NAMA : NOEL ASRI RAHAYU

A1182142

4 REGULER B

Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol 70% Daun Kencur

(Kaempheria galanga)Terhadap Bakteri Salmonella typhi Dengan Metode Difusi

Sumuran

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Lokasi penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi

Jurusan Farmasi Sekolah Tinngi Farmasi Nusaputera Semarang

dalam jangka waktu dari tanggal 1 Februari 2020 sampai 28

Februari 2020.

B. Rancangan Penelitian

1. Antibakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Daun

Kencur dengan ciri – ciri berwarna hijau . Bagian yang digunakan

adalah seluruh bagian daun kencur dari ujung sampai bawah.

2. Metode ekstraksi yang digunakan adalah Maserasi

Metode maserasi adalah metode ekstraksi dingin cocok untuk

senyawa aktif yang tidak tahan terhadap pemanasan dan

sederhana dalam pengerjaan serta tidak memerlukan peralatan

yang khusus.

3. Metode yang digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri

adalah metode difusi Sumuran.

 4. Metode sumuran yaitu membuat lubang pada agar padat yang

telah diinokulasi dengan bakteri salmonella typhi dilakukan

pengamatan dengan melihat ada atau tidaknya zona hambatnya

atau penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM).

C. Populasi Dan Sampel

 Sampel

Sampel bahan antibakteri yang digunakan adalah daun kencur

(kaempheria galanga ) yang didapatkan dari Pasar Umum

Wirosari Kabupaten Grobogan.

 Populasi

Populasi dari penelitian ini adalah daun kencur (kaempheria

galanga ).

 Teknik Sampling

1. Tahap persiapan

Tahap persiapan terdiri dari inventarisasi alat dan bahan yang

dibutuhkan dalam penelitian, sterilisasi alat dan media, dan rekultur

bakteri uji.

a. Inventarisasi alat dan bahan

Alat dan bahan yang digunakan didata kemudian diambil dan

ditempatkan pada lemari penyimpanan kemudian diberi label

nama peneliti.

b. Sterilisasi alat
 Beberapa alat seperti erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri,

stemper, mortar, kertas saring, dan yang digunakan dalam

penelitian terlebih dahulu disterilkan agar tidak terjadi kontaminasi.

Sterilisasi alat dilakukan menggunakan autoklaf. Sterilisasi

dilakukan pada tekanan 1 atm dan suhu 121°C selama 15 menit.

c. Pembuatan dan sterilisasi media

Media yang digunakan yaitu media Nutrient Agar (NA). NA

sebanyak 10 gram dilarutkan ke dalam 500 ml akuades, kemudian

dipanaskan di atas hot plate. Pengadukan dilakukan dengan

memasukkan magnetic stirrer ke dalam larutan. Larutan

dipanaskan hingga berwarna kuning jernih kemudian dituang ke

dalam erlenmeyer yang telah disterilkan. Selanjutnya, media

tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C tekanan 1

atm selama 10 menit. Media yang telah steril dituang ke dalam

cawan petri dan tabung reaksi sesuai kebutuhan penelitian.

Setelah memadat, media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24

jam.

2. Tahap pelaksanaan

a. Penyiapan Bakteri Uji

Bakteri uji Salmonella typhi yang digunakan dalam penelitian ini

berasal dari Laboratorium Sekolah Tinggi Farmasi Nusaputera

Semarang. Bakteri uji tersebut diidentifikasi terlebih dahulu yang

meliputi uji pewarnaan gram, uji kultur pada agar Salmonella-

Shigella dan uji biokimia pada medium Triple Sugar Iron Agar
(TSIA) dan uji fermentasi karbohidrat maltosa dan sukrosa untuk

memastikan bahwa bakteri uji tersebut merupakan bakteri

Salmonella typhi.

Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan cara

mengkultur biakan bakteri Salmonella typhi pada agar nutrien

miring, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam.

Koloni yang tumbuh dipilih 4-5 koloni dengan menggunakan ose

steril, kemudian diinokulasikan pada 5 ml medium cair Mueller

Hinton, dan diinkubasikan pada suhu 37ºC selama 2-6 jam sampai

tampak pertumbuhan bakteri. Suspensi bakteri yang telah tumbuh

dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan suspensi

McFarland 0,5. Kekeruhan suspensi yang setara dengan standar

McFarland Kemudian diencerkan dengan NaCl 0,9% sebanyak

100 kali sehingga diperoleh konsentrasi kuman 1,5 x 106

CFU/ml16.

b. Pengambilan sampel adalah daun kencur (kaempheria

galanga )

Daun kencur (kaempheria galanga ) didapatkan di pasar

umum wirosari kabupaten grobogan dengan ciri ciri bentuk

besar eliptis atau bulat memanjang terdapat garis pada setiap

helainya berwarna hijau.

c. Pembuatan ekstrak daun kencur

ekstrak daun kencur yang didapatkan dengan proses maserasi

menggunakan pelarut etanol, dimana etanol bertujuan untuk

menarik keluar zat aktif yang terkandung dalam daun kencur.

 Setelah proses maserasi ekstrak kemudian dimasukkan ke

dalam evaporator untuk menghilangkan etanol dari ekstrak

tersebut dimana akan menjadi ekstrak etanol kental yang

hanya mengandung zat kimia yang terkandung di dalam daun

kencur.

d. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak daun kencur (kaempheria

galanga )

Setelah mendapatkan ekstrak daun kencur dengan

konsentrasi 100%, ekstrak tersebut diencerkan untuk

mendapatkan konsentrasi sebesar 25%, 50% dan 75% dengan

menambahkan akuades steril. Variasi konsentrasi ekstrak pada

tiap perlakuan dapat dilihat pada tabel

NILAI EKSTAK DAUN PELARUT

KONSENTRASI KENCUR(ml) AQUADEST

25 2,5 ml 7,5 ml

50 5 ml 5 ml

75 7,5 ml 2,5 ml

100 10 ml -

e. Tahap Perlakuan
 a. Uji Aktivitas Antibakteri

Di Siapkan cawan petri dengan cara masing-masing bagian

bawah cawan petri diberi tanda bertuliskan P100 (ekstrak

konsentrasi 100%),P75 (ekstrak konsentrasi 75%), P50 (ekstrak

konsentrasi 50%), P25 (ekstrak konsentrasi 25%), K(+) (kontrol

positif), dan K(-) (kontrol negatif). Pada setiap cawan petri

dituangkan media hangat sebanyak 25 ml Kemudian suspensi

bakteri sebanyak 0,5 ml diinokulasikan pada media tersebut dan

diaduk sampai merata dengan gigaskrin. Setelah itu media

dibiarkan memadat (media lempeng). Kemudian pada masing-

masing lubang sumuran dimasukkan 5 μL berbagai konsentrasi

ekstrak, kontrol positif, dan negatif. Selanjutnya media yang

sudah diberi perlakuan dimasukkan desicator dan diletakkan

dalam inkubator dengan suhu 37° C selama 24 jam.

b. Uji Kadar Hambat Minimal (KHM) atau Zona Hambat

Media NA dengan suhu 45⁰C dituangkan ke dalam cawan

petri yang sudah berisi bakteri uji dan dan sampel ekstrak Daun

Kencur. Jumlah media kultur yang digunakan sebanyak 10 ml.

Bakteri uji pada pengenceran 10⁻⁵ digunakan sebanyak 0,5 ml.

Sampel ekstrak daun kencur sebanyak 0,5 ml. Hasil pour plate

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37⁰C. Media yang terlihat

jernih atau tidak ditumbuhi bakteri ditetapkan sebagai KHM.

D. Identifikasi Variabel Penelitian

1. Variabel Bebas : Konsentrasi ekstrak daun kencur (kaempheria

galanga ) dengan variasi konsentrasi , 25%, 50%, 75%, dan 100%.

2. Variabel Terikat : Konsentrasi Hambat Minimun (KHM)

3. Variabel Kontrol : Suhu inkubasi, waktu inkubasi, tingkat

pengenceran, media inkubasi, usia kultur bakteri, dan volume kultur

bakteri.