Pekerjaan

2005- Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar kesehatan,

sekarang Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan
Pendidikan
2013 Master of Biomedical Science (by Research), Monash
University
2008 Sarjana Biologi Medik, Universitas Nasional
2004 D3 Analis Kesehatan, Poltekkes Jakarta III
Agustiningsih,
SSi,
Pelatihan/Scentific Conference MBiomedSc
2019 Training in Cell Culture, Isolation and
Characterization of Influenza Viruses, Jakarta.
2017 TOT Pengelolaan Kesehatan Terpadu, BBPK Ciloto naning.agustiningsih
@yahoo.com

2016 Option IX for the Control of Influenza, Chicago, USA

2014 16th International Congress of Infectious Diseases,
Cape Town, South Africa
2010 7th HKU-Pasteur Virology Course on Influenza and
Other Emerging Respiratory Viral Infection, HKU-
Pasteur Research Center, Hong Kong, China.
Deteksi SARS-CoV2 dengan
Realtime PCR

Webinar PATELKI II
Jakarta, 18 April 2020

PUSLITBANG BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN

BADANINSTITUTE
NATIONAL PENELITIAN
OFDAN PENGEMBANGAN
HEALTH KESEHATAN
RESEARCH AND DEVELOPMENT
KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
 Coronaviruses (CoVs)
• Single stranded RNA virus
• Genome terdiri dari ≥27.000
basa
• Zoonosis
• Tipe virus Alfa dan Beta
menyebabkan penyakit
pada manusia
• SARS-CoV-2 memiliki 96%
kesamaan asam nukleat
dengan coronavirus pada
kelelawar (RaTG13)

Perlman, et al., Nat Rev Microbiol 7, 439–450 (2009)

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
Zhang et al., Current Bilogy 30, 1346-1351 (2020)
 SARS-CoV2
• Severe Acute Respiratpry Syndrome-
Coronavirus 2
• Etiologi dari COVID-19
• Ditularkan melalui droplet
• Saluran pernafasan sebagai jalur penularan
• Masa inkubasi : 1-14 hari sejak paparan infeksi
(umumnya 5 hari)
• Gejala umum : gejala gangguan pernafasan
akut seperti demam, batuk, sesak nafas
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Metode Pemeriksaan

• Rapid Test
• Molecular test : Polymerase Chain Reaction
• Immunofluorescence Assay
• Test Serologi
• Kultur virus

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Proporsi Kesalahan Pemeriksaan
Laboratorium
Plebani, et al.,Clin Chem Lab Med
2006: 44(6): 750-59
Post
Analitik
18-47%

Analitik
7-13% Pre
Analitik
46-68%

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Sensitifitas dan Spesifisitas
Pemeriksaan
Sensitifitas dan spesifisitas deteksi virus dalam
spesimen dipengaruhi :
• Jenis pemeriksaan
• Waktu pengambilan spesimen sejak onset
• Kualitas spesimen
• Jenis spesimen
• Penanganan spesimen
• Waktu dari pengambilan spesimen hingga
pemeriksaan

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Jenis Spesimen

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Jenis Spesimen

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Viral Transport Medium (VTM)

• Steril
• Larutan Isotonik
• Mengandung Protein
• Mengandung Antibiotik
• Buffer pH
• Indikator (Phenol Red)*

Contoh VTM :
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Virocult, MEM, UTM, dll

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Viral Transport Medium (VTM)
• Di Simpan dalam Freezer -
20oC (Dalam kondisi Beku,
VTM berwarna Kuning =
Normal)
• Dicairkan terlebih dahulu jika
akan digunakan
• Hindari Beku-Cair (Frezze-
Thaw)  VTM Rusak
• Tidak Bisa digunakan bila
berwarna kuning keruh

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Penggunaan Saline Steril

Update on WHO Guideline, 31 Maret 2020

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
Alat/Bahan Pengambilan Spesimen
Swab Dacron/Rayon

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Pengambilan Spesimen Swab
Yang perlu diperhatikan:
• Putuskan tangkai plastik di
daerah mulut cryotube agar
cryotube dapat ditutup dengan
rapat

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Pengambilan Spesimen Swab
• Cryotube kemudian dililit parafilm.
• Cryotube yang sudah berisi swab dibungkus
dalam tissue bersih lalu dimasukan ke dalam
plastik klip.

• Simpan dalam suhu 4-8°C sebelum dikirim.

Jangan dibekukan dalam Freezer.

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

Pengambilan Spesimen Sputum
• Container steril spesimen
• Plastik Klip atau Plastik pembungkus container
siapkan
• Sputum di tampung dalam container Steril

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

Pengepakan dan Pengiriman Spesimen

• Semua spesimen dikemas untuk mencegah

kerusakan dan tumpahan
• Spesimen pasien harus dilakukan tatalaksana
sebagai UN3373, "Substansi Biologis, Kategori
B", ketika akan diangkut/ditransportasikan
dengan tujuan diagnostik atau investigasi
• system yang digunakan adalah dengan
menggunakan tiga lapis (Three Layer
Packaging) sesuai dengan pedoman WHO
dan International Air Transport Association
(IATA).

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

Pengepakan dan Pengiriman Spesimen

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

Pengepakan dan Pengiriman Spesimen
Masing-masing spesimen dimasukkan ke dalam plastik
klip berisi tissue sebagai absorban secara terpisah (per
pasien/spesimen)

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 MOLECULAR TEST

• Mendeteksi antigen atau materi genetik

virus
• Sensitif dan spesifik
• Cepat
• Memerlukan tahapan persiapan sampel
• Perlu peralatan khusus
• Memerlukan fasilitas lab khusus BSL 2

• Tahapan:
isolasi materi genetik (ekstraksi)

perbanyakan materi genetik (PCR)

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Ekstraksi RNA
Sampel
 Mengisolasi asam nukleat dari
berbagai material selular di dalam
Lysis
spesimen

 Dilakukan di BSL II Binding

 Menghilangkan material
Wash
penghambat yang tidak diperlukan
dalam reaksi PCR
Elute
 Inaktivasi virus (lysis buffer)
HARUS dilakukan di dalam BSC
(Biosafety Cabinet) II RNA

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 PCR
• Polymerase Chain Reaction

• Perbanyakan DNA spesifik

dengan metoda in vitro dan
enzimatis

• template : DNA

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Komponen PCR
• deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP)
• enzim termostabil Taq DNA PCR
polimerase Reagensia
• Ion Mg2+
• Buffer
• Primer Forward
• Primer Reverse Spesifik
• Template DNA

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Tahapan PCR
Tahap 1: Denaturasi
ds DNA ss DNA
60 detik, 90°-95°C

Tahap 2: Annealing
Penempelan Primer F dan R
30-45 detik, 50°-60°C

P
Tahap 3: Elongasi
Perpanjangan untai DNA baru
P oleh Taq Polymerase
1-2 menit, 72°C
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Tahapan PCR
Gen Target
Exponential
Amplification

Jumlah copy DNA : 2n

n: siklus PCR

235 = 34 milyar copy DNA

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 RT-PCR
• Reverse Transcript-Polymerase Chain
Reaction, bukan realtime-PCR
• Amplifikasi DNA dengan template RNA
• Terdiri dari 2 tahap:

RT : Reverse Transcription cDNA Synthesis

PCR : DNA Amplification

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Komponen RT-PCR
PCR RT-PCR
• dNTP • dNTP
• enzim termostabil • enzim termostabil
Taq DNA polimerase Taq DNA polimerase
• Ion Mg2+ • Ion Mg2+
• Buffer • Buffer
• Primer Forward • enzim Reverse
• Primer Reverse Transcriptase
• Template : DNA • Primer Forward
• Primer Reverse
• Template : RNA
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Tahapan RT-PCR
1. RT
RT Reverse Transcriptase

2. PCR
P
P

P
Plat-Taq enzyme

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Tahapan PCR/RT-PCR
Pencampuran
reagensia, Primer dan
RNA/DNA Template
Amplifikasi DNA di
dalam Thermal Cycler

Analisis Hasil
PCR/RT-PCR

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

• Teknik amplifikasi (perbanyakan) DNA dimana

produk amplifikasi dapat dianalisis pada setiap
siklusnya dengan menggunakan fluorogenic
probe

• Produk amplifikasi dapat dideteksi sekaligus

dikuantifikasi pada saat proses berlangsung
sehingga tidak memerlukan perlakukan post-
PCR

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 KOMPONEN MASTER MIX qPCR
Konvensional Real Time
• PCR Buffer (ion Mg) • PCR Buffer (ion Mg)
• dNTPs • dNTPs
• Enzim Reverse Transcriptase • Enzim Reverse Transcriptase
• Enzim Taq Polymerase • Enzim Taq Polymerase
• Primer Forward
• Primer Forward
• Primer Reverse
• Primer Reverse
• Probe

Probe : Sekuen oligonukleotida pendek yang didesain untuk

berhibridisasi dengan sekuen target

5’ 3’
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Primer dan Probe Set
WHO merekomendasikan beberapa Primer dan Probe Set
dengan beberapa target gen sebagai berikut:

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 HASIL REAL TIME PCR (qPCR)

Specimen Thermal Fluorescence Analysis by

Preparation Cycling detection Computer

plateau Deteksi produk PCR secara otomatis saat proses

amplifikasi berlangsung.

eksponensial
Sinyal fluorescence vs siklus PCR
direkam dalam bentuk kurva amplifikasi.
Hasil akhir berupa nilai Ct yang merupakan
inisiasi perpotongan antara garis threshold dengan
kurva amplifikasi

Semakin banyak DNA copy, semakin awal sinyal terdeteksi  semakin rendah nilai Ct

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 THRESHOLD

Threshold berada diatas baseline sinyal fluorescence. Sinyal fluorescence yang

terdeteksi diatas threshold adalah sinyal yang digunakan dalam menentukan nilai
threshold cycle (Ct).

Pengaturan threshold manual  diletakkan diatas noise atau background kurva

amplifikasi

Threshold

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Validasi Hasil

• Pemeriksaan RP gene yang merupakan gen

yang terdapat di dalam sel epitel manusia
• Hasil RP positif menunjukkan bahwa proses
ekstraksi asam nukleat dan proses
pengambilan spesimen telah dilakukan dengan
benar

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Fasilitas Laboratorium PCR

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

WHO Laboratory Biosafety Manual 3rd edition, 2004
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Fasilitas Laboratorium PCR
Lay out untuk Lab PCR
Pre-PCR PCR

1 2 3
Area Reagensia Area proses Area Perbanyakan
spesimen dan analisa hasil

Alur kerja searah

Setiap area memiliki alat lab, reagen, bahan habis pakai, dan APD
masing-masing. TIDAK untuk dipindahkan ke ruangan lain

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Fasilitas Laboratorium PCR
1. Area/ruang reagensia (clean
room)
- penyimpanan dan persiapan reagen
PCR (master mix) – primer, probes,
enzim, buffer
- dilakukan di dalam laminar flow*
*melindungi bahan reagensia, tidak ada hepa
filter, aliran satu arah
- bebas RNA/DNA, amplikon (DNA
hasil PCR), dan spesimen
- area penambahan kontrol negatif
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Fasilitas Laboratorium PCR
2. Area/ruang proses spesimen
- penatalaksanaan dan penerimaan
specimen klinis
- ektraksi RNA/DNA
- dilakukan di dalam BSC (Biosafety
Cabinet)*
*melindungi spesimen, pekerja, ada hepa filter,
aliran 2 arah
- pencampuran reagen (ruang reagen)
dengan RNA/DNA
- bebas amplikon (DNA hasil PCR)

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Fasilitas Laboratorium PCR
• Hazard level spesimen  pemilihan BSC

Airflow BSC
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
 Fasilitas Laboratorium PCR
3. Area/ruang perbanyakan dan analisis DNA/RNA
- mesin PCR konvensional atau Real Time PCR
- terdapat jutaan copi DNA (amplikon)  ruang
kotor/terkontaminasi amplikon
- deteksi dan analisa hasil dengan gel elektroforesis
- analisa hasil real time PCR

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Fasilitas Laboratorium PCR
Gambar denah laboratorium PCR Labnas Lt4

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

Pemilihan Reagensia PCR
• Dipilih berdasarkan kebutuhan
• Perhatikan spesifitas dan sensitivitas
reagensia (terutama bila primer probe dari
manufacture)
• Sesuaikan chemistry reagensia dengan alat
PCR yang ada di lab

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 Alat dan Kit PCR
Open System Closed System
• Dapat digunakan untuk • Penggunaan terbatas
seluruh reagen PCR hanya untuk reagensia
yang dibuat oleh
• Optimasi oleh manufaktur yang sama
pengguna
• Tidak perlu optimasi oleh
• Penggunaan terbuka pengguna
untuk agen penyakit
yang akan diperiksa • Penggunaan hanya untuk
reagensia yang tersedia
di manufaktur

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

 TERIMA KASIH

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT
NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT