3.

METODOLOGI

3.1.Alat

3.1.1. Persiapan Media dan Sterilisasi :

- Analytical Balance

- Hot Plate dengan Stirer

- pH Meter

- Glass wares (cawan petri, tabung reaksi, elenmeyer, gelas ukur, dll)

- Tabung durham

- Autoclave

- Oven

3.1.2. Isolasi Awal Bakteri :

- Laminary Air Flow

- Jarum Ose

- Bunsen

- Cooling Incubator

- Dissecting set

3.1.3. Pemurnian Bakteri :

- Laminary Air Flow

- Jarum Ose

- Bunsen

- Cooling Incubator

3.1.4. Uji Lanjutan :

- Laminary Air Flow Cabinet

- Jarum Ose
- Bunsen

- Cooling Incubator

3.1.5. Koleksi Biakan :

- Refrigator

- Freeze Drying System

- Glass Ware (tabung reaksi, ampule)

- Freezer

3.1.6. Peralatan Pendukung :

- Rak/ lemari bahan kimia dan media

- Peralatan keselamatan kerja (Jas lab, masker dan sarung tangan)

3.2. Bahan

Bahan yang digunakan

3.2.1. Pembuatan Media :

- TSA

- TSB

- BHIA

- BHIB

- SIM

- O/F

- Glukosa

- Bacto Pepton

- NaCl

-Phenol Red
- MIO

- K2HPO4

- Babco Agar

- Arginin HCl

- Mc Conkey

- TSIA

- TCBS

- LIA

- Beef Ekstrac

- Gelatin

- Simmon’s Citrate

- MRVP media

- Urea agar

- Urea solution 40 %

- Urea Broth

- DNAse- Testagar

- Nitrat Broth

- L- Phenilalanin

- Na2HPO4

- Aquades

3.2.2. Isolasi Awal Bakteri :

- Media Tumbuh TSA

3.2.3. Pemurnian Bakteri :

- Media Tumbuh TSA

3.2.4. Uji Utama

- Glukosa

- Media O/F

- Media SIM

- Media MIO

- Pewarnaan Gram

- KOH 3 %

-H2O2 3 %

3.2.5. Bahan Pendukung :

- Alkohol 70 %

- Tissue

3.3. Metode Pembuatan Media

3.3.1. Tryptic Soy Agar (TSA)

- Timbang TSA sebanyak 40 gram.

- Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades yang dalam erlenmeyer yang telah

diberi stirer magnetic dan ditutp dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate hingga mendidih.

- Setelah itu steril dengan autoclave dengan suhu 1210 C.

- Setelah di sterilkan, masukkan ke dalam laminari flow, dan bagi ke dalam

cawan petri yang sudah steril.

- Masukkan ke dalam refrigator.

3.3.2. Sulfit Indole Motility (SIM)

Gambar 3. Media pengujian SIM

- Timbang SIM sebanyak 30 gram.

- Larutkan ke dalam aquades sebanyak 1000 ml di dalam erlenmeyer yang

sudah diberi stirer dan ditutup aluminium foil.

- Kemudian panaskan ke dalam hot plate.

- Setelah itu sterilisasi menggunakan autoclave suhu 121 0 C.

- Distribusikan ke dalam tabung reaksi steril dalam laminari flow.

- Masukkan ke dalam refrigator.

3.3.3. O/F

Gambar 4. Media uji O/F

 - Timbang O/F sebanyak 9,4 gram

- Masukkan ke dalam 1000 ml aquades dalam erlenmeyer yang diberi stirer

magnetic dan ditutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate hingga mendidih.

- Sterilkan dengan autoclave 1210C.

- Tambahkan 1 % glukosa dan aduk sampai homogen di atas hot plate tanpa

pemanasan.

- Masukkan ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.4. Motility Indole Ornitin (MIO)

- Timbang MIO sebanyak 31 gram.

- Tambahkan ke dalam 1000 ml akuades dalam erlenmeyer yang diberi

stirer magnetic dan ditutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate hingga mendidih.

- Sterilkan dengan autoclave suhu 1210 C.

- Tuang ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.5. Arginin

Gambar 5. Media Arginin

- Timbang pepton sebanyak 1 gram, Nacl 5 gram, K2HPO4 0,3 gram, media

agar 3 gram, phenol red 0,01 gram, arginin Hcl 10 gram.

- Masukkan semua bahan kecuali phenol red ke dalam aquades sebanyak

1000 ml dalam erlenmeyer yang ditutup dengan aluminuim foil.

- Panaskan di atas hot plate sampai mendidih.

- Jika sudah mendidih angkat dan masukkan dalam autoclave dengan suhu

1210 C.

- Setelah selesai di autoclave, tunggu sampai suhu media turun dan

masukkan phenol red dan larutkan di atas hot plate tanpa panas.

- Masukkan ke dalam tabung reaksi steril dan masukkan tabung durham

(posisi terbalik).

- Simpan dalam refrigator.

3.3.6. Mac Conkey

Gambar 6. Media Mac Conkey

- Timbang Mac Conkey sebanyak 51,5 gram.

- Masukkan ke dalam aquades 1000 ml di dalam erlenmeyer yang sudah

diberi stirer dan ditutup dengan aluminium foil.

- Panaskan hingga mendidih di atas hot plate.

- Sterilkan di autoclave dengan suhu 1210 C.

- Tuang ke dalam cawan petri steril di dalam laminari flow.

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.7. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Gambar 7. Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

 - Timbang TSIA sebanyak 65 gram.

- Tambahkan ke dalam 1000 ml aquades ke dalam erlenmeyer yang sudah

diberi stirer dan ditutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate hingga mendidih.

- Sterilkan dengan autoclave suhu 1210 C.

- Masukkan ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow dan atur

dalam keadaan miring (slant position).

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.8. Lysin Iron Agar (LIA)

Gambar 8. Media Lysin Iron Agar (LIA)

- Timbang LIA sebanyak 34,5 gram

- Tambahkan ke dalam 1000 ml aquades dalam erlenmeyer yang di beri

stirer dan di tutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate hingga mendidih.

- Steril dengan autoclave dengan suhu 1210 C.

- Bagi ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow dan atur dengan

posisi miring.

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.9. Gelatin

Gambar 9. Media Gelatin

- Timbang beef extract 3 gram, pepton 5 gram, gelatin 120 gram.

- Larutkan semua bahan ke dalam aquades 1000 ml di dalam erlenmeyer

yang sudah diberi stirer dan ditutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate hingga mendidih

- Sterilkan di dalam autoclave suhu 1210 C

- Distribusikan ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow

- Simpan dalam refrigator.

3.3.10. Glukosa

Gambar 10. Media Glukosa

 - Timbang bactopepton 10 gram, glukosa 1 gram, Nacl 5 gram, phenol red

0,018 gram.

- Larutkan bactopepton, Nacl di dalam 1000 ml aquades yang sudah di

berikan di dalam erlenmeyer dan diberikan stirer dan ditutup dengan

aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate sampai larut.

- Masukkan phenol red dan homogenkan.

- Setelah suhu larutan mencapai 500 C masukkan glukosa dan homogenkan

dengan hot plate tampa panas.

- Distribusikan ke dalam tabung reaksi di dalam laminari flow, dan

masukkan tabung durham dengan posisi terbalik.

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.11. Simmon’s Citrate

Gambar 11. Media Simmon’s Citrate

- Timbang simmon’s citrate sebanyak 22,5 gram

 - Larutkan dalam aquades 1000 ml di dalam erlenmeyer yang di berikan

stirer dan ditutup dengan aluminium foil.

- Homogenkan di atas hot plate.

- Sterilkan di dalam autoclave suhu 1210 C.

- Distribusikan dalam tabung reaksi di dalam laminari flow dan atur dalam

posisi miring.

- Simpan dalam refrigator.

3.3.12. Urea Agar

Gambar 12. Media Urea Agar

- Timbang urea agar base sebanyak 21 gram.

- Larutkan dengan aquades 1000 ml dalam erlenmeyer yang diberi stirer dan

di tutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate sampai larut sempurna.

- Sterilkan dalam autoclave suhu 1210 C

- Dinginkan sampai suhu 500 C, kemudian masukkan 50 ml urea solution

40%.
 - Distribusikan dalam tabung reaksi steril dengan posisi miring pada

laminari flow.

- Masukkan dalam refrigator.

3.3.13. Nitrat

Gambar 13. Media Nitrat

- Timbang nitrat sebanyak 9 gram

- Larutkan dalam 1000 ml aquades dalam erlenmeyer yang sudah diberi

stirer dan ditutup dengan aluminium flow.

- Panaskan di atas hot plate sampai larut.

- Sterilisasi dengan autoclave suhu 1210 C.

- Tuang ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow.

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.14. Phenilalanin

Gambar 14. Media Phenilalanin

- Timbang phenilalanin sebanyak 1 gram, yeast ekstrak 3 gram, Na2HPO4 1

gram, bacto agar 20 gram.

- Larutkan semua bahan ke dalam aquades 1000 ml pada erlenmeyer yang

sudah diberi stirer dan ditutup dengan aluminium foil.

- Panaskan di atas hot plate sampai mendidih.

- Sterilisasi dalam autoclave suhu 1210 C.

- Tuang ke dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow, dan posisikan

miring.

- Simpan di dalam refrigator.

3.3.15. Phenol-Red Broth Base (Uji gula-gula) :

- Larutkan phenol-red broth base ke dalam 1000 ml aquades di dalam

erlenmeyer yang diberi stirer dan ditutup dengan aluminium foil.

- Homogenkan pada hot plate.

- Sterilisasi di autoclave dengan suhu 1210 C.

 - Setelah suhu kira-kira 500 C, tambahkan arabinose, glukosa monohydrate,

glicerol, myo-inositol, lactose, maltose, mannitol, sorbitol, sucrose,

threhalose, xylose, salicin, dan milibiose masing-masing 5-10 gram.

- Distibusikan dalam tabung reaksi steril di dalam laminari flow.

Gambar 15. Media Uji Gula-gula (arabinose, glukosa monohydrate, glicerol, myo-

inositol, lactose, maltose, mannitol, sorbitol, sucrose, threhalose, xylose, salicin,

dan milibiose)

3.4. Isolasi Bakteri

3.4.1. Isolasi bakteri dari ikan

Bakteri di ambil pada ikan lele yang telah memiliki tanda-tanda klinis yaitu :

memiliki luka di bagian tubuh (di perut, punggung, anus, dan sirip

punggung),warna tubuh ikan tampak gelap, perut membesar. Langkah-langkah

nekropsi pada ikan yaitu sebagai berikut :

1. Ikan di bius dengan Quinaldin 12-20 ppm atau MS222 15-20 ppm

2. Ukur berat tubuh ikan, panjang tubuh, dan amati gejala klinis luar

3. Sterilkan ikan dengan cara menyiram tubuh ikan menggunakan alkohol 70

%.

4. Panaskan jarum ose di atas bunsen

 5. Tusukkan pada organ target, kemudian di goreskan pada media tumbuh

(TSA)

6. Lakukan nekropsi, lihat tanda klinis organ tubuh bagian dalam pada ikan.

7. Setelah melakukan pengamatan, ambil sampel dari organ target dengan

cara tusukkan jarum ose yang sudah dipanaskan terlebih dahulu pada

organ target (ginjal dan insang).

8. Gores pada media tumbuh TSA

9. Inkubasi pada suhu 22 - 280C selama 18 – 24 jam

10. Setelah inkubasi lakukan pemurnian bakteri pada media

11. Lakukan pengujian lanjutan

3.4.2. Isolasi bakteri dari TSA miring

1. Sterilkan tabung reaksi tempat media TSA miring dengan alkohol.

2. Ambil bakteri dengan dengan menggunakan jarum ose yang telah

dipanaskan dengan bunsen.

3. Gores bakteri pada media agar TSA di cawan petri.

4. Inkubasikan dalam inkubator pada suhu 24 – 280 C, selama 24 ja.

3.5. Metode Identifikas Bakteri

3.5.1. Metode Biokimia Utama

1. Uji Gram dan Bentuk

Pewarnaan gram adalah salah satu prosedur yang paling banyak digunakan

untuk mencirikan banyak bakteri. Pewarnaan gram juga merupakan pewarnaan

diferensial untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok yaitu bakteri gram

positif dan bakteri gram negatif. Pengujian bentuk dilakukan untuk melihat bentuk
bakteri, dan pengamatan bentuk dilakukan setelah pewarnaan gram dan dilakukan

di mikroskop. Adapun langkah-langkah pengujian gram dan bentuk adalah

sebagai berikut :

- Teteskan aquades steril pada kaca objek (slide glass)

- Ambil koloni bakteri dari media tumbuh, dan suspensikan ke dalam

aquades steril pada kaca objek

- Anginkan sampai benar-benar kering

- Teteskan larutan gram A secukupnya dan diamkan selama 1 menit

- Cuci dengan air mengalir lalu keringkan

- Teteskan larutan gram B, diamkan selama 1 menit

- Bilas dengan larutan gram C dan diamkan selama 1 menit

- Cuci dengan air mengalir lalu keringkan

- Teteskan larutan gram D dan diamkan selama 2-3 menit, cuci dengan air

mengalir lalu keringkan

- Tetaskan minyak imersi diatas objek kaca dan lihat bentuk bakteru dibawah

mikroskop sampai pembesaran 1000 kali.

 Pembacaan : jika warna ungu (+), jika warna merah (-).

2. Uji Motiliti dan H2S

Uji motilitas dilakukan untuk mengetahui pergerakan bakteri dengan

menggunakan media SIM dan MIO. H2S dapat terlihat pada media ini apabila

terdapat warna hitam pada media. Langkah-langkah pengujian motiliti dan H2S

adalah sebagai berikut :

- Ambil bakteri yang akan diperiksa dengan jarum ose

- Tusukkan ke media setengah padat (SIM, MIO)

 - Inkubasi selama 18-24 jam

- Lihat dan amati pertumbuhan bakteri dalam media

 Pembacaan : jika bakteri tumbuh menyebar dari garis tusukan (+), jika

bakteri hanya tumbuh pada garis tusukan (-). Apabila terdapat warna

hitam di media berarti positif H2S.

3. Uji Katalase

Uji ini dilakukan dengan menggunakan larutan H2O2 3%, yang tujuannya

adalah mengetahui ada tidaknya enzim katalase pada bakteri. Langkah-langkah

pengujian katalase yaitu :

- Siapkan slide glass dan teteskan larutan H2O2 pada slide glass tersebut

- Ambil biakan bakteri dengan tusuk gigi steril dan suspensikan pada slide

glass yang sudah diteteskan larutan H2O2

 Pembacaan : jika terjadi gelembung (+), jika tidak terjadi gelembung

(-).

4. Uji Oksidase

Bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada bakteri. Uji

oksidase menggunakan cytochrome oxidase stick. Langkah-langkah uji oksidase

adalah sebagai berikut :

- Siapkan cytochrom oxidase stick

- Ambil bakteri dengan tusuk gigi steril dan oleskan pada stick oksidase

- Amati perubahan warna pada stick

 Pembacaan : jika berubah menjadi warna biru (+), jika tidak terjadi

perubahan (-).

5. Uji O/F
 Test O/F bertujuan untuk mengetahui sifat oksidase dan fermentasi suatu

bakteri terhadap karbohidrat. Bakteri akan memecah karbohidrat yang ada pada

media dan membentuk asam dan juga gas. Langkah-langkah pengujian O/F adalah

sebagai berikut :

- Ambil biakan bakteri murni dengan jarum ose steril

- Tusukkan secara tegak lurus ke dalam dua medium O/F dalam tabung

reaksi

- Satu tabung raksi diberi parafin cair steril setinggi 1 cm

- Inkubasi dalam inkubator pada suhu 24-300 selama 24 jam

- Amati perubahan warna pada media di dalam tabung reaksi

 Pembacaan : bersifat fermentatif jika kedua media berubah warna

menjadi warna kuning, sedangkan bersifat oksidatif jika media yang

tidak di berikan parafin berubah warna menjadi warna kuning

sementara yang di berikan parafin tidak terjadi perubahan warna.

6. Uji Glukosa

Uji glukosa bertujuan untuk melihat apakah bakteri dapat memanfaatkan

glukosa untuk diubah menjadi energi. Pada dasarnya bakteri akan memecah

karbohidrat yang ada pada media dan membentuk asam dan juga gas. Pegujian

dilakukan dengan menggunakan media glukosa yang terdapat tabung durham di

dalamnya, tabung durham berfungsi sebagai indikator gas pada bakteri yang

sedang di uji. Cara pengujian glukosa yaitu :

- Siapkan media glukosa

- Ambil biakan bakteri murni dan inokulasikan pada media glukosa

- Inkubasi selama 18 – 24 jam

  Pembacaan : jika media berwarna kuning dan tampak gelembung gas

pada tabung durham (+ asam dan gas), jika warna tidak berubah dan

tidak ada gas (- asam dan gas).

7. Uji Ornithin

- Sediakan media yaitu media MIO

- Ambil biakan bakteri murni dengan jarum ose steril

- Masukkan atau inokulasikan bakteri tersebut ke dalam media secara tegak

lurus

- Inkubasi selama 18 – 24 jam

 Pembacaan : jika media tidak berubah warna (+), jika media berubah

warna menjadi warna kuning (-).

3.5.2 Metode Biokimia Lanjutan

1. Uji Sukrosa

- Ambil bakteri dengan jarum ose

- Masukkan bakteri ke dalam media sukrosa yang diberikan tabung durham

didalamnya

- Inkubasi selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna pada media.

 Pembacaan : jika asam warna media akan berubah menjadi kuning dan

itu artinya (+), jika terjadi reaksi alkali atau basa warna media tidak

akan mengalami perubahan dan tetap berwarna merah muda itu

artinya (-), jika terdapat gelembung gas dalam tabung durham berarti

diberi notasi G.
2. Uji Laktosa

- Siapkan media laktosa dalam tabung reaksi yang berisi tabung dirham

- Ambil biakan bakteri murni danmasukkan kedalam media tersebut

- Inkubasi selama 24 jam dalam inkubator

- Amati perubahan warna pada media

 Pembacaan : jika asam media akan berubah warna menjadi kuning dan

ditulis dengan notasi (+), jika terjadi reaksi alkali warna tetap tidak

berubah dan ditulis dengan notasi (-), dan apabila terdapat gelembung

gas pada tabung durham maka ditulis dengan notasi (G).

3. Uji Maltosa

- Siapkan media maltosa

- Ambil bakteri dari isolat murni menggunakan jarum ose dan masukkan ke

dalam media

- Inkubasikan pada suhu 220 C selama 24 jam

- Amati perubahan warna pada media

 Pembacaan : jika asam media akan berubah warna menjadi kuning dan

ditulis dengan notasi (+), jika terjadi reaksi alkali warna tetap tidak

berubah dan ditulis dengan notasi (-), dan apabila terdapat gelembung

gas pada tabung durham maka ditulis dengan notasi (G).

4. Uji Mannitol

- Ambil isolat murni bakteri menggunakan jarum ose

- Inokulasikan isolat murni bakteri ke dalam media mannitol

- Inkubasi pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna pada media

  Pembacaan : jika asam warna media akan berubah menjadi kuning dan

itu artinya (+), jika terjadi reaksi alkali atau basa warna media tidak

akan mengalami perubahan dan tetap berwarna merah muda itu artinya

(-), jika terdapat gelembung gas dalam tabung durham berarti diberi

notasi G.

5. Uji Inositol

- Siapkan media uji inositol dalam tabung reaksi

- Ambil bakteri yang telah dimurnikan terlebih dahulu dengan jarum ose

- Inkubasi dalam inkubator pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika asam warna media akan berubah menjadi kuning dan

itu artinya (+), jika terjadi reaksi alkali atau basa warna media tidak

akan mengalami perubahan dan tetap berwarna merah muda itu artinya

(-), jika terdapat gelembung gas dalam tabung durham berarti diberi

notasi G.

6. Uji Arabinose

- Ambil isolat bakteri murni dengan jarum ose

- Inokulasikan bakteri tersebut ke dalam media arabinose

- Inkubasi pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna pada media

 Pembacaan : jika asam warna media akan berubah menjadi kuning dan

itu artinya (+), jika terjadi reaksi alkali atau basa warna media tidak

akan mengalami perubahan dan tetap berwarna merah muda itu artinya
 (-), jika terdapat gelembung gas dalam tabung durham berarti diberi

notasi G.

7. Uji Arginin

- Ambil bakteri dari media pemurnian menggunakan jarum ose yang telah

dipanaskan terlebih dahulu

- Inokulasikan bakteri tersebut ke dalam media arginin

- Masukkan ke dalam inkubator pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika warna media berubah menjadi merah muda (+), jika

media tidak berubah warna (-).

8. Uji Hidrolisis Gelatin

Uji gelatin bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bakteri memiliki

enzim gelatinase yang mampu mengidrolisis gelatin atau tidak. Jika pada uji ini

hasil positif maka ditandai dengan adanya pencairan gelatin, tetapi jika hasil

positif maka gelatin tetap padat.

- Ambil bakteri dengan jarum ose yang telah di sterilkan

- Inokulasikan ke dalam media nutrien gelatin dalam tabung reaksi dengan

cara ditusuk secara tegak lurus

- Masukkan ke dalam inkubator pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Setelah inkubasi, masukkan bakteri ke dalam refrigator pada suhu 4 0 C

selama 30 menit

- Amati perubahan yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika media mencair (+), jika media membeku (-)

9. Uji Salicin
 - Ambil bakteri dari media pemurnian menggunakan jarum ose

- Inokulasikan bakteri ke dalam media threhalose

- Inkubasikan pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahana warna pada media

 Pembacaan : jika media berubah menjadi kuning (+), jika media tidak

berubah warna (+).

10. Uji Sitrat

Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui apakah kuman menggunakan

sitrat sebagai sumber karbon. Pada media Simons citrat berisi indikator BTB

(Brom Tymol Blue). Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon

maka media berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru. Langkah-

langkah pengujian sitrat yaitu :

- Ambil isolat murni bakteri menggunakan jarum ose yang sudah di panaskan

dengan bunsen

- Inokulasikan pada media simmone’s sitrat agar yang berbentuk agar miring

dengan cara membuat goresan pada bidang miring

- Inkubasikan pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika media tumbuh berubah menjadi warna biru (+), jika

tidak terjadi perubahan warna (-).

11. Uji Indol

Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim

triptophanase sehingga bakteri tersebut mampu mengoksidasi asam amino

triptophan membentuk indol. Adanya indol dapat diketahui dengan penambahan

reagen Ehrlich/Kovac’s yang berisi paradimetil amino bensaldehid. Langkah-

langkah pengujian indol adalah sebagai berikut :

- Ambil isolat bakteri murni menggunakan jarum ose

- Inokulasikan pada media SIM

- Inkubasi dalam inkubator pada suhu 220 C selama 18- 24 jam

- Setelah 24 jam tambahkan 0,5 ml reagen kovack’s indole ke dalam tabung

reaksi

- Amati ada tidaknya cincin merah pada media

 Pembacaan : jika permukaan media terbentuk cincin merah (+), jika

permukaan media terbentuk cincin kuning (-).

12. Uji Voges Proskauer

Uji VP bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri memfermentasi

glukosa yang menghasilkan asetil karbinol.

- Ambil bakteri dari media biakan murni dengan jarum ose

- Inokulasikan ke dalam media voges proskauer

- Inkubasi pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Setelah 18 – 24 jam tambahkan indikator α-naphtol 0,6 ml dan KOH 40 %

0,4 ml, kemudian kocok selama 30 detik

- Lakukan pengamatan yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika permukaan berwarna kemerahan (+), jika permukaan

berwarna kuning (-)

13. Uji Lysin

Uji LIA pada bakteri bertujuan untuk melihat kemampuan

mikroorganisme dalam mendekarboksilase lisin membentuk amin kadaverin yang

bersifat basa. Reaksi ini dapat disertai atau tidak disertai dengan pembentukan gas

(adanya gelembung/pecahnya agar di daerah tusukan atau adanya endapan hitam).

Langkah-langkah uji sebagai berikut :

- Ambil bakteri dari media biakan murni menggunakan jarum ose

- Inokulasikan bakteri ke dalam media LIA dengan cara di gores dan di tusuk

- Inkubasi dalam inkubator pada suhu 18 - 220 C selama 18 – 24 jam

- Lakukan pengamatan yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika media berwarna ungu berarti bakteri bersifat alkali

(K), jika berwarna kuning berarti asam (A).

14. Uji Urease

Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai

enzim urease yang dapat menguraikan urea membentuk amoniak.

- Ambil bakteri dengan jarum ose

- Inokulasikan ke dalam media urease cair

- Masukkan ke dalam inkubator pada suhu 220 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna yang terjadi pada media

 Pembacaan : jika media berwarna merah (+), jika media tidak

mengalami perubahan warna (-).

15. Uji Sorbitol

- Ambil bakteri menggunakan jarum ose

- Inokulasikan bakteri ke dalam media

- Inkubasi dalam inkubator pada suhu 22 - 300 C selama 18 – 24 jam

- Amati perubahan warna pada media

  Pembacaan : jika media berubah menjadi kuning (+), jika media tidak

berubahn warna (-).

16. Uji phenilalanin

Tujuan pengujian phenilalanin yaitu untuk melihat kemampuan bakteri

menghasilkan enzim deaminase. Lamgkah-langkah pengujiannya adalah sebagai

berikut :

- Ambil bakteri dari media biakan murni menggunakan jarum ose

- Inokulasikan ke dalam media agara miring dengan cara di gores

- Inkubasi pada suhu 22 - 300C selama 18 – 24 jam

- Setelah 24 jam, teteskan reagen phenilalanin sebanyak 3 – 4 tetes

- Amati perubahan warna

 Pembacaan : jika permukaan media berubahn menjadi hijau (+), jika

tidak terjadi perubahan warna (-).

17. Uji Threhalose

- Ambil bakteri menggunakan jarum ose steril

- Masukkan ke dalam media

- Inkubasi pada inkubator selama 18 – 24 jam pada suhu 22 - 200 C

- Amati perubahan warna pada media

 Pembacaan : jika bersifat asam, maka warna media akan berubah

menjadi kuning (+), jika terjadi reaksi alkali atau basa maka warna

media tidak mengalami perubahan warna.

18. Uji Dulcitol

- Ambil bakteri menggunakan jarum ose yang sudah di sterilkan pada api

bunzen
 - Inokulasikan pada media

- Inkubasi pada suhu 22 - 300 C selama 18 – 24 jam

- Lihat perubahan warna yang terjadi pada media.

 Pembacaan : jika bersifat asam, media berubah menjadi warna kuning

(+), jika bersifat alkali maka tidak akan terjadi perubahan warna (-).

19. Uji Mc Conkey

Media Mc Conkey adalah media selektif yang digunakan untuk

menumbuhkan bakteri gram negatif, dan menghambat pertumbuhan gram posotif.

Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu, dan neutral

red sebagai indicator warna. Media ini akan menghambat pertumbuhan bakteri

gram positif dengan adanya garam empedu yang akan membentuk kristal violet.

Metode pengujian pada media Mc Conkey adalah sebagai berikut :

- Ambil bakteri dari media biakan murni dengan jarus ose steril

- Goreskan pada media agar Mc Conkey

- Inkubasikan pada suhu 22 - 300C selama 18 – 24 jam

- Lihat pertumbuhan dan warna bakteri yang tumbuh pada media

 Pembacaan : jika bakteri tumbuh menyebar dan berwarna merah

keunguan (+), jika bakteri tidak berwarna merah keunguan (-).

20. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Tujuan dari tes ini adalah untuk mengetahui kemampuan kuman untuk

memfermentasikan karbohidrat. Pada media TSIA berisi 3 macam karbohidrat

yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa. Indikatornya adalah phenol red yang

menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana

asam. Glukosa berada di dasar media sedangkan laktosa dan sukrosa berada di
bagian tengah dan permukaan media. Langkah-langkah pengujian

TSIA adalah sebagai berikut :

- Ambil bakteri dengan menggunakan jarum ose steril

- Goreskan dan tusukkan pada media agar miring TSIA

- Inkubasi pada inkubator pada suhu 22 - 300 C selama 18 – 24 jam

 Pembacaan : jika bakteri bersifat asam maka akan berwarna

kuning dan diberi notasi (A/A), jika media berwarna merah

berarti bersifat alkali atau basa dan diberi notasi (K/K), jika

media berwarna kuning dan merah berarti bakteri dapat

bersifat asam dan juga alkali dan di berikan notasi (K/A

atau A/K), jika terdapat buih maka di beri notasi G.

21. Uji Nitrat

Bertujuan untuk determinasi kemampuan organisme untuk

mereduksi nitrat (NO3) menjadi nitrit (NO2) menggunkan enzim nitrat

reduktase. Langkah- langkah pengujian nitrat yaitu :

- Ambil bakteri dari media biakan murni dengan jarum ose steril

- Inokulasikan pada media nitrat cair

- Inkubasi di dalam inkubator selama 18 – 24 jama pada suhu 22 - 300 C

- Setelah 24 jam tambahkan reagen nitrat A dan Reagen nitrat B

- Lihat perubahan warna yang terjadi

 Pembacaan : jika berubah menjadi warna merah (+), jika

tidak berubah warna (-).