TUGAS MAKALAH ILMU BIOTEKNOLOGI FARMASI

Tentang

Larva dari Ngengat Pakaian Tineola bisselliella

Yang Memelihara Bakteri Usus dengan Mengeluarkan Enzim
Koktail untuk Memperlancar Pencernaan dari Keratin

DOSEN PENGAMPU : Apt. Grace Anastasia br Ginting S.Farm., M.Si.

Kelas : B
Disusun Oleh :
EVIRA DWI YANTI 170205079
ENDANUR 170205085
FEBRY PERMATA HATI BR NAINGGOLAN 170205077
FANZI LINGGA 170205108
ELMA SAFITRI 170205177
ENITO SIMANULLANG 170205185
FHON RISYA ALSYIFA 170205175
ERNI MEI LINDA YANTI HALAWA 170205152

PRODI S1 FARMASI
FAKULTAS FARMASI DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS SARI MUTIARA INDONESIA
MEDAN
T.A 2020/2021
 A. KATA PENGANTAR

Puji syukur kami ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena dengan karunia dan
rahmat-Nya lah, kami dapat menyelesaikan makalah ini.
Dengan kerja keras dan dengan penuh rasa syukur kami telah menyelesaikan tugas
makalah yang berjudul “ Larva dari Ngengat Pakaian Tineola bisselliella Yang Memelihara
Bakteri Usus dengan Mengeluarkan Enzim Koktail untuk Memperlancar Pencernaan dari
Keratin “ , meski masih jauh dari kata sempurna kami anggap sebagai pengalaman dan kami
akan kembangkan menjadi yang lebih baik lagi.
Kami sadari bahwa dalam pembuatan tugas ini masih banyak kekurangan, untuk itu kami
mohon kritik dan saran dari dosen untuk perbaikan dimasa yang akan datang.
Semoga bermanfaat dan dapat mencapai tujuan, atas bantuan dan perhatian semua pihak kami
ucapkan terimakasih.
DAFTAR ISI
A. KATA PENGANTAR
DAFTAR ISI
BAB I PENDAHULUAN
B. Latar Belakang...................................................................................................4
C. Rumusan Masalah..............................................................................................5
D. Tujuan................................................................................................................5
BAB II PEMBAHASAN
A. Klasifikasi Tineola Bisselliella..........................................................................6
B. Morfologi Tineola Bisselliella...........................................................................7
BAB III METODE PENELITIAN
A. BAHAN DAN METODE..................................................................................8
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL PENELITIAN.......................................................................................12
B. PEMBAHASAN................................................................................................15
BAB V PENUTUP
A. KESIMPULAN..................................................................................................19
DAFTAR PUSTAKA
 BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Dalam hal jumlah spesies, serangga adalah kelompok organisme paling beragam di bumi.
Keberhasilan evolusioner mereka sebagian telah dikaitkan dengan kemampuan mereka untuk
mengelola manfaat terkait mikroba untuk memanfaatkan makanan yang tidak biasa.
Oleh karena itu, mikroba turunan serangga dikenal sebagai sumber daya hayati yang akan
dieksplorasi untuk kesejahteraan manusia, misalnya, untuk biokonversi sampah organik.
Ngengat pakaian Tineola bisselliella adalah hama sinantropis global karena ulat dapat
memakan pakaian dan karpet yang terbuat dari wol . Data autekologis, perilaku, dan historis
digabungkan dengan catatan faunistik yang diterbitkan menunjukkan bahwa spesies ini
mungkin berasal dari Tengah atau Selatan Afrika dan diperkenalkan ke Eropa pada akhir
abad ke-18. Preferensi untuk lingkungan kering mempromosikan penyebarannya ke seluruh
dunia selama abad ke-20 ketika iklim dalam ruangan berubah karena pengenalan sistem
pemanas sentral domestik.
T. bisselliella telah beradaptasi terutama untuk memberi makan pada bahan yang kaya
keratin, seperti bulu, pakaian wol, dan karpet. Keratin khususnya tahan terhadap degradasi
proteolitik karena ikatan disulfida yang melimpah (kandungan sistein = 7-13%), yang
membedakannya dari protein struktural lain seperti kolagen dan elastin. Hanya canggih
mikroba dapat mendegradasi keratin. Pustaka transkrip subtraktif dari usus T. Bisselliella
larva mengidentifikasi protease seperti serine dan chymotrypsin sebagai kandidat keratinase,
tetapi tidak keduanya protease mirip sistein atau metaloproteinase terdeteksi. Sampai saat ini
belum ada calon enzim keratinase dilaporkan, yang dapat memediasi pencernaan keratin di
usus T. bisselliella.
Mengingat banyak serangga yang terkait dengan mikroba menguntungkan yang
menyediakan enzim penting untuk adaptasi terhadap pola makan yang tidak biasa, kami
menyatakan bahwa mikroba dapat memainkan peran serupa di T. bisselliella. Untuk
mengetahui apakah kemampuan larva T. bisselliella dapat memanfaatkan keratin dibantu
oleh mikrobioma ususnya, kami mengisolasi bakteri dari usus ulat yang diberi makan bulu
sebagai satu-satunya sumber nutrisi. Supernatan kultur disaring untuk aktivitas keratinase
dengan menggunakan alat sederhana uji fotometrik dan strain yang paling menjanjikan
dianalisis secara lebih rinci. Di sini, kami melaporkan identifikasi strain Bacillus baru yang
ditemukan di usus larva T. bisselliella dengan kemampuan yang dapat mencerna keratin.
Budidaya strain pada bulu yang disterilkan diikuti dengan analisis proteomik supernatan
kultur dapat mengidentifikasi campuran kompleks enzim dan protein lain yang dapat
berkontribusi pada pencernaan keratin oleh ulat T. bisselliella.

A. RUMUSAN MASALAH
Adapun rumusan masalah yang di angkat sebagai dasar penulisan dan penelitian ini adalah
sebagai berikut:
1. Mengapa pola makan larva T. bisselliella yang tidak biasa dapat meningkatkan
keratinolitik?
2. Bagaimana proses isolasi bakteri usus larva T. Bisselliella ?

B. TUJUAN
1. Untuk mengetahui proses isolasi bakteri dalam usus larva T. Bisselliella

2. Untuk mengetahui metode yang digunakan dalam isolasi bakteri usus larva T.
Bisselliella
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Klasifikasi Tineola bisselliella

Tineola bisselliella , dikenal sebagai pakaian umum ngengat , pakaian anyaman ngengat ,
atau hanya pakaian ngengat , adalah spesies dari jamur ngengat ( keluarga Tineidae ,
subfamili Tineinae ). Ini adalah jenis spesies dari genus Tineola dan pertama kali
dikemukakan oleh Arvid David Hummel pada tahun 1823. Nama spesifiknya sering salah
dieja biselliella - misalnya oleh GAW Herrich-Schäffer ,
Klasifikasi Ilmiah
ketika ia mendirikan Tineola pada tahun 1853.
Kerajaan: Animalia
Divisi: Arthropoda
Kelas: Insecta
Memesan: Lepidoptera
Keluarga: Tineidae
Marga: Tineola
Jenis: T. bisselliella
Nama binomial
Tineola bisselliella
( Hummel , 1823)

larva ( ulat ) dari ngengat ini dianggap serius (hama) , karena mereka dapat memperoleh
makanan dari pakaian - di wol tertentu, dan di banyak serat alam lainnya. Serta biji-bijian.

B. Morfologi dari Tineola bisselliella

Tineola bisselliella adalah ngengat kecil dengan panjang tubuh 6–7 mm (0,24–0,28 inci)
dan lebar sayap 9–16 mm (0,35–0,63 inci), (paling umum 12–14 mm atau 0,47–0,55 inci).
Kepalanya berwarna okreous ringan seperti besi, terkadang berwarna kecoklatan. Sayap
depan pucat kekuningan-ochreous; dasar costa fuscous. Bagian belakang berwarna abu-abu
keputihan. (dibedakan dari spesies serupa dengan warna kuning kecoklatan atau warna
mencolok dan jambul merah jingga pada rambut di kepala).

Betina bertelur dalam kelompok antara 30 dan 200 yang menempel pada permukaan
dengan lem seperti gelatin. Ini menetas antara empat sampai sepuluh hari kemudian dan
menjadi ulat putih. Mereka juga akan memilin alas untuk makan. tidak diketahui dari mana
mereka akan muncul, sebagian pada malam hari atau dalam kondisi gelap untuk mendapatkan
makanan. Perkembangan ke tahap berikutnya berlangsung antara lima sampai 45 hari.
biasanya selama antara satu bulan hingga dua tahun sampai tahap kepompong tercapai. Pada
titik ini, ulat menjadi kepompong membutuhkan waktu sekitar 10–50 hari lagi untuk
berkembang menjadi dewasa.

Setelah kepompong selesai, ngengat dewasa muncul dan mulai mencari pasangan. Betina
cenderung bergerak lebih sedikit daripada jantan, dan kedua jenis kelamin lebih suka terbang
cepat di atas permukaan, beberapa ngengat dewasa tidak pernah terbang sama sekali. ngengat
dewasa dapat hidup selama 15–30 hari lagi, setelah itu mereka mati (jika tidak, kematian
terjadi tidak lama setelah kawin untuk jantan dan segera setelah bertelur untuk betina). Siklus
hidup dapat selesai dalam satu bulan di bawah kondisi yang paling menguntungkan (75 ° F
(24 ° C) dan kelembaban relatif 70-75% ) tetapi dapat memakan waktu beberapa tahun (suhu
dan kelembaban yang lebih rendah hanya akan memperlambat perkembangan, larva masih
akan menetas dan tumbuh pada suhu serendah 10 ° C (50 ° F) dan dapat bertahan hingga 33 °
C (91 ° F)).

Berbeda dengan ulat, ngengat dewasa tidak memberi makan: mereka memperoleh semua
nutrisi dan kelembapan yang mereka butuhkan selama dalam tahap larva, dan setelah menetas
dari kepompong, satu-satunya tujuan mereka adalah bereproduksi. Mereka hanya memiliki
bagian mulut yang berhenti berkembang dan tidak dapat memakan kain atau pakaian. Semua
kerusakan makan dilakukan oleh bentuk ulat (larva). Bangunan berpemanas memungkinkan
ngengat pakaian berkembang sepanjang tahun. Siklus hidup keseluruhan dari telur ke telur
biasanya memakan waktu 4–6 bulan, dengan dua generasi per tahun.
 BAB III
METODE PENELITIAN

A. Bahan-bahan dan metode-metode

3.1. Pemeliharaan Serangga dan Isolasi Bakteri
Spesimen T. bisselliella diperoleh dari Institut Federal untuk Penelitian Material
dan Pengujian (Berlin, Jerman) dan dibesarkan dengan pola makan bulu yang eksklusif pada
suhu kamar. Bulu-bulu tersebut disterilkan permukaannya dengan etanol 80% untuk
membunuh bakteri yang menempel sebelum pemberian makan. Ulat permukaan disterilkan
sebelum diseksi dan ekstraksi bakteri usus, yang dicapai oleh maserasi seluruh usus dalam
larutan saline buffer fosfat (PBS) steril dan menyiapkan pengenceran serial dari homogenate.
Sampel diambil dari berbagai bagian usus. Isolat diuji pada aktivitas proteolitik umumnya
pada pelat kasein, dan isolat positif dibudidayakan dengan keratin biru substrat (wol domba
berwarna biru) dalam PBS (37◦C) untuk memungkinkan kuantifikasi fotometrik (A 595 nm)
aktivitas keratinase, yang melepaskan pewarna biru ke dalam supernatan (Gambar 1 dan 2).

Satu unit aktivitas keratinase didefinisikan sebagai peningkatan absorbansi 0,01 saat
membandingkan sampel ke kontrol PBS. Keratinolisis bergantung pada pH, jadi kami
menguji semua isolat dalam buffer dengan kisaran pH 6-12 (Gambar 2). Isolat dengan
aktivitas keratinolitik tertinggi dipilih menggunakan analisis genomik. Kuantifikasi aktivitas
keratinase eksperimental diulang dua kali dengan tiga tabung elang per nilai pH yang diuji.
Gambar 1. Alur kerja eksperimental untuk identifikasi protein pengurai keratin pada bakteri
terkait dengan ngengat pakaian Tineola bisselliella. Larva ngengat pakaian
dikembangbiakkan dengan pola makan keratin, selama beberapa generasi sebelum isolasi
bakteri usus. Koloni bakteri individu kemudian diuji aktivitas keratinasenya dengan
menggunakan keratin azure sebagai substrat. DNA diekstraksi dari dua isolat bakteri yang
menunjukkan aktivitas terkuat dalam uji keratin biru serta kemampuan untuk tumbuh pada
seluruh bulu sebagai satu-satunya sumber nutrisi. Urutan genom disaring untuk pengkodean
protein gen yang memungkinkan identifikasi calon keratinase. Protein ekstraseluler diisolasi
dari Mikroorganisme supernatan bakteri yang tumbuh pada bulu sebagai sumber nutrisi
tunggal yang dianalisis dengan menggunakan LC MS-MS.
Gambar 2. Uji biru keratin untuk aktivitas keratinase strain bakteri.
Koloni bakteri diinokulasi dalam buffer PBS dengan substrat keratin biru (wol domba
berwarna biru) untuk memungkinkan kuantifikasi fotometrik aktivitas keratinase, yang
melepaskan pewarna biru ke dalam supernatan (kiri panel). Penambahan media kultur bakteri
tanpa bakteri digunakan sebagai kontrol negatif (-). Penambahan media kultur bakteri dengan
aktivitas keratinolitik tertinggi digunakan sebagai kontrol positif (+). Karena keratinolisis
bergantung pada pH, semua isolat diuji dalam buffer dengan kisaran pH 6-12 (panel kanan).

3.2. Pengurutan Genom dan Karakterisasi Bac18 yang Diisolasi dari T. Bisselliella
Pengurutan dilakukan di Max Planck Genome Center (Cologne, Jerman) menggunakan
teknologi instrumen Sekuel Biosains Pasifik. Sebanyak 90.570 PacBio bacaan mentah itu
dirakit dengan HGAP3 (Hierarchical Genome Assembly Process 3) dengan opsi default dan
sebuah perkirakan ukuran genom 5 Mb. Kami memeriksa contig yang melingkar
menggunakan Circlator 1.5.1. dalam mode "semua" menggunakan pembacaan yang dikoreksi
dari pipa HGAP3. Anotasi genom dilakukan dengan menggunakan hasil dari Circlator untuk
Prokka 1.11. dalam mode default dengan "Bacteria" sebagai kerajaan. Urutan nukleotida
selaras dari salinan gen 16S rRNA yang diselaraskan dengan Clustal X. Referensi terdekat
genom (diurutkan dan dirakit sepenuhnya) diperkirakan menggunakan Reference Seeker
( pencari referensi ) 1.10. sebagai default mode dengan database "bakteri" yang
diimplementasikan (Agustus 2019). Bac18 dianalisis secara global urutan identitasnya
dengan menggunakan Reference Seeker dan paket MUMmer3.

3.3. Prediksi Gen Target

Untuk deteksi gen yang terlibat dalam degradasi keratin, UniProt (The UniProt Consortium,
2019, tanggal: 29 Agustus 2019) dicari dengan kata kunci “keratinase” dan dihasilkan
FASTA (kanonik) dan file teks terkait telah diunduh. Entri non-keratinase (A0A1S6Y3A5,
A0A0G3BBA5) diidentifikasi secara manual dan dihapus sebelum analisis lebih lanjut.
Domain Pfam, diekstraksi dari file teks UniProt yang telah dikoreksi. Pada langkah kedua,
urutan pengkodean di Bac18 (diprediksi menggunakan Prokka) dibandingkan dengan
database PfamA-31 menggunakan perintah hmmscan –domtblout, –noali, dan –notextw di
HMMER v3.1b2. Anotasi Pfam yang sesuai dicari keratinase domain dan diklasifikasikan
menggunakan skrip internal. Pada langkah terakhir, kami melakukan penyelarasan lokal
semua urutan pengkodean dan hasil keratinase dari UniProt menggunakan BLASTp di
BLAST v2.6.0 +.
3.4. Analisis Proteomik
Protein bakteri ekstraseluler yang terkandung dalam media yang dilengkapi bulu,
terkonsentrasi menggunakan spin kolom ultrafiltrasi Vivaspin ™ (GE Healthcare Life
Sciences) sesuai dengan rekomendasi produsen. Campuran protein kemudian dipisahkan
dengan menggunakan natrium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-
PAGE) pada 4–12% Criterion XT gradient gel (BioRad, Hercules, CA, USA) dengan XT
MES menjalankan buffer pada 125 V selama 1,5 jam. Molekuler berat (kDa) dari protein
dipisahkan dengan penanda yang sudah diwarnai dan tidak diwarnai dengan protein presisi
massa tinggi. Untuk analisis LC-MS / MS, pita protein dipotong dari gel menjadi 10 blok
berat molekul per jalur, diikuti oleh pencernaan tryptic. Pengolahan sampel LC-MS, akuisisi
data, dan pengolahan data dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. MS BLAST
digunakan untuk mencari database yang berasal dari terjemahan in silico genom Bac18.
Parameter pencarian yang menentukan akurasi pengukuran massa, jumlah minimum ion
produk cocok per peptida, jumlah minimum pencocokan ion produk per protein, minimum
jumlah pertandingan peptida, dan jumlah maksimum situs pembelahan triptik yang terlewat
dirinci di Bahan Pelengkap.
 BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. HASIL PENELITIAN
4.1. Identifikasi Kandidat Bakteri dan Pengurutan Genom
Bakteri pendegradasi keratin dan kandidat keratinase di usus larva T. bisselliella
diidentifikasi dengan mengikuti skema yang ditunjukkan pada Gambar 1. Pertama, kami
membedah isi perut larva T. Bisselliella pada pola makan eksklusif berbasis keratin dan
dibudidayakan dengan homogenat usus encer serial pada kasein untuk mengidentifikasi
koloni dengan aktivitas proteolitik ekstraseluler. Koloni individu kemudian diinokulasi ke
dalam substrat keratin biru, yang menghasilkan pewarna biru yang mudah dideteksi saat
dicerna (Gambar 2). Kami juga menguji aktivitas keratinolitiknya dengan menginkubasi
bakteri dalam buffer non-nutrisi yang mengandung bulu, yang mulai terfragmentasi dengan
adanya aktivitas keratinase. Berdasarkan hasil ini, kami memilih koloni bakteri individu
dengan aktivitas keratinolitik keseluruhan tertinggi untuk sekuensing genom. Penjajaran gen
16S rRNA menunjukkan bahwa isolat bakteri yang terpilih mewakili spesies dan strain yang
sama. Oleh karena itu kami fokus pada salah satu dari dua kandidat Bacillus (Bac18) untuk
selanjutnya menganalisis genom, proteomik, dan uji keratinase.

Draf genom terakhir Bac18 diwakili oleh satu genom kromosom sirkuler dengan ukuran
5.2 Mb dan tambahan lima contig kecil dengan total panjang 827 kb (Tabel 1). Kami
mengidentifikasi 5946 urutan pengkodean protein, 14 cluster gen rRNA, dan 106 gen tRNA.
Urutan nukleotida penyelarasan salinan gen 16S rRNA mengarah pada identifikasi delapan
varian berbeda yang berbeda dari satu sama lain dengan SNP di enam posisi variabel.
Kerabat terdekat di seluruh tingkat genom dihitung menggunakan semua genom yang
tersedia untuk umum yang diurutkan dan dirakit sepenuhnya (Tabel 2). Perhitungan ini
mencakup contig kecil Bac18 serta urutan plasmid potensial dari referensi. DNA yang
dilestarikan adalah fraksi dari kedua genom yang homolog sedangkan ANI adalah rata-rata
identitas nukleotida wilayah homolog ini.

Tabel 1. Statistik perakitan untuk Bac 18. Bersebelahan dengan pengedaran yang ditandai

Tabel 2. Referensi genom terdekat untuk Bac18 dihitung dengan Pencari Referensi.

Kami menemukan bahwa Bac18 dan Bacillus sp. FDAARGOS_235 berbagi 83,93% dari
genomnya (diawetkan DNA) dengan identitas nukleotida rata-rata keseluruhan (ANI) sebesar
99,56%. Dalam hal ini harus diperhatikan bahwa contig kecil Bac18 membentuk ~ 14% dari
panjang genom. Visualisasi file kemiripan struktural urutan kromosom Bac18 dengan
Bacillus sp. FDAARGOS_235 ditampilkan pada Gambar 3, di mana daerah homolog antara
kedua genom direpresentasikan dengan warna merah (homolog urutan dengan orientasi yang
sama) dan hijau (komplemen terbalik, tetapi wilayah homolog). Tidak seperti kesamaan
whole-contig yang terdeteksi untuk contig kecil masing-masing Bac18 dengan plasmid
referensi terdekat. Namun demikian, kami dapat mendeteksi homologi dari fragmen Bac18
kecil contigs dengan sekuens plasmid yang tersedia untuk umum menggunakan analisis
BLASTn. Namun, tidak satupun dari ini plasmid tertutup sepenuhnya.

Gambar 3. Visualisasi kemiripan struktur Bac18 dan Bacillus sp. FDAARGOS_235 genom
kromosom dihitung dengan Nucmer. Genom diberikan sebagai kotak putih di bagian atas
(Bac18) dan bagian bawah ilustrasi (Bacillus sp.). Sebagai perbandingan, kedua genom
sirkuler dibuka pada posisi awal gen dnaA. Merah: urutan homolog dengan orientasi yang
sama; hijau: komplemen terbalik, tetapi urutan homolog, putih: daerah tanpa homologi.

4.2. Prediksi Kandidat Gen dan Analisis Proteomik

Kami mencari genom Bac18 yang berpotensi dalam pengkodean gen keratinase dan
mengidentifikasi 20 urutan dengan domain keratinase yang diprediksi seperti yang ditemukan
di Pfam. Urutan asam amino dari 20 kandidat digunakan sebagai pertanyaan BLAST
terhadap entri keratinase di UniProt. Tabel 3 menunjukkan hasil terbaik melawan UniProt
yang difilter untuk cakupan urutan (≥70%) dan identitas urutan (≥40%). Dengan cakupan
urutan dari 100% dan urutan identitas 98% gen PROKKA_03102 memiliki skor ledakan
tertinggi terhadap keratinase yang termasuk dalam UniProt. Supernatan dari media non
nutrien yang mengandung terfragmentasi bulu dikumpulkan setelah Bac18 tumbuh selama 72
jam, memungkinkan kami untuk mengidentifikasi kandidat protein ekstraseluler dengan
aktivitas keratinase. Protein ekstraseluler terkonsentrasi dipisahkan oleh SDS-PAGE dan pita
diamati dengan massa molekul yang tampak mulai dari <5 kDa hingga > 100 kDa (Gambar
4). Jalur gel dibagi menjadi sepuluh blok yang mencakup rentang ukuran yang berbeda
pencernaan dalam gel dengan tripsin. Peptida yang dihasilkan kemudian dianalisis dengan
LC-MS / MS menggunakan protein. urutan yang diprediksi secara in silico dari genom Bac18
sebagai database.

Gambar 4. Analisis protein ekstraseluler yang diisolasi dari supernatan Bac18 yang tumbuh
pada bulu sebagai satu-satunya sumber nutrisi. Panel kiri menunjukkan gel protein SDS-
PAGE dibagi menjadi 10 zona dengan perbedaan kisaran berat molekul (PM = penanda
ukuran protein). Panel kanan menunjukkan properti yang diidentifikasi protein, termasuk
massa yang diprediksi, deskripsi, dan jumlah peptida yang ditetapkan. Pencocokan protein
yang diprediksi dalam genom bakteri terdaftar dalam Bahan Tambahan elektronik, File S1.

Tabel 3. Prediksi gen Bac18 yang memasukkan domain Pfam yang berhubungan dengan
keratinase.
 Kami mengidentifikasi 63 protein berbeda dalam supernatan kultur yang dilengkapi bulu
yang cocok urutan yang diprediksi dalam genom Bac18 menggunakan kriteria cut-off
proteomik kami (Bahan Pelengkap,File S1). Kami kemudian berfokus pada kandidat yang
memiliki bukti langsung atau tidak langsung keterlibatan dalam pemanfaatan keratin.
Kelompok terbesar dari protein ini diberi keterangan sebagai protease. Kami mengidentifikasi
16 protease berbeda, termasuk tipe serine dan metaloproteinase, dengan prediksi massa
protein 18–135 kDa (Gambar 4). Yang menarik adalah protease kandidat yang terkait dengan
keratinase bakteri yang sebelumnya dikarakterisasi, seperti metaloprotease ekstraseluler
spesifik dan keluarga subtilisin dari serine protease. Kami juga mengidentifikasi
oksidoreduktase tiol-disulfida, yang kemungkinan besar untuk memfasilitasi degradasi
proteolitik keratin dengan mempromosikan hidrolisis ikatan disulfida.

B. PEMBAHASAN

Ulat dari ngengat pakaian T. bisselliella makan terutama pada bahan berbasis keratin
tersebut seperti bulu, rambut, dan wol. Usus tengah serangga ini bersifat anaerobik dengan
potensi redoks negatif, yang diusulkan untuk memfasilitasi solubilisasi keratin dengan
mengurangi ikatan disulfida, memungkinkan pencernaan oleh protease yang lebih luas.
Namun, di lingkungan dengan potensi redoks yang tinggi, hanya sebagian dari protease yang
dapat mendegradasi substrat keratin. Analisis sediaan usus kasar menghasilkan identifikasi
aktivitas aminopeptidase dan l-Cysteine lyase, tetapi tidak ada cysteine endopeptidase atau
aktivitas metaloprotease ditemukan. Meskipun banyak protease serine dengan tingkat
ekspresi yang tinggi diidentifikasi dalam transkriptom usus T. bisselliella, keterlibatan
mereka dalam proteolisis keratin tidak jelas.

Oleh karena itu, masih harus ditentukan apakah protease serine dikodekan oleh serangga
inang genom dapat memproses keratin, atau apakah diperlukan fungsi enzimatis atau
fisiologis tambahan untuk memulai degradasi molekul ini dengan mengurangi ikatan
disulfida yang melimpah.

Penjelasan alternatif untuk adaptasi ngengat pakaian ke pola makan berbasis keratin
adalah aktivitas keratinase yang diberikan oleh simbion bakteri tertentu di usus. Meski studi
sebelumnya tidak ditemukan mikroorganisme yang melimpah pada larva T. bisselliella, kami
dapat mengisolasi secara reproduktif. bakteri dari usus tengah larva yang diberi pakan bulu.
Sebagian besar isolat diidentifikasi sebagai Clostridiales, Lactobacillales, dan genus Bacillus,
mirip dengan bakteri yang berasosiasi dengan coklat ngengat rumah Hofmannophila
pseudospretella, lepidopteran pemakan keratin lainnya. Setelah penyaringan strain bakteri
yang diisolasi dari usus dengan kemampuannya sebagai pendegradasi keratin, kami memilih
dua isolat yang menunjukkan aktivitas keratinase tingkat tertinggi pada uji keratin biru dan
bulu utuh. Ini ditemukan mewakili spesies yang sama, dan sekuensing genom dari isolat
Bac18 diidentifikasi strain Bacillus baru yang memiliki hubungan dekat dengan Bacillus sp.
FDAARGOS_235 dan B. thuringiensis. Menariknya, spesies Bacillus dominan di antara
bakteri yang menunjukkan aktivitas keratinase, dan sedang diketahui menyandikan beberapa
protease pengurai keratin.

Pada makanan keratin, larva ngengat pakaian berkembang sangat lambat, kemungkinan
karena keterbatasannya ketersediaan sumber nitrogen yang mudah diakses. Demikian juga,
dalam pengujian kami menggunakan buffer non-nutrien yang dilengkapi dengan bulu utuh,
bakteri terkait usus yang diinokulasi menunjukkan pertumbuhan yang lambat. Kapan larva
ngengat pakaian atau bakteri yang berhubungan dengan usus hanya diberi keratin (bulu utuh
dalam percobaan kami) sebagai sumber nitrogen, kami berhipotesis bahwa mekanisme
asimilasi nitrogen adalah diinduksi, termasuk ekspresi dan sekresi enzim aktif-keratin, yang
kemudian membutuhkan pemrosesan polipeptida dan transpor aktif. Dengan demikian,
analisis proteomik kultur supernatan dari Bac18 ditanam di media non-nutrisi yang
dilengkapi dengan bulu, ditemukan adanya enzim yang berpotensi mendegradasi keratin,
termasuk kolagenase dan lainnya serine protease, metaloprotease, dan oksidoreduktase tiol-
disulfida. Temuan ini mendukung hipotesis kami, bahwa pola makan larva T. bisselliella
yang tidak biasa dapat meningkatkan hubungannya dengan keratinolitik mikroorganisme dan
pencernaan keratin yang berpotensi didukung oleh bakteri dalam usus larva. Oksidoreduktase
tiol-disulfida sangat menarik karena enzim ini dapat menghidrolisis ikatan disulfida, sehingga
memungkinkan degradasi proteolitik lengkap dari keratin dan asimilasi nitrogen berikutnya.

Kami juga mendeteksi campuran kompleks yang mengejutkan dari banyak protease
ekstraseluler enzim yang memodifikasi dinding sel bakteri, protein pengikat peptida,
transporter, dan respons stres faktor. Fungsi-fungsi ini sepadan dengan stres yang diantisipasi
ketika bakteri dipaksa untuk tumbuh pada keratin sebagai satu-satunya sumber nutrisi. Studi
sebelumnya tentang keratinase bakteri yang ditinjau telah terfokus pada satu enzim dengan
mengabaikan kompleksitas proteome ekstraseluler. Adanya campuran kaya protein
ekstraseluler menunjukkan bahwa aksi kombinatorial multipel enzim, transporter, dan respon
stres protein memastikan degradasi keratin yang lebih efisien dibandingkan dengan satu
protease terisolasi. Hipotesis ini didukung oleh laporan-laporan sebelumnya yang valid.
Spesies Bacillus menyandikan banyak protease yang mewakili kelas fungsional yang berbeda
dengan protein berbeda massa yang memiliki aktivitas keratinase.

Berdasarkan protein yang terdeteksi dalam supernatan Bac18 yang dibudidayakan dalam
media bebas nutrisi dilengkapi dengan bulu, kami mengusulkan bahwa pencernaan keratin
adalah proses multistep yang dimulai dengan pemutusan ikatan disulfida oleh
oksidoreduktase tiol-disulfida, meningkatkan aksesibilitas keratin polipeptida untuk
campuran exopeptidases (aminopeptidases dan dipeptidyl peptidases) dan protease endo-aktif
seperti subtilisin, kolagenase, dan metaloendoprotease lainnya, dan oligoendopeptidase. Ini
mencerna keratin menjadi peptida yang lebih pendek dan asam amino bebas diasingkan oleh
protein transportasi dan diasimilasi. Hasil dari kami tidak menutup kemungkinan bahwa T.
bisselliella juga menghasilkan enzimnya sendiri yang berkontribusi pada pencernaan keratin,
tetapi sejenis dengan keratinase asli belum teridentifikasi. Bakteri pengurai keratin yang
terisolasi dapat membantu menjelaskan kemampuan T. bisselliella untuk menempati ceruk
ekologis yang unik. Secara mencolok, tarantula Chilobrachys guangxiensis, yang
membutuhkan enzim yang kuat untuk mencerna mangsa yang tidak dapat bergerak menjadi
cairan yang diambil dengan mulut seperti jerami ke dalam usus, juga ditemukan adanya
bakteri perusak bulu di usus yang memproduksi keratinase. Bakteri penghasil keratinase
tersebut sangat menarik untuk pengaplikasian dalam ilmu bioteknologi, khususnya dalam
biokonversi limbah kaya keratin seperti bulu, rambut, dan tekstil wol. Selanjutnya, kami
memperluas jumlah bakteri yang terkait dengan serangga hama ngengat.

BAB V

PENUTUP

A. KESIMPULAN

Ulat dari ngengat pakaian T. bisselliella memakan makanan terutama yang berasal dari
keratin seperti ; bulu, rambut, dan wol. Usus tengah serangga ini bersifat anaerobik dengan
potensi redoks negatif, yang diusulkan untuk memfasilitasi solubilisasi keratin dengan
mengurangi ikatan disulfida, memungkinkan pencernaan oleh protease yang lebih luas.
Namun, bahkan di lingkungan dengan potensi redoks yang tinggi, hanya sebagian dari
protease yang dapat mendegradasi substrat keratin. Analisis sediaan usus kasar menghasilkan
identifikasi aktivitas aminopeptidase dan l-Cysteine lyase, tetapi tidak ada cysteine
endopeptidase atau aktivitas metaloprotease ditemukan. Meskipun banyak protease serine
dengan tingkat ekspresi yang tinggi diidentifikasi dalam transkriptom usus T. bisselliella,
keterlibatan mereka dalam proteolisis keratin tidak jelas.

Oleh karena itu, masih harus ditentukan apakah protease serine dikodekan oleh serangga
inang genom dapat memproses keratin, atau apakah diperlukan fungsi enzimatis atau
fisiologis tambahan untuk memulai degradasi molekul ini dengan mengurangi ikatan
disulfida yang melimpah.

DAFTAR PUSTAKA

1. Douglas,A.E.Multiorganismal insects: Diversity and function of resident

microorganisms.Annu.Rev.Entomol.2015, 60, 17–34. [CrossRef] [PubMed]
2. Berasategui, A.; Shukla, S.; Salem, H.; Kaltenpoth, M. Potential applications of insect
symbionts in biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 1567–1577.
[CrossRef] [PubMed]
3. Plarre, R.; Krüger-Carstensen, B. An attempt to reconstruct the natural and cultural
history of the webbing clothes moth Tineola bisselliella Hummel (Lepidoptera:
Tineidae).J.Entomol.Acarol.Res.2011,43,83–93.[CrossRef]
4. Verma, A.; Singh, H.; Anwar, S.; Chattopadhyay, A.; Tiwari, K.K.; Kaur, S.; Dhilon,
G. Keratin: Dissolution, extraction and biomedical application. Crit. Rev. Biotechnol.
2017, 37, 476–491. [CrossRef]
5. Wan, W.-L.; Chen, M.-Y.; Tu, I.-F.; Lin, Y.-C.; EswarKumar, N.; Chen, M.-Y.; Ho,
M.-C.; Wu, S.-H. The discoveryof novel heat-stable keratinases from Meiothermus
taiwanensis WR-220 and other extremophiles. Sci. Rep.2017, 7, 4658. [CrossRef]
6. Hughes, J.; Vogler, A.P. Gene expression in the gut of keratin-feeding clothes moths
(Tineola) and keratin beetles (Trox) revealed by subtracted cDNA libraries. Insect
Biochem. Mol. Biol. 2006, 36, 584–592. [CrossRef]
7. Chin, C.S.; Alexander, D.H.; Marks, P.; Klammer, A.A.; Drake, J.; Heiner, C.; Clum,
A.; Copeland, A.;Huddleston, J.; Eichler, E.E.; et al. Nonhybrid, finished microbial
genome assemblies from long-read SMRTsequencing data. Nat. Methods 2013, 10,
563–569. [CrossRef]
8. Hunt, M.; Silva, N.D.; Otto, T.D.; Parkhill, J.; Keane, J.A.; Harris, S.R. Circlator:
Automated circularization of genome assemblies using long sequencing reads.
Genome Biol. 2015, 16, 1–10. [CrossRef]
9. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 2014, 30,
2068–2069. [CrossRef]
10. Larkin, M.A.; Blackshields, G.; Brown, N.P.; Chenna, R.; McGettigan, P.A.;
McWilliam, H.; Balentin, F.;Vallace, I.M.; Wilm, A.; Lopez, R.; et al. Clustal W and
Clustal X version 2.0. Bioinformatics 2007, 23, 2947–2948.[CrossRef]
11. Schwengers, O.; Hain, T.; Chakraborty, T.; Goesmann, A. ReferenceSeeker: Rapid
Determination of Appropriate Reference Genomes. GitHub. 2019. Available online:
https://github.com/oschwengers/referenceseeker (accessed on 13 September 2020).
12. Kurtz, S.; Phillippy, A.; Delcher, A.L.; Smoot, M.; Shumway, M.; Antonescu, C.;
Salzberg, S.L. Versatile and open software for comparing large genomes. Genome
Biol. 2004, 5, R12. [CrossRef] [PubMed]
13. El-Gebali, S.; Mistry, J.; Bateman, A.; Eddy, S.R.; Luciani, A.; Potter, S.C.; Qureshi,
M.; Richardson, L.J.;Salazar, G.A.; Smart, A.; et al. The Pfam protein families
database in 2019. Nucleic Acids Res. 2019, 47,D427–D432. [CrossRef]
14. Altschul, S.F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E.W.; Lipman, D.J. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol.1990, 215, 403–410. [CrossRef]
15. Shevchenko, A.; Tomas, H.; Havlis, J.; Olsen, J.V.; Mann, M. In-gel digestion for
mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 2006, 1,
2856–2860. [CrossRef]
16. Skaljac, M.; Vogel, H.; Wielsch, N.; Mihajlovic, S.; Vilcinskas, A. Transmission of a
protease-secreting bacterial symbiont among pea aphids via host plants. Front.
Physiol. 2019, 10, 438. [CrossRef] [PubMed]
17. Waterhouse, D.F. Wool digestion and mothproofing. In Advances in Pest Control
Research, 2nd ed.; Metcalf, R.L.,Ed.; Interscience: New York, NY, USA, 1958; pp.
207–262.
18. Ramnani, P.; Gupta, R. Keratinases vis-a-vis conventional proteases and feather
degradation. World J.Microbiol. Biotechnol. 2007, 23, 1537–1540. [CrossRef]
19. Christeller, J.T.; Markwick, N.P.; Burgess, E.P. Midgut proteinase activities of three
keratinolytic larvae,Hofmannophila pseudospretella, Tineola bisseliella, and
Anthrenocerus australis, and the effect of proteinase inhibitors on proteolysis. Arch.
Insect Biochem. Physiol. 1994, 25, 159–173. [CrossRef]
20. Yoshimura, T.; Tabata, H.; Nishio, M.; Ide, E.; Yamaoka, R.; Hayashiya, K. L-
Cystein lyase of the webbing clothes moth, Tineola bisselliella. Insect Biochem. 1988,
18, 771–777. [CrossRef]
21. Crewther, W.G.; McQuade, A.B. The intestinal microflora of the clothes moth
Tineola bisselliella in relation to wool digestion. J. Gen. Microbiol. 1955, 12, 311–
313. [CrossRef]
22. Kasper, C.S. Ultrastructure of the Digestive System of the Larval Clothes Moth
Tineola bisselliella (Humm.).Ph.D. Thesis, Boston University Graduate School,
Boston, MA, USA, 1978; Unpublished work.
23. Shannon, A.L.; Attwood, G.; Hopcroft, D.H.; Christeller, J.T. Characterization of
lactic acid bacteria in thelarval midgut of the keratinophagous lepidopteran,
Hofmannophila pseudospretella. Lett. Appl. Microbiol. 2001,32, 36–41. [CrossRef]
24. Daroit, D.J.; Brandelli, A. A current assessment on the production of bacterial
keratinases. Crit. Rev. Biotechnol.2014, 34, 372–384. [CrossRef] [PubMed]
25. Yamamura, S.; Morita, Y.; Hasan, Q.; Yokoyama, K.; Tamiya, E. Keratin
degradation: A cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 294, 1138–1143. [CrossRef]
26. Lange, L.; Huang, Y.; Busk, P.K. Microbial decomposition of keratin in nature—A
new hypothesis of industrial relevance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100,
2083–2096. [CrossRef] [PubMed]
27. Brandelli, A.; Daroit, D.J.; Riffel, A. Biochemical features of microbial keratinases
and their production and applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 1735–
1750. [CrossRef]
28. Gupta, R.; Ramnani, P. Microbial keratinases and their prospective applications: An
overview.Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 70, 21–33. [CrossRef]
29. Liu, Q.; Zhang, T.; Song, N.; Li, Q.; Wang, Z.; Zhang, X.; Lu, X.; Fang, J.; Chen, J.
Purification and characterization of four key enzymes from a feather-degrading
Bacillus subtilis from the gut of tarantula Chilobrachys guangxiensis. Int. Biodeterior.
Biodegrad. 2014, 96, 26–32. [CrossRef]
30. Mereghetti, V.; Chouaia, B.; Montagna, M. New insights into the microbiota of moth
pests. Int. J. Mol. Sci.2017, 18, 2450. [CrossRef]