Kromatografi Eksklusi

Defenisi

Kromatografi eksklusi dikenal juga sebagai Size Exclusion chromatography (SEC) atau gel permeation
chromatography (GPC), atau gel filtration chromatography, adalah metode kromatografi yang digunakan
untuk memisahkan molekul berdasarakan ukurannya.

Prinsip Dasar Kromatografi EKsklusi

Pemisahan dengan kromatografi ini didasarkan pada perbedaan ukuran biomolekul yang melewati
kolom yang didalamnya terdapat medium kromatografi berupa gel. Molekul yang lebih besar daripara
pori-pori didalam gel tidak dapat berdifusi ke dalam gel dan terbatas untuk terelusi bersama. Molekul
yang lebih kecil dari ukuran pori dapat memasuki partikel dan mempunyai jalur dan waktu transit yang
lebih panjang. Molekul yang memasuki pori akan mempunyai waktu tinggal dalam partikel tergantung
ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda mempunyai waktu transit yang berbeda untuk
melewati kolom.

Corong diletakkan dibagian atas kolom, dan didalam kolom terdapat gel yang permukaannya berpori.
Jadi, sampel akan mengalir bersama dengan gel. Dalam metode ini, kolom diisi dengan gel yang
berperan sebagai fase diam. Gel ini terbuat dari manik-manik yang berpori. Gel menggunakan
polystyrene, dextrans, polyacrylamide gels, agarose gel (semua yang mempunyai struktur berpori).

Pemilihan Kolom

Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul linarut yang akan dipisahkan. Setiap
kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu kurva kalibrasi tertentu. Pada setiap
rangkaian kolom dapat dihasilkan kurva kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi ini didapat
dengan menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot molekulnya, kemudian
menentukan VR masing-masing.

Pemilihan Fase Gerak

Fase gerak harus merupakan pelarut polimer yang baik untuk menghindari noneksklusi. Bila sample
hanha terlarut sebagian pada fase gerak, maka dapat terjadi peningkatan tekanan pada kolom karena
ukuran partikel terlalu besar. Efek tersebut dapat diatasi dengan cara memilih pelarut lain, atau dengan
meningkatkan temperature kolom.

Detektor

Dibagian bawah kolom terdapat detektor. Detektor bisa berupa Refractive index detector, UV detector,
atau IR detector.
Kromatografi Pertukaran Ion
Kromatografi pertukaran ion adalah metode kromatografi pemisahan berdasarkan pertukaran ion atau
suatu proses penggantian satu jenis senyawa ion dengan yang lain yang terjadi pad permukaan fase
diam.

Pada kromatografi ini ada yang disebut penukar kation (membebaskan dan menukar ion +), penukat
anion (membebaskan dan menukar ion -) dan penukar ion amfoter (dalam satu molekul mengandung
gugus fungsi kation dan anion).

Kromatografi penukar ion digunakan jika komponen yang dianalisis berupa ion dan dapat larut dalam
air.

Ion solute yang terdapat dalam fase gerak harus dapat menggantikan satu atau lebih ion yang
berlawanan yang terikat pada fase diam.

Y+X X+Y

Fase diam yang digunakan biasanya berupa resin yang sudah dirancang khusus untuk membawa gugus
penukar ion-ion. Resin dibuat dengan polimerasi beberapa monomer seperti stirenadan divinil benzene.

Berdasarkan keberadaan gugusan labilnya resin diklasifikasikan sebagai berikut :

- Resin penukar kation asam kuat (mengandung gugus HSO 3)

- Resin penukar kation asam lemah (mengandung gugus -COOH)
- Resin penukar anion basa kuat (mengandung gugus amin tersier atau kuartener)
- Resin penukar anion basa lemah (mengandung OH sebagai gugusan labil)

Komponen dalam kromatografi ini yaitu eluent (fase gerak yang akan membawa sampel ke kolom
pemisah), pompa (mendorong eluent dan sampel masuk ke dalam kolom), injector (tempet
memasukkan sampel dan sampel didistribusikan ke dalam kolom), kolom pemisah ion (memisahkan ion-
ion pada sampel), detektor (membaca ion yang lewat ke dalam detektor), dan terkahir recorder data
(merekam dan mengolah data yang masuk).

Pengaplikasiannya dapat dilihat pada pemisahan ion logam, penentuan kadar lisinoalanin (LAL) dalam
makanan.
Densitometri
Densitometri adalah metode analisis berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit berupa
bercak pada KLT. Metode ini diawali dengan pemisahan senyawa dengan KLT.

Pada metode ini digunakan pelacak bercak berupa sinar ultar ungu, sinar tampak maupun sinar
fluoresensi.

Alatnya berupa alat HPLC (high Performance Thin Layer Chromatography) yang terdiri atas pelacak
bercak, monitor, PC dan keyboard.
Kromatografi Cair Padat
Kromatografi cair padat disebut juga kromatografi penyerapan.

Kromatografi kolom dan KLT termasuk kromatografi jenis ini.

Cara kerja alat yaitu pelarut inlet membawa fase gerak yang kemudian dipompa melalui filter pelarut
inline dan akan melewati katup injeksi. Fasa gerak akan bercampur dengan sampel yang telah
diinjeksikan. Campuran tersebut kemudian akan bergerak melewati filter lainnya dan melewati kolom
sampai komponen-komponen sampel terpisah. Kemuadian detector akan mendeteksi pemisahan yang
terjadi dan computer akan merekam informasi tersebut. Terakhir, sampel akan melewati backpressure
filter dan menjadi waste.

Fase diamnya dapat berupa silika dan alumina yang mempunyai gugus hidroksil permukaan dan
antaraksi jenis asam lewis yang menentukan sifat penyerapan.

Pengaplikasian kromatografi ini seperti pada pemisahan antipengoksida, pemisahan pestisida, analisis
aflatoksin dengan KCP, dan pemisahan 2-nitrodifenilamina dari komponen lainnya.