Pemeriksaan Penunjang Imunologi

(immunoassay)

1
Putu Oky
 Definisi Immunoassay
• Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan
untuk mengukur adanya antigen atau antibodi pada
sampel (spesimen bilogikal)
• Immunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte
yang ingin diukur
• Analyte  sesuatu yg diukur dengan tes
laboratorium  dapat berupa Ag atau Ab dalam
serum
• Tujuan immunoassay ini adalah untuk mendiagnosa
suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun
dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst)
2
 Prinsip Immunoassay
• Prinsip immunoassay  reaksi ikatan spesifik
Ab-Ag  membentuk kompleks Ag-Ab
• Utk deteksi Antigen : digunakan Antibodi
(monoklonal ataupun polikonal ) sehingga
membentuk kompleks Imun (Ag-Ab) 
kompleks imun dapat diukur secara kualitatif atau
kuantitatif
• Serology : metode utk mendeteksi dan mengukur
titer antibodi dalam serum darah dengan
menambahkan Ag spesifiknya
• 2 tipe Antibodi yang digunakan dlm
immunoassay: poliklonal dan monoklonal
3
Pembuatan Antibodi monoklonal
spesifik

Sel B

4
 Antibodi Poliklonal

Jika hewan coba diimunisasi dengan

protein X (Ag) yg memiliki banyak epitop
terhadap antibodi  klon sel B
memproduksi antibodi thd protein X
Antibodi mungkin akan membentuk
sejumlah paratop protein yang berbeda
Campuran Ab yg diproduksi oleh respon
terhadap antigen merupakan antibodi
poliklonal
5
• Sampel yang diuji dapat berasal dari :
– Antigen sample
• Cairan tubuh yang mengandung mikroba
penginfeksi dan toksin mikroba (mengandung Ag)
Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, cairan
amnion, mucous, etc.
– Blood antiserum sample
• Antiserum/ antisera darah mengandung Ab
terhadap infeksi tertentu  jika pasien terinfeksi
oleh patogen yang dicurigai maka pada serumnya
akan mengandung Ab terhadap patogen tsb.
• Pengujian Ab pada darah setidaknya terdeteksi 2
minggu seteah imfeksi awal
6
 Titer

• Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum

 Dapat digunakan untuk menentukan sejauh mana
suatu penyakit mengalami peningkatan pada
infeksinya
• Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untuk
mendeteksi titer Ab pada seseorang
• Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab sama
sekali lalu Ab meningkat 
“seroconversion”
7
Komponen Penting Dalam Immunoassay

a. Spesifisitas Antibodi
b. Valensi Antibodi
c. Aviditas Antibodi
d. Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab

8
 a. Spesifisitas Antibodi
• Ikatan Ag-Ab  spesifik  key-lock
• Namun terkadang terjadi reaksi silang  Ab
berikatan dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip
 terjadi jika kemurnian Ag rendah
Ab yang sangat spesifik : yang memiliki binding site
yang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekul
yang unik
Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :
1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel
2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg
mengkontaminasi)
9
 b. Valensi Antibodi
• Jumlah binding site yang potensial dari Ab
terhadap Ag yg spesifik
• Valensi Ab minimal 2  umumnya

10
 c. Aviditas Antibodi

• Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag

• Ab dg Aviditas besar kecenderungan
mengikat Ag yang banyak
• Aviditas  refleksi afinitas (besarnya daya ikat)
dan jumlah binding site (valensi)

11
d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab

• Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahan

tertentu dalam serum harus dapat diukur 
dinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu
• Beberapa cara penentuan :
1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu
bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji +
atau - )
cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahan
warna pada penentuan Hbs Ag

12
2. Semikuantitatif : kadar Ab atau Ag pada
serum  dengan cara pengenceran serum
secara progresif
• Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer
• Cth : uji Widal

3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan

membuat kurva baku standar terlebih
dahulu terhadap kekeruhan (OD) 
didapat nilai korelasi
Contoh : ELISA
13
 Macam Immunoassay
• Terdapat beberapa metode yang digunakan utk
mendeteksi Ag-Ab, antara lain :
• Immunoassay tak berlabel :
a. Uji Presipitasi
b. Uji Aglutinasi
c. Uji Hemaglutinasi
d. Lisis Imun
e. Uji Netralisasi

14
• Immunoassay berlabel :

a. Berlabel Flouresens
b. Berlabel Radioisotop
c. Luminescent Assay (LIA)
d. Berlabel Enzim

15
 Immunoasay tak berlabel
a. Uji presipitasi
 Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya
 Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai :
1. Uji presipitasi lempeng/ slide
cth : uji VDRL mikro
2. Uji presipitasi tabung
3. Uji presipitasi tabung kapiler
cth : uji CRP
4. Uji presipitasi cincin
 terbentuk cincin presipitasi (uji +)
5. Imunoelektroforesis
 prinsip sama dengan elektroforesis
16
Liquid Precipitation
 b. Uji Aglutinasi
• Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel
• Macam-macam uji Aglutinasi :
1. Uji Aglutinasi lempeng
cth : uji Widal Lempeng  deteksi Ab thd S.
Paratyphi
2. Uji Aglutinasi tabung
- Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat
3. Uji Hambatan Aglutinasi
 utk menentukan Ag larut yg tdk diketahui
identitasnya
cth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive
Hemagglutination Test) utk penentuan
HBs Ag
18
Uji aglutinasi : keberadaan Staphylococcus (antigen)
direaksikan dengan IgG thd Staphylococcus

Reaksi + jika ada kompleks imun

19
 c. Uji Hemaglutinasi
• Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah
• Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada
pada darah
• Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah
• Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes
agutinasi
Cth : uji penentuan golongan darah
• Jika darah memiliki Ag bergolongan A 
aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A

20
 d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen
Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx
terhadap Ag pada permukaan sel
Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan anti-
imunoglobulin/ Ab thd Abx
 Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen 
lisis sel
 Macam uji lisis imun :
Uji Fiksasi Komplemen
cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit
Interpretasi : + jika tidak hemolisis
- hemolisis 21
22
 Immunoassay berlabel
1. Berlabel flourescent
• Uji immunoflourescent (IFA)  ikatan/ kompleks
Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaran
flouresen dibawah mikroskop
• Immunoflourecent :
1. Direct immunoflourescent :
• Ab dilabel dg marker flourescent  Ab secara
langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan
2. In-direct immunoflourescent
• Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji
dengan Ab sekunder yang berlabel (yang
berikatan spesifik dg Ab pertama)
• Semakin banyak ikatan Ab sekunder  sinyal
floresen semakin meningkat
23
• Immunocytochemistry/ Immunofluorescence - Anti-alpha
smooth muscle Actin antibody [1A4] (ab7817) staining alpha
smooth muscle Actin (green) in Mouse primary colon
myofibroblasts 24
 Direct Immunoflourescent
Fluorescent marker
antibody

antigen
Frozen tissue
section
25
 Indirect immunofluorescece
2nd antibody with
label

antigen 1st antibody

26
2. Berlabel radioisotop
• uji laboratoris yg sensitif  utk penentuan
kadar beberapa bahan (hormon)
• Diperlukan sampel dg bahan yg sedikit
sudah dpt terdeteksi
• Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay)
• Pelabelan dengan Radioisotop yg dipakai
pada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I
• Keberadaan ik Ag-Ab yang berlabel 
diukur dengan gamma counter

27
3. Berlabel luminescent

 uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dg

RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksi
Ag-Ab menggunakan luminescent
 luminescent : a. bioluminescent : kunang2
b. chemiluninescent
4. Berlabel enzim
 pemberian label enzim pada Ag (ELISA)
• Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produk
reaksi berwarna (chromogen) – intensitas warna
menunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel
• Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase
28
 ELISA
• Enzyme Linked Immunosorbent Assay
• Prinsip menggunakan reaksi perubahan warna
(Colorimetric assay)
• Enzim yg ditambahkan akan bereaksi dengan substrat 
memproduksi produk yg berubah warna
• Direct
- cth. Pada test kehamilan / test pack (hormon hCG)
• Indirect
– Test HIV (rapid test)
ELISA
iMark Microplate
Absorbance Reader

Micro-plate reader

Positive result

96-well micro-plate
 Imunohistokimia
• Immunohistochemistry (IHC) mengkombinasikan
teknik histologi, imunologi dan biokimia 
identifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksi
spesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg
penempelan label
• Label : flourescent, enzym, hapten, radioaktif
• Ab mengikat Ag secara spesifik
• Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada
jaringan/ organ di preparat/ slide
• Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2
selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis
32
Human ovarian Tumor, HE staining
Sediaan tumor ovarium
pada obyek glass

Pada sediaan, ingin Pada sel yg apoptosis

dilihat sel yg apoptosis trdpt protein Fas L
(sebagai Ag)
label
Di inkubasi dengan anti
protein FasL (sebagai Ab)

Label akan tervisualisasi

Apoptotic cell
jika ada kompleks Ag-Ab

33
 Aplikasi immunoassay
1. Deteksi hormon polipeptida ; cth : insulin and
glucagon, hCG
2. Deteksi hormon steroid
3. Deteksi agen therapeutic  pada pemantauan
terapi obat; dan penyalahgunaan obat
4. Pengukuran enzim , protein dan komponen
terlarut dalam darah lainnya; cth : pengukuran
protein plasma, komplemen
5. Penggunaan penanda penyakit (disease marker)
34
Keuntungan menggunakan imunoasay :

• sensitif untuk jumlah sampel yg rendah (ug/L (ppb)

• pemeriksaan cepat
• pemeriksaan relatif mudah dilakukan
• Pemeriksaan dapat dilakukan dimana saja (dg alat
penunjang)

Kelemahan menggunakan imunoasay :

• reaksi silang /cross reaction – Ab mungkin dapat

berikatan silang dg struktur Ag yg serupa
• Relatif susah untuk menganalisa larutan yang
bermacam-macam
 Vaksinasi
• Vaksinasi adalah aplikasi dari pirinsip imunoassay yang
populer  mengandung antigen dari suatu
mikroorganism (patogen)
• Adanya paparan 1st Ag menginduksi sel B dan Sel T :
respon adaptif
• Paparan 2nd Ag  menimbulkan respon yg lebih efektif
dan cepat dibanding respon primer

• Pada beberapa infeksi, respon primer terlalu lambat utk

merespon

Vaksin 36
• Jika indvidu belum pernah terpapar Ag dari
patogen X lalu diberikan vaksin (X)  terjadi
ekspansi sel memory dan peningkatan Ab
spesifik thd patogen X  mampu melindungi
dari bahaya Ag serupa (X) pada paparan
berikutnya
• Vaksin : berisi organisme hidup/ organisme yg
telah mati  sama2 bersifat antigenik
• Antigen pd vaksin dapat dibuat secara sintetik
atau kloning gen dr organisme terkait
• Imunitas ths penyakit infeksi dapat dicapai dg
imunisasi/ imunoterapi
37
 Imunoterapi
Treatment of the disease by Inducing, Enhancing or
Suppressing the Immune System.

Active Immunotherapy: - Passive Immunotherapy: -

It does not rely on the body to
It stimulates the body’s
attack the disease, instead they
own immune system to use the immune system
fight the disease. components ( such as
antibodies) created outside the
body.
 Pasif
(maternal)
Natural
Imunitas
Adaptif Aktif
(infeksi)
imunitas

Artificial / Pasif
buatan (antibodi
Imunitas transfer)
innate
Aktif
(imunisasi)

39
 Pustaka

• Baratawijaya, 29, Imunologi dasar, edisi 9, UI

Press.
• Bush, RK., Diagnostic Test and Allergy-
Chapter 1
• Handojo, I., 2003, Pengantar Imunoasai Dasar,
Airlangga University Press, Surabaya
• Zabriskie, JB., 2009, Essential Clinical :
Immunological Techniques, Cambridge
University Press

40
Thank You 41