SPEKTROFOTOMETRI UV/VIS

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini diharapkan mahasiswa dapat :
1. Menggunakan alat spektrofotometer sinar tampak ( Vis ) dan Ultraviolet;
2. Menganalisis cuplikan secara spektrofotometri.
II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

∎ Alat yang digunakan ;

1.Spektrofotometer Agilent
2. Kuvet / sel
3. Labu takar 250 mL
4. Labu takar 100 mL
5. Labu takar 50 mL
6. Gelas kimia 100
7. Pipet ukur 10
8. Batang pengaduk & spatula
9. Corong gelas
10. Pipet tetes
11. Bola hisap
12. Bola semprot

∎ Bahan yang digunakan ;

1. Kristal CuSO 4. 5 H 2 O
2. Larutan H 2 SO 4 pekat
3. Larutan Amonia pekat
4. Sampel

III. DASAR TEORI

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik
yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-
380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen
spektrofotometer.Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang
cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis
lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis
yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara
kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan
cahaya.Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut
spektrofotometer.Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan
inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang
lebih berperan adalah elektron valensi. 2
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga
sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam
 kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Dalam interaksi materi dengan
cahaya atau radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik kemungkinan
dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan dikenal adanya spektroskopi
hamburan, spektoskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi.
Pengertian spektroskopi dan spektrofotometri pada dasarnya sama
yaitu di dasarkan pada interaksi antara materi dengan radiasi
elektromagnetik.Namun pengertian spektrofotometri lebih spesifik atau
pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi
dengan cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat). Sedangkan
pengertian spektroskopi lebih luas misalnya cahaya maupun medan magnet
termasuk gelombang elektromagnetik.
Cahaya yang dapat dilihat oleh manusia disebut cahaya terlihat/
tampak. Biasanya cahaya yang terlihat merupakan campuran dari cahaya yang
mempunyai berbagai panjang gelombang, mulai dari 400 nm , seperti pelangi
di langit.
Hubungan antara warna pada sinar tampak dengan panjang gelombang
terlihat seperti tabel dibawah. Dalam tabel berikut ini tercantum warna dan
warna komplementernya merupakan pasangan dari setiap dua warna dari
spektrum yang menghasilkan warna putih jika dicampurkan.

Tabel Warna dan warna komplementer

Panjang Warna Warna Komplementer
gelombang (nm)
400 – 435 Ungu Hijau Kekuningan
435 – 480 Biru Kuning
480 – 490 Biru Kehijauan Jingga
490 – 500 Hijau Kebiruan Merah
500 – 560 Hijau Ungu Kemarahan
560 – 580 Hijau Kekuningan Ungu
592 – 610 Jingga Biru Kehijauan
610 – 680 Merah Hijau Kebiruan
680 – 700 Ungu Kemerahan Hijau

Saat sinar mengenai larutan bening , maka akan terjadi 2 hal :

1. Transmisi
Transmitan larutan adalah bagian dari sinar yang diteruskan melalui larutan.
2. Absorpsi
 Cahaya akan diserap jika energi cahaya tersebut sesuai dengan energi yang
dibutuhkan untuk mengalami perubahan dalam molekul. Absorbansi larutan
bertambah dengan pengurangan kekuatan sinar.
Bila seberkas sinar radiasi dengan intensitas I ˳ dilewatkan melalui medium
yang panjang b dan mengandung molekul pada tingkat energi elektronik dasar dengan
konsentrasi C, Maka radiasi akan diserap sebagian dan intensitas radiasi akan
berkurang menjadi I, sehingga berlaku persamaan :
I = I ˳. exp (- kbc) (1)
atau
Log I ˳ /¿ I = a.b.c atau A = a.b.c (2)
dengan,
k
a¿ =koefisienserapan( serapanmolar)
2,303
A ¿ log I ˳ /¿ I ¿ absorban
k ¿ tetapan perbandingan
I ˳ /I ¿ transmitansi (T)
Persamaan dua dikenal sebagai hukum Lambert – Berr , yang digunakan
sebagai dasar analisa kuantitatif dalam spektrofotometri sinar tampak.
Dari persamaan tersebut diatas menunjukan bahwa absorbansi berbanding
lurus dengan konsentrasi larutan. Besarnya konsentrasi ini sebanding dengan
konsentrasi larutan sehingga dengan meletakkan besarnya absorbansi sebagai titik
ordinat dengan konsentrasi larutan standar sebagai absis akan diperoleh kurva garis
lurus. Kurva ini disebut dengan kurva kalibrasi ( kurva standar ). Dengan
memasukkan absorbansi larutan cuplikan pada kurva kalibrasi tersebut, maka dapat
ditentukan konsentrasi larutan di dalam cuplikan.
Pada analisis kualitatif, ada tiga metode yang sesuai dan secara umum sering
digunakan pada penentuan unsur di dalam suatu bahan, seperti diuraikan dibawah ini.
1. Metode Relatif, yaitu dengan mengukur absorbansi atau transmitan dari larutan
blanko, larutan standar dan larutan cuplikan.
Ab−Ao Cb As− Ao
= atau Cs=Cb
As−Ao Cs Ab−Ao
dengan,
Ab = absorbansi larutan baku
Ac = absorbansi larutan blanko
As = absorbansi larutan cuplikan
Cb = konsentrasi larutan baku
Cs = konsentrasi larutan cuplikan
 2. Metode kurva kalibrasi, yaitu dengan membuat kurva antara konsentrasi
standar terhadap absorbansi, dengan kurva tersebut berupa garis lurus, kemudian
dengan cara menginterpolasikan dari larutan cuplikan ke dalam kurva standar tersebut
diatas, akan diperoleh konsentrasi larutan cuplikan.
3. Metode penambahan standar
Untuk kondisi tertentu, metode kalibrasi kurang baik, karen adanya matrik
yang mengganggu pengukuran absorbansi atau transmitannya. Pada metode kurva
penambahan standar ini dibuat sederetan larutan cuplikan dengan konsentrasi yang
sama. Masing- masing larutan ditambah dengan larutan standar dari unsur yang
dilakukan analisis dengan konsentrasi mulai dari 0 sampai konsentrasi tertentu.
Absorbansi masing- masing larutan diukur dan dibuat kurva absorbansi terhadap
konsentrasi unsur standar yang ditambahkan.
Dari ekstrapolasi kurva ke sumbu konsentrasi akan diperoleh intersept pada
sumbu konsentrasi yang merupakan konsentrasi unsur di dalam cuplikan yang diukur.
Selain dengan cara ekstrapolasi, konsentrasi unsur didalam cuplikan dapat
dihitung dengan persamaan :
Ao
Cs=X
Aadd−Ao
dengan,
Cs = konsentrasi unsur di dalam cuplikan
Ao = absorbansi larutan cuplikan tanpa penambahan larutan standar
Aadd = absorbansi larutan cuplikan dengan penambahan larutan standar
X = konsentrasi unsur standar yang ditambahkan.
Pada spektrofotometer UV-Vis dapat melakukan penentuan terhadap sampel
yang berupa larutan, gas atau uap. Untuk sampel yang berupa larutan perlu
diperhatikan pelarut yang dipakai antara lain :
1. Pelarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya yang tidak bewarna
2. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis
3. Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis.
  Bagian-bagian Spektrofotometer UV-Vis
1.       Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki pemancaran radiasi yang stabil
dan intensitasnya tinggi. Sumber cayaha pada spektrofotometer UV-Vis ada dua
macam :
a.       Lampu Tungsten (Wolfram)
Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk lampu
ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, memiliki panjang gelombang antara 350-
2200 nm. Spektrum radiasinya berupa garis lengkung , Umumnya memiliki waktu
1000jam pemakaian      
b. Lampu Deuterium
Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy radiasinya
lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah UV.
Memiliki waktu 500 jam pemakaian.
2.      Monokromator
Monokromator adalah alat yang memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya
tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Bagian-
bagian monokromator, yaitu:
a.       Prisma
Prisma mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di
dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.

b.     Grating (kisi difraksi)

Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi
sinar disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik.
Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum.
c.       Celah optis
Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan
dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi
dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang diharapkan.
d.      Filter
Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang
diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang
dipilih.
3.      Kompartemen sampel
Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. kuvet merupakan
wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Pada
spektrofotometer double beam, terdapat dua tempat kuvet. Satu kuvet digunakan
sebagai tempat untuk menaruh sampel, sementara kuvet lain digunakan untuk
menaruh blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam, hanya terdapat satu
kuvet.
Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :
a.       Permukaannya harus sejajar secara optis
b.      Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan
c.       Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia
d.      Tidak rapuh
e.       Bentuknya sederhana
Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Umumnya pada
pengukuran di daerah UV, digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau
plexiglass. Kuvet kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar uv, sehingga tidak digunakan
pada saat pengukuran di daerah UV.  Oleh karena itu, bahan kuvet dipilih berdasarkan
daerah panjang gelombang yang digunakan. Gunanya agar dapat melewatkan daerah
panjang gelombang yang digunakan.
• UV : fused silika, kuarsa
• Visible : gelas biasa, silika atau plastik
• IR : KBr, NaCl, IRTRAN atau kristal dari senyawa ion
Bahan Panjang gelombang
Silika 150-3000
Gelas 375-2000
Plastik 380-800

4.      Detektor
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian diubah
menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam
bentuk angka-angka pada reader (komputer).
Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :
Jenis detector λ range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan
Phototube 150 – 1000 arus listrik UV

Photomultiplier 150 – 1000 arus listrik UV/Vis

Solid state 350 – 3000

Thermocouple 600 – 20.000 arus listrik IR

Thermistor 600 – 20.000 hambatan listrik IR

Tabel 3 Jenis-jenis detektor berdasarkan panjang gelombang
Syarat-syarat ideal sebuah detector adalah :
-          Mempunyai kepekaan tinggi
-          Respon konstan pada berbagai panjang gelombang
-          Waktu respon cepat dan sinyal minimum tanpa radiasi
-          Sinyal listrik ayng dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi
5.      Visual display
Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan
dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

( HPLC )

A. Tujuan
- Dapat menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi.
- Dapat mengoperasikan alat kromatografi cair kinerja tinggi dengan baik dan
benar.
- Dapat menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun
kuantitatif menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.

B. Alat dan bahan yang Digunakan

Alat yang Digunakan :
- Serangkat alat HPLC yang dilengkapi dengan injector dan pencetak
kromatografi.
 - Kolom Linchosphere.
- Syringe
- Penyaring milipone.
Bahan yang Digunakan :
- Cairan yang mengandung caffeine.
- Metanol

C. Dasar Teori
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam
kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada salah
satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan
kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau
gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak, statisiones). Sehingga akibatnya
masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang membawanya. Akibat
selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada kecepatan
yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah
pemisahan diantara komponen-komponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen sampel
diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik kromatografi yang
dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair adalah HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa Indonesia disebut KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada
prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data
yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu,
dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji, dkk. 2010 : 17).
 HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan
manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk
memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan yang
modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan pemisahan yang
sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang berhubungan sangat erat. LC
harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan harus disesuaikan dengan sampel-
sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang beberapa jam (Underwood, Day. 2002 :
553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal
digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran sampai
3-5 μm (1μm = 10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan tinggi sampai

20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui kolom tersebut.
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja
telah memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah
menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai
kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah, dan
perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif. Selain itu
sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :
a) Fase Normal HPLC
HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom.
Meskipun disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini
diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti
heksan sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan
kemungkinan kurang dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat
lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa
non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih
cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa diam lebih polar daripada
fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase normal.

b) Fase Balik HPLC

Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang
 pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar
dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang
terjadi tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang
berlekatan pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam
larutan. Oleh karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak
melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak
lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Komponen instrumentasi penyusun Kromatografi Cair Kinerja Tinggi :

a) Reservoir Pelarut
Jumlah reservoir pelarut : (1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik
seperti heksana, atau air, atau campuran air dan pelarut organik seperti
metanol,tergantung kepada apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa
terbalik atau metode kromatografilainnya.
Bila sistem KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran (2) (atau mempunyai
lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran pelarut
dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener, maka diperlukan
lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk melakukan elusi bergradien
dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama pengelusian.
Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian
sehingga campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan
(pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 – 10 mL/menit. Gas yang terlarut
dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang terlebih dahulu (de-gassing),
selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas dari partikel-partikel kecil yang
tidak larut.
Pada saluran-saluran pelarut biasanya dipasang saringan (berukuran 2-10 mμ)
untuk mencegah partikel-partikel kecil yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom.
Saringan ini harus diganti atau dibersihkan bila terjadi penyumbatan. Diantara jenis-
jenis pompa yang paling umum digunakan untuk sistem HPLC adalah jenis pompa
“isap dan tekan ” (reciprocating).
Pompa “isap dan tekan” yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang
tetap. Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu
untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan yang
baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua pengisap yang
masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap pengisap
memppunyai dua katup pengendali.
Pelarut diisap ke dalam ruang pengisap melalui katup pemasukkan dan
kemudian ditekan ke luar melalui katup pengeluaran. Untuk melakukan elusi
bergradien diperlukan dua sistem pompa yang masing-masing mempunyai satu atau
dua penghisap. Ada dua macam rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran
tekana tinggi yang mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana rendah
dengan hantaran satu pompa.
Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem pencampuran tekanan
tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali, masing-masing pompa
menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali adalah mengatur kecepatan
aliran masing-masing pelarut sesuai dengan komposisi yang diinginkan dan juga
berfungsi untuk menjamin terjadinya pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk
dinamik. Setiap pompa mempunyai dua penghisap dan setiap penghisap mempunyai
dua katup. Jenis yang kedua, pompa pembagi bertekanan rendah hanya mempunyai
satu penghisap. Untuk melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa. Pompa
ini mempunyai katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien.
Dengan katup-katup pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran
terner (tiga jenis pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk
melakukan gradien gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-katup
pembagi ini dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah
pemasukan pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

b) Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang terbuat
dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat terjadinya pemisahan
campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung keperluannya kolom utama
dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap komponen yang keluar kolom
ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan
fraction colector selain kolom utama dikenal pula kolom pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada
keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion. Kolom
utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm dan diameter
dalam berkisar 4,5–10 mm.
Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya
sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan
diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari
ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu:
menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa gerak
dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
- Kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk
kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan
mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.
- Kolom preparative
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.
c) Pompa
Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam metode
ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan sukar
mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat
cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan pompa yang
bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan
sebagai berikut :
 Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi
 Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
 Bahan tahan korosi
 Keluaran bebas pulse
d) Injector Sample
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
 Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh,
tapi bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen
dan ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan
penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan
(handle) penyuntik diputar dari posisi load (“pengisap”) ke posisi inject (“suntik”).
Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya
tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke
dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke
dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject)
berlangsung cepat.
Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak
pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya
kebanyakan memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band
broadening. Oleh karen itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh
mikroliter. Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan
sebagai berikut :

 Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe
yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe
ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
 Injeksi Stop Flow
Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung
kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan
kedalam fasa gerak perlu dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan
ke dalam loop dan posisi ‘load’. Cuplikan masih berada dalam loop ; kran
diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak
membawa cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan)
 Kran Cuplikan
 Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu:
sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load,
cuplikan masih berada dalam loop; kran diputar untuk mengubah posisi load
menjadi posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.
e) Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap
golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka
terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang
digunakan dalam KCKT adalah :
Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa
organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga
panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan
yang diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena
sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang
di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang
dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm,
dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara
190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang
dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-
nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode
erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan
absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis
apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan
indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak
merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10 -6 g) dan
umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat
dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan
dalam analisis karbohidrat.
 Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks
bias :
1. Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen
dan bebaskan dari gas terlarutnya.
2. Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai
detektor stabil.
3. Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka
tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir.
4. Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner
diameter) yang besar tapi pendek.
5. Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
6. Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
6.      Rekorder
Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat
dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (rt) analit atau sampel dengan
waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan
didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.

Prinsip kerja instumentasi HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah
campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen
dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong
fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik
adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C8. Sementara fasa
geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya :
air:asetonitril (80:20), hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan
berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
 Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada
kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu
tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu menganalisis senyawa
anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang mempunyai molekul tinggi (beratnya),
mampu menganalisis cuplik yang mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti
polimer.
Cara kerja instumentasi HPLC
Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran
fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap
fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa
diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang
keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.