasi selektif.[35] Ini
berarti bahwa, biasanya, pengguna PCR harus mengetahui urutan yang tepat di hulu dari
wilayah target pada masing-masing dari dua templat beruntai tunggal untuk memastikan
bahwa DNA polimerase berikatan dengan baik dengan hibrida templat primer dan kemudian
menghasilkan seluruh wilayah target selama sintesis DNA.
Seperti semua enzim, DNA polimerase juga rentan terhadap kesalahan, yang pada gilirannya
menyebabkan mutasi pada fragmen PCR yang dihasilkan.[36]
Keterbatasan PCR lainnya adalah bahwa bahkan jumlah terkecil dari DNA yang
terkontaminasi dapat diperkuat, menghasilkan hasil yang menyesatkan atau ambigu. Untuk
meminimalkan kemungkinan kontaminasi, peneliti harus memesan ruangan terpisah untuk
persiapan reagen, PCR, dan analisis produk. Reagen harus disalurkan menjadi alikuot sekali
pakai. Pipet dengan plunger sekali pakai dan tip pipet ekstra panjang harus digunakan secara
rutin.[15]

14