Full
Full
Skripsi
Oleh:
Petra Annie Anjani
NIM : 128114004
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2016
i
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
HALAMAN PERSEMBAHAN
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur penulis haturkan kepada Tuhan atas segala berkat dan
Dalam Sediaan Larutan Injeksi Pemutih Kulit Merek ‗X‘ Secara Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik‖ yang disusun untuk memenuhi persyaratan
dalam memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S. Farm.)
dalam proses pembuatan skripsi ini dari awal hingga akhir, maka dengan rasa
1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. dan Dra. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt.
selaku Dekan dan Ketua Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku Dosen Pembimbing Utama
skripsi.
4. Jeffry Julianus, M.Si. dan Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen
Penguji atas arahan, kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6. Mas Bimo dan Mas Kethul selaku laboran dan karyawan Laboratorium
Fakultas Farmasi yang telah banyak membantu penulis pada masa penelitian.
7. Papa, mama, dan adek atas segala semangat, doa, kasih, dan pengorbanannya.
atas segala kerjasama dan kebersamaan dalam tawa dan tangis selama
9. Konco Tipis: Ave, Elak, Irest Keket, Resta, Rina, Edo, Indra, dan Ngapak
hampir 4 tahun ini. Ladies: Fina, Santa, Sella, Titta untuk tawa dan tangis,
tahun ini.
10. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu sehingga penulis
namun begitu diharapkan hasil skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL...................................................................................... i
HALAMAN PERSEMBAHAN..................................................................... iv
PRAKATA...................................................................................................... vii
DAFTAR ISI................................................................................................... ix
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... xv
INTISARI....................................................................................................... xvii
ABSTRACT...................................................................................................... xviii
BAB I PENDAHULUAN............................................................................... 1
A. Latar Belakang.................................................................................... 1
1. Perumusan Masalah...................................................................... 4
2. Keaslian Penelitian........................................................................ 5
3. Manfaat Penelitian........................................................................ 6
B. Tujuan Penelitian................................................................................ 7
A. Pigmentasi.......................................................................................... 8
B. Injeksi................................................................................................ 8
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Asam askorbat..................................................................................... 9
D. Spektrofotometri UV.......................................................................... 15
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi...................................................... 19
1. Instrumentasi KCKT..................................................................... 20
a. Reservoir................................................................................. 21
b. Pompa...................................................................................... 21
c. Penyuntikan Sampel................................................................ 22
d. Kolom...................................................................................... 22
e. Detektor................................................................................... 24
2. Fase Gerak.................................................................................... 24
3. Fase Diam..................................................................................... 26
4. Larutan Bufer................................................................................ 28
5. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif................................................ 28
F. Landasan Teori.................................................................................... 30
G. Hipotesis............................................................................................. 31
BAB III METODE PENELITIAN................................................................. 32
A. Jenis dan Rancangan Penelitian.......................................................... 32
B. Variabel Penelitian.............................................................................. 32
C. Definisi Operasional........................................................................... 32
D. Bahan Penelitian................................................................................. 33
E. Alat Penelitian..................................................................................... 33
F. Tata Cara Penelitian............................................................................ 34
1. Pembuatan asam fosfat (H3PO4) 0,1 M......................................... 34
2. Pembuatan bufer fosfat 0,01M...................................................... 34
3. Pembuatan fase gerak................................................................... 34
4. Pembuatan larutan kerja asam askorbat........................................ 35
5. Penetapan panjang gelombang (λ) maksimum asam askorbat...... 35
6. Pembuatan kurva baku asam askorbat......................................... 35
7. Pengujian stabilitas baku pembanding asam askorbat................. 36
8. Penetapan Volume Injeksi dalam Wadah..................................... 36
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
A. Kesimpulan......................................................................................... 55
B. Keterbatasan Penelitian....................................................................... 55
C. Saran................................................................................................... 55
DAFTAR PUSTAKA..................................................................................... 56
LAMPIRAN.................................................................................................... 60
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil uji kestabilan larutan baku asam askorbat replikasi 1.......... 45
Tabel II. Hasil uji kestabilan larutan baku asam askorbat replikasi 2..........
45
Tabel III. Hasil uji kestabilan larutan baku asam askorbat replikasi 3.......... 45
replikasi.......................................................................................... 46
Tabel VI. Data penetapan volume injeksi sampel larutan injeksi asam
askorbat.......................................................................................... 51
Tabel VII. Hasil pengukuran kadar sampel injeksi pemutih kulit merek ―X‖ 53
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
aqueous solution......................................................................... 12
Gambar 5. Contoh transisi π →π* (a) dan transisi n→π* (b) pada keton.... 17
kolom.......................................................................................... 24
Gambar 10. Spektra asam askorbat pada tiga level konsentrasi (40, 50, dan
Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom pada senyawa asam askorbat 43
fosfat pH 3.................................................................................. 49
Gambar 15. Struktur asam askorbat yang memiliki gugus kromofor serta
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 17. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer
fosfat........................................................................................... 51
Gambar 18. Sampel injeksi pemutih kulit merek ―X‖ yang menggunakan
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Replikasi I.................................................................................. 63
Replikasi II................................................................................. 71
Replikasi III................................................................................
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Lampiran 22. Tampilan Sediaan Injeksi Pemutih Kulit Merek ―X‖................. 104
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Penggelapan warna kulit merupakan salah satu gangguan pada kulit yang
disebabkan oleh produksi melanin yang berlebihan. Sediaan larutan injeksi merek
―X‖ merupakan salah satu obat pemutih kulit untuk mengatasi penggelapan warna
kulit yang mengandung asam askorbat sebagai whitening agent. Tujuan penelitian
ini adalah untuk mengetahui kesesuaian kadar asam askorbat yang terukur dengan
kadar yang tertera pada label dengan maksud penjaminan mutu suatu produk obat.
Penelitian bersifat non-eksperimental deskriptif karena tidak dilakukan
intervensi atau perlakuan terhadap subjek uji. Penetapan kadar asam askorbat
dalam sediaan larutan injeksi merek ―X‖ dilakukan secara kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik. Kolom yang digunakan adalah Phenomenex®
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak yang digunakan adalah metanol : 0,01M
bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit, deteksi pada 244
nm.
Hasil pengujian stabilitas baku pembanding asam askorbat memiliki
persen perubahan ≤ 2% yang berarti asam askorbat stabil dan dapat digunakan
dalam penelitian ini. Kadar asam askorbat yang tertera pada label adalah 1000
mg/5mL dengan rentang keberterimaan 900-1100 mg/5mL (90-110%). Kadar
rata-rata asam askorbat terukur sebesar 412.479 ± 60.765 mg/5mL dengan RSD
14.732%. Dapat dikatakan kadar asam askorbat terukur tidak sesuai dengan kadar
asam askorbat yang tertera pada label.
Kata kunci: Asam askorbat, obat pemutih kulit, penetapan kadar, KCKT fase
terbalik
xvii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
xviii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
gangguan keindahan atau gangguan kosmetik. Salah satu gangguan kosmetik pada
kulit adalah penggelapan warna kulit disebabkan reaksi oksidasi tirosin menjadi
dan Soedirman, 1981). Tujuan utama produk pemutih kulit adalah mencerahkan
Saisunee, 2007). Salah satu cara kerja agen pemutih kulit adalah sebagai inhibitor
melanin, diantaranya adalah asam askorbat, arbutin, cojic acid, merkuri, dan
protektif terhadap kerusakan jaringan kulit yang disebabkan oleh induksi radiasi
2010).
berbagai metode dan dalam berbagai sampel. Determinasi asam askorbat dalam
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pemutih kulit sudah pernah dilakukan oleh Wang, Cheng, Sheu, dan Kwan (2011)
dan krim pemutih kulit. Penelitian lain juga dilakukan untuk menganalisis agen
Banyak faktor yang mempengaruhi stabilitas asam askorbat seperti pH, ion logam,
suhu, cahaya, dan oksigen. Asam askorbat juga sangat tidak stabil dalam bentuk
larutan. Sediaan injeksi asam askorbat yang beredar di pasaran sebagian besar
7,0. Sedangkan larutan dengan pH > pKa asam askorbat yaitu 4,2 akan
stabilitas asam askorbat (Buettner and Jurkiewics, 1996). Injeksi asam askorbat
yang beredar di pasaran banyak yang menggunakan wadah vial berwarna putih
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
bening, sedangkan salah satu faktor ketidakstabilan asam askorbat adalah cahaya.
Kriteria dan Tata Laksana Registrasi Obat tahun 2011, obat yang akan diedarkan
di wilayah Indonesia wajib memiliki izin edar atau nomor registrasi tetapi masih
banyak ditemui produk injeksi asam askorbat yang dijual di pasaran tidak
yang kondisi atau jaminan yang telah dijanjikan dan pelaku usaha memiliki
kondisi barang dan menjamin mutu barang yang diproduksi atau diperdagangkan
akan stabilitas produk injeksi asam askorbat yang berpengaruh pada kualitas
produk selama beredar dipasaran. Salah satu kualitas produk dapat dilihat dari
jumlah zat aktif yang terdapat dalam sediaan obat tersebut yang akan berpengaruh
pada efektivitas sediaan obat dan berpengaruh pada kondisi konsumen. Menurut
Acton (2013) sebagian besar agen pemutih kulit tipe inhibitor tirosinase
merupakan inhibitor kompetitif yang bekerja dengan cara berikatan dengan tirosin
sehingga dibutuhkan asam askorbat dalam konsentrasi yang besar, dan menurut
Arroyave (2015) asam askorbat dalam dosis sangat besar memiliki beberapa
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
resiko seperti hyperuricemia, batu ginjal urea, batu ginjal oksalat, dan
injeksi pemutih kulit perlu dilakukan penetapan kadar asam askorbat yang
merupakan zat aktif dari sediaan injeksi tersebut dengan metode analisis yang
mengandung asam askorbat C6H8O6 tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari
asam askorbat tetapi belum terdapat penelitian yang menggunakan sampel sediaan
farmasetis injeksi asam askorbat sebagai pemutih kulit. Penelitian yang dilakukan
peneliti adalah menetapkan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi
pemutih kulit merek ―X‖ secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase
terbalik dengan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60)
1. Perumusan Masalah
a. Berapakah kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi pemutih kulit
merek ―X‖?
b. Apakah kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi pemutih kulit
merek ―X‖ sesuai dengan kadar yang tercantum pada label kemasan?
4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Keaslian Penelitian
gerak berupa campuran asetonitril dan 0,025 M bufer fosfat pH 3,0 (1 : 9) dan
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kecepatan alir fase gerak 1,0 mL/menit dan deteksi pada panjang gelombang
270 nm untuk menganalisis sediaan kosmetik lotion dan krim pemutih kulit.
Penelitian mengenai agen pemutih kulit juga dilakukan oleh Thongchai dkk.
Extracts‖ menggunakan kolom ODS Hypersil® C18, fase gerak campuran air :
metanol : 0,1 M hydrochloric acid (89 : 10 : 1, v/v), dan kecepatan alir fase
gerak 1,0 mL/menit dan deteksi pada panjang gelombang 222 nm.
sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek ―X‖ dengan menggunakan
dilakukan penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Metodologis.
b. Manfaat Praktis.
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B. Tujuan Penelitian
kulit merek ―X‖ secara kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik yang
telah dioptimasi oleh Jeversoon (2016) dan divalidasi oleh Lestari (2016).
tertera pada kemasan sediaan larutan injeksi pemutih kulit merek ―X‖
secara kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik yang telah dioptimasi
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Pigmentasi
tua, dan kusam (Mander and Liu, 2010). Produk pemutih kulit bertujuan untuk
seperti bercak coklat pada wajah/freckles, melasma, pregnancy marks, dan age
tirosin menjadi melanin. Hiperpigmentasi terjadi saat terlalu banyak melanin yang
diproduksi dan terdeposit pada kulit (Thongchai dkk., 2007). Tirosin yang
menjadi DOPA-kuinon oleh adanya biokatalis enzim tirosinase dan paparan sinar
sampai hitam yaitu melanin (Hardiyanto dan Soedirman, 1981). Adanya inhibitor
contoh senyawa yang bersifat inhibitor tirosinase antara lain adalah: asam
B. Injeksi
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ukurannya injeksi dibagi menjadi dua yaitu larutan intravena volume besar dan
injeksi volume kecil. Larutan intravena volume besar adalah injeksi dosis tunggal
untuk intravena dan dikemas dalam wadah bertanda volume lebih dari 100 mL.
Injeksi volume kecil adalah injeksi yang dikemas dalam wadah bertanda volume
Gambar 1. Ampul sebelum diisi dan disegel (Allen, Popovich, and Ansel, 2011)
Wadah dosis tunggal dapat berupa ampul atau vial dosis tunggal. Ampul
(Gambar 1) disegel dengan mengelas kontainer pada kondisi aseptik dan didesain
memiliki bentuk leher sedemikian rupa sehingga mudah dipisahkan dari bagian
C. Asam Askorbat
kristal tidak berwarna atau serbuk kristal berwarna putih atau hampir putih yang
sangat larut dalam air dan larut dalam alkohol. Asam askorbat disimpan pada
wadah kedap udara, terlindung dari cahaya, pada suhu ruangan penyimpanan 8 -
15oC (Ph. Eur. 5, 2004). Asam askorbat dengan rumus kimia C6H8O6 memiliki
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
berat molekul 176,1 g/mol, pKa = 4,2; 11,6 (pada suhu 25oC), dan log P (oktanol :
air) = 1,8 (Moffat, David, and Widdop, 2011). Terdapat dua bentuk enansiomer
asam askorbat yaitu L-ascorbic acid dan D-ascorbic acid dan yang memiliki
Injeksi asam askorbat adalah larutan steril asam askorbat dalam air untuk
atau natrium bikarbonat; mengandung asam askorbat C 6H8O6 tidak kurang dari
90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Syarat pH
untuk sediaan injeksi asam askorbat adalah 5,5 – 7,0 (Farmakope Indonesia V,
2015). Kadar asam askorbat dalam jaringan dengan pemberian secara intravena
(IV) secara signifikan lebih besar dari pemberian secara oral kurang lebih 25
mmol/L (Stargrove, Treasure, and McKee, 2008). Menurut Arroyave (2015) asam
hyperuricemia, batu ginjal urea, batu ginjal oksalat, dan menghambat absorbsi
vitamin B12.
Sebagian besar agen pemutih kulit tipe inhibitor tirosinase termasuk asam
askorbat (AA) merupakan inhibitor kompetitif yang bekerja dengan cara berikatan
dengan tirosin. Perlu diperhatikan bahwa inhibitor kompetitif untuk tirosinase ini
berikatan dengan tirosin (Acton, 2013). Asam askorbat memiliki berbagai fungsi
sangat sensitif terhadap cahaya, agen pengoksidasi dan ion logam, pemanasan,
dan juga sangat mudah terdegradasi dalam aqueous solution (Lee dkk., 2004).
metafosfat (Golubitskii dkk., 2007). Asam askorbat dapat digunakan sebagai agen
faktor yang menyebabkan ketidakstabilan asam askorbat antara lain cahaya, suhu,
pH, dan oksigen (Hu, Li, Luo, Yang, and Liu, 2012). Degradasi asam askorbat
oksidasi/reduksi. Asam askorbat sangat tidak stabil dalam aqueous solution yang
yang reversible. Selanjutnya DHA akan teroksidasi lebih lanjut menjadi berbagai
L-xylosome seperti yang terdapat pada Gambar 3 dan reaksi oksidasi lanjutan ini
tidak reversible. Kunci utama proses degradasi asam askorbat terletak pada
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ionisasi gugus hidroksi senyawa ini, maka kontrol pada tahap ionisasi gugus
hidroksi asam askorbat mungkin dapat membantu melindungi senyawa ini dari
Gambar 3. Skema reaksi lanjutan degradasi asam askorbat dalam aqueous solution (Lee
dkk., 2004).
stabilitas asam askorbat. Dijelaskan oleh Ghosh, Das, Bagchi, dan Smarta (2013)
bahwa struktur tak jenuh asam askorbat mengakibatkan asam askorbat sangat
hydroxy-2-pyrone (3H2P) pada pH 2-5; 2-furoic acid (2FA) pada pH <2; dan 2,5-
Reaksi fotokimia ini menghasilkan senyawa antara yang reaktif (radikal dan ion)
dan akan bereaksi lebih lanjut melibatkan panas (Koutchma, Forney, and Moraru,
2009). Menurut Novakova dkk. (2008) asam askorbat terdegradasi pada cahaya
alami dan diperlukan pengemas berbahan kaca coklat, dan bila perlu wadah
12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dilapisi dengan aluminium foil. Adanya ion logam juga merupakan faktor yang
dapat menurunkan stabilitas asam askorbat dalam larutan. Beberapa ion logam
yang dapat mengganggu stabilitas antara lain: Cu2+, Fe2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, dan
Zn2+. Keadaan ini dapat ditangani dengan menggunakan agen pengkelat seperti
tidak dapat digunakan untuk sampel yang mengandung agen reduktor selain asam
askorbat (Fadhel, 2012). Disamping itu, metode volumetri juga kurang sensitif
pada senyawa analit (asam askorbat) dengan konsentrasi kecil (Hu dkk., 2012).
melibatkan reduksi besi (III) diikuti penambahan agen pengkelat seperti ferrozine
agar menghasilkan larutan berwarna yang kuat dan stabil dari kompleks besi (II).
Metode ini memiliki kelemahan yaitu sensitivitas dan spesifisitas yang buruk,
hydrazine. Metode ini juga memiliki kelemahan yaitu dapat memberikan hasil
13
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
positif palsu apabila terdapat senyawa glukosa yang strukturnya menyerupai asam
positif palsu apabila terdapat senyawa reduktor selain asam askorbat di sampel
Tutem, Ozyurek, and Apak, 2005). Menurut Hu dkk. (2012), terdapat metode lain
2015).
mengandung banyak eksipien untuk melindungi asam askorbat dari efek oksidasi
analisis. Dilihat dari stabilitas asam askorbat yang rentan teroksidasi, produk
relatif lebih singkat (Washko dkk., 1989). Metode KCKT juga selektif dan dapat
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
digunakan untuk evaluasi stabilitas asam askorbat dalam sediaan farmasetis dan
D. Spektrofotometri UV
frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul tersebut meningkat ke level yang
lebih tinggi maka akan terjadi peristiwa penyerapan energi oleh molekul. Energi
yang berpindah dari suatu tingkat ke tingkat yang lebih tinggi disebut dengan
transisi. Keadaan energi yang lebih rendah disebut keadaan dasar/ground state,
setelah mengalami transisi energi molekuler ini akan meningkat dan berada pada
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mengabsorbsi dapat dihubungkan dengan ikatan yang mungkin ada dalam suatu
molekul (Gandjar dan Rohman, 2007). Elektron yang terlibat pada penyerapan
radiasi ultraviolet ini ada tiga yaitu elektron sigma (σ), elektron phi (π), dan
elektron bukan ikatan (n). Elektron σ adalah elektron yang terlibat dalam
dan satu ikatan lagi dari elektron π akibat dari adanya tumpang tindih pada orbital
dan σ*. Terdapat empat jenis transisi, dua diantaranya yang paling banyak
dijumpai adalah n→π* dan π→π*. Kedua transisi ini merupaka transisi yang
paling cocok untuk analisis sebab sesuai dengan panjang gelombang antara 200-
700 nm dan secara teknis panjang gelombang ini dapat diaplikasikan pada
spektrofotometer.
16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
gugus hidroksil, gugus amino, dan halogen. Ikatan terkonjugasi adalah keadaan
dimana ikatan rangkap terpisahkan oleh satu ikatan tunggal atau berselang-seling
antara ikatan rangkap dan ikatan tunggal (Christian, 2004). Adanya ikatan
sampel dan terjadi penyerapan sejumlah radiasi, sehingga radiasi yang keluar dan
ditangkap oleh detektor akan lebih kecil dari radiasi yang masuk. Banyaknya
jumlah radiasi yang berkurang berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam
(Harvey, 2000). Menurut Skoog, West, dan Holler (1994), serapan (A) berbanding
lurus dengan konsentrasi analit (c) dan tebal kuvet (b), dan dipengaruhi konstanta
17
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
A=abc (1)
A=ɛbc (2)
Keterangan :
A = serapan
ɛ = absorptivitas molar (M-1 cm-1)
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi molekul dalam senyawa analit (M) (Harris, 1995).
persamaan (3).
(3)
Keterangan :
ɛ = absorptivitas molar (M-1cm-1)
= absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi (g/100mL)
serapan pada kisaran 0,2-0,8. Selain itu, manfaat dari informasi nilai adalah
Semakin besar nilai suatu senyawa maka semakin sensitif senyawa tersebut
askorbat adalah 556a pada pelarut asam dan deteksi pada λ 243 nm (Moffat dkk.,
18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2011). Absorptivitas molar yang dapat terbaca pada panjang gelombang 200-700
kromatografi cair dengan pelarut (fase gerak) yang secara terus menerus dialirkan
tinggi untuk pemisahan yang lebih cepat, kolom yang efektif dan dapat
digunakan kembali, dan kontrol yang lebih baik pada keseluruhan proses untuk
hasil yang lebih presisi dan reprodusibel (Snyder, Kirkland, and Dolan, 2010).
lain dalam sampel untuk mendapatkan pengukuran yang akurat. Terdapat 3 faktor
analit yang bersangkutan. Waktu retensi bergantung pada laju alir fase gerak;
semakin cepat laju alir maka waktu retensinya semakin kecil (Ahuja and Dong,
19
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
analit sebagai hasil perbandingan faktor retensi dari dua analit. Peningkatan
selektivitas menjadi fokus utama karena jika selektivitas mempunyai nilai sama
dengan 1 maka puncak dari analit yang diinginkan tidak akan terpisah dari
terhadap fase diam (Kazakevich and LoBrutto, 2007). Salah satu yang menjadi
tolok ukur efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (N) yang didasarkan pada
konsep lempeng teoritis. Efisiensi kolom akan berpengaruh pada waktu retensi
analit. Semakin tinggi jumlah lempeng teoritis maka semakin baik pula efisiensi
kolom. Nilai Height Equivalent Theoritical Plate (HETP) merupakan tolok ukur
(3)
1. Instrumentasi KCKT
ke dalam pompa yang mengontrol laju alir dan tekanan yang dihasilkan fase
hasil deteksi oleh detektor dan menyediakan proses data dalam bentuk grafik
a. Reservoir
Sebagian besar wadah fase gerak terbuat dari bahan gelas. Bahan
wadah fase gerak harus inert dan juga dijaga kebersihannya. Semacam
gerak, tetapi tidak boleh ditutup terlalu rapat karena hal tersebut akan
menimbulkan keadaan vakum saat fase gerak di pompa keluar dari wadah
b. Pompa
fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
untuk analisis secara rutin didesain untuk dapat bekerja sampai tekanan
6000 psi, tetapi kebanyakan sistem berada pada 2000 sampai 3000 psi.
Saat sistem KCKT digunakan pada tekanan tinggi (> 3000 psi) perlu
21
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2010).
c. Penyuntikan Sampel
dengan dengan sample loop dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini
yang lebih tinggi yang tidak dapat dicapai oleh injeksi manual (Christian,
2004).
d. Kolom
yang terikat pada partikel silika. Fase diam yang biasa digunakan antara
pada kolom mengacu pada ruang yang ada diantara partikel-partikel silika
22
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
terjadi antara komponen sampel dengan fase gerak dan fase diam seperti
polaritas fase diam dan fase gerak, KCKT pada umumnya dibagi menjadi
dua jenis yaitu KCKT fase terbalik dan KCKT fase normal (Gandjar dan
Rohman, 2007). Pada KCKT fase terbalik, fase diam yang digunakan
komponen dalam sampel yang bersifat polar akan terelusi lebih dahulu
nonpolar. Hal ini disebabkan komponen yang bersifat polar dalam sampel
berinteraksi lemah dengan fase diam sehingga lebih terbawa fase gerak
lebih kuat dengan fase diam sehingga lebih sukar terbawa fase gerak
23
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
e. Detektor
detektor universal (mendeteksi zat secara umum, tidak spesifik, dan tidak
selektif) dan detektor spesifik yang dapat mendeteksi analit secara spesifik
dan selektif. Contoh detektor universal antara lain detektor indeks bias dan
diperlukan pada KCKT dan yang paling banyak digunakan adalah detektor
ultraviolet. Detektor ini sensitif terhadap banyak jenis senyawa organik, tidak
sensitif terhadap suhu, relatif murah, dan dapat digunakan elusi secara
gradien. Tentunya detektor ini tidak dapat digunakan apabila pelarut yang
UV (Christian, 2004).
2. Fase Gerak
sebab fase gerak berinteraksi secara langsung dengan sampel dan memiliki
24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
and Sampaio, 2006). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
daya elusi dan resolusi. Beberapa faktor yang mempengaruhi daya elusi dan
resolusi antara lain polaritas fase gerak, polaritas fase diam, dan sifat
pemilihan fase gerak salah satunya adalah kompatibilitas antar pelarut yang
perlu diperhatikan agar komponen fase gerak dapat bercampur dengan baik.
Campuran fase gerak juga harus dapat digunakan untuk melarutkan analit
dengan baik karena apabila analit tidak terlarut sempurna pada fase gerak
polaritas, transmisi cahaya, viskositas, dan pH. Sebagian besar senyawa obat
fase gerak yang membawa analit agar analit tetap dalam bentuk molekulnya
larutan bufer dalam komponen penyusun fase gerak. Hal yang perlu
pelarut yang digunakan karena pemilihan jenis bufer yang salah akan
25
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
KCKT fase terbalik kekuatan pelarut ini tergantung pada pelarut organik yang
disebut juga modifier (Christian, 2004). Fase gerak yang sering digunakan
pada KCKT fase terbalik adalah campuran metanol dan asetonitril dengan air
atau dengan larutan bufer (Gandjar dan Rohman., 2007). Kekuatan pelarut
merupakan total seluruh jenis interaksi molekular yang terjadi antara lain
dispersi, orientasi, dan ikatan hidrogen. Kekuatan pelarut akan semakin tinggi
saat terdapat interaksi yang baik antara pelarut dan analit (Wilard, Merritt,
pelarut akan memberikan absorbansi lebih dari satu satuan absorbansi. Hal ini
sangat penting terutama bila pada sistem KCKT menggunakan detektor UV-
3. Fase Diam
26
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Material dasar yang paling sering digunakan adalah silika (SiO 2). Tujuan
yang bersifat polar menjadi nonpolar. Fase terikat yang paling banyak
digunakan adalah fase terikat tipe alkil (C1-C18; C30). Pada KCKT fase
SiOH) dengan suatu bagian organik yang umumnya adalah suatu hidrokarbon
Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika maka akan
Gambar 9 dimana X sering kali berupa –Cl atau –OEt, dan/atau –CH3 yang
memberikan hasil sampingan berupa HCl atau etanol (Snyder dkk., 2010).
degradasi fase diam yang serius (Wilard, Merritt, Dean, and Settle, 1988).
dapat ditoleransi, yaitu pH 2-7. Dampak lain yang dapat dilihat adalah
terbentuknya puncak yang asimetris akibat adanya interaksi antara bentuk ion
27
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Larutan Bufer
terion (non-ionized) suatu analit dapat mencapai 30 kali lebih besar dari
bentuk terionnya, hal ini dapat diatasi dengan mengatur pH fase gerak.
dengan kapasitas bufer yang baik untuk menghindari fluktuasi yang tinggi
pada waktu retensi (Ahuja and Dong, 2005). Larutan bufer atau larutan
fase gerak. Kapasitas bufer akan menurun ketika ada perbedaan nilai pKa
larutan bufer adalah memiliki nilai pKa yang berada dalam rentang ± 1 ,0 unit
dari pH fase gerak yang diinginkan. Salah satu bufer yang sering digunakan
dalam analisis dengan detektor UV dan pH fase gerak ≤ 8 adalah bufer fosfat.
Bufer ini memiliki nilai pKa = 2,1 (25 oC) dengan rentang bufer 1,5 – 3,5
28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
membaca konsentrasi analit dalam kolom dalam bentuk sinyal elektrik. Sistem
data kemudian mengubah sinyal ini menjadi suatu plot dari intensitas versus
dengan membandingkan antara data retensi sampel dengan data retensi baku yang
sesuai (Gandjar dan Rohman, 2007). Waktu retensi diukur dari waktu saat
dengan variasi ±0,02-0,05 menit antar injeksi dalam sekali running sistem KCKT.
Analit yang diinjeksikan apabila memiliki waktu retensi yang berada pada rentang
waktu retensi senyawa baku, dapat diartikan bahwa puncak analit tersebut
tinggi puncak. Luas puncak dan tinggi puncak berbanding langsung dengan
banyaknya solut yang dianalisis, jika dilakukan pada kisaran detektor yang linier
(Gandjar dan Rohman, 2007). Analisis kuantitatif berdasarkan luas puncak lebih
disarankan karena bebas dari pengaruh suhu kolom, laju alir, dan komposisi fase
29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
F. Landasan Teori
sebagai agen pemutih kulit dalam bentuk injeksi. Bioavailabilitas asam askorbat
askorbat dalam jumlah yang besar. Maka dari itu banyak sediaan pemutih kulit
asam askorbat dalam konsentrasi besar tersedia dalam bentuk larutan injeksi.
Meskipun begitu, senyawa inhibitor tirosinase ini merupakan senyawa yang tidak
stabil dalam bentuk larutan juga tidak stabil terhadap pH, ion logam, suhu,
asam askorbat dalam sediaan dan mempengaruhi kualitas sediaan sehingga perlu
dilakukan penetapan kadar asam askorbat dengan metode analisis yang tepat dan
analisis dengan selektivitas dan sensitivitas yang baik sehingga dapat digunakan
untuk melakukan penetapan kadar asam askorbat dalam sampel larutan injeksi
obat pemutih kulit. Metode KCKT yang digunakan dalam penetapan kadar asam
askorbat telah dioptimasi oleh Jeversoon (2016) dan telah divalidasi oleh Lestari
(2016) agar diperoleh hasil yang baik. Asam askorbat dapat dideteksi oleh
asam askorbat adalah 556a pada pelarut asam dan deteksi pada λ 243 nm yang
berarti senyawa ini dapat dideteksi dengan KCKT detektor UV. Penghitungan
30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kadar dilakukan dengan menghitung nilai luas puncak/area under curve (AUC)
Indonesia V (2015).
G. Hipotesis
Kadar asam askorbat terukur secara kromatografi cair kinerja tinggi fase
terbalik, yang telah dioptimasi oleh Jeversoon (2016) dan divalidasi oleh Lestari
(2016), tidak sesuai dengan kadar yang tertera pada kemasan sediaan larutan
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III
METODE PENELITIAN
deskriptif karena tidak ada intervensi terhadap subjek uji yaitu sediaan larutan
injeksi obat pemutih kulit merek ―X‖ dan hanya menggambarkan keadaan yang
ada.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
2. Variabel tergantung
C. Definisi Operasional
32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Sistem KCKT yang digunakan adalah sistem KCKT fase terbalik dengan
kolom Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dengan fase gerak metanol
3. Parameter penetapan kadar secara KCKT adalah kadar asam askorbat hasil
D. Bahan Penelitian
asam askorbat (Supelco) (COA pada Lampiran 1); LiChrosolv® methanol for
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat KCKT
(2) 100A, dimensi 250 x 4,6 mm (No. Column 718240-16 part. 00G-4252-EO),
timbangan analitik SCALTEC (max 60/210 g, min 0,001 g), pompa vakum
33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Meter Lab 850 (SI Analytics), dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di
laboratorium analisis.
34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 40; 50; dan 60
µg/mL dengan mengencerkan 4,0; 5,0; dan 6,0 mL larutan stok menggunakan
625, dan 750 µL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL. Selanjutnya
tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi lebih kurang sebesar 50, 75, 100,
35
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
125, dan 150 µg/mL. Larutan disaring dengan millipore 0,45 µm dan
tiga kali replikasi. Luas puncak digunakan untuk menghitung regresi linear
100, dan 150 µg/mL diinjeksikan ke sistem KCKT fase terbalik dalam
rentang waktu empat jam dengan interval satu jam. Pengujian stabilitas ini
dilakukan dalam tiga kali replikasi. Stabilitas asam askorbat dilihat dari nilai
nomor 21 dengan kapasitas tidak lebih dari tiga kali volume yang akan diukur
dan dipindahkan ke dalam gelas ukur volume tertentu sehingga volume yang
Volume yang diukur tidak kurang dari volume yang tertera pada wadah bila
36
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
diuji satu per satu, kelebihan volume yang dianjurkan sebesar 0,30 mL
dengan pelarut metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga tanda batas
sehingga dihasilkan larutan stok dengan konsentrasi lebih kurang 1000 µg/mL.
metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga tanda batas sehingga
dihasilkan larutan sampel dengan konsentrasi lebih kurang 240 µg/mL. Larutan
G. Analisis Hasil
retensi (tR) senyawa sampel dengan senyawa baku. Analisis kuantitatif yang
under curve (AUC) dari baku. Kurva baku merupakan grafik hubungan antara
37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dalam persamaan regresi kurva baku sebagai nilai y sehingga akan didapatkan
kadar sampel asam askorbat. Kadar asam askorbat dalam larutan injeksi obat
pemutih kulit merek ―X‖ dinyatakan dalam jumlah mg/5 mL. Sediaan injeksi obat
pemutih kulit merek ―X‖ dikatakan sesuai dengan persyaratan apabila sediaan ini
mengandung asam askorbat tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0%
38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
kulit secara KCKT fase terbalik ini telah dioptimasi oleh Jeversoon (2016) dan
divalidasi oleh Lestari (2016). Melalui tahap optimasi diperoleh komposisi fase
gerak yang optimal untuk menetapkan kadar asam askorbat yaitu campuran
metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3,0 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9
mL/menit dengan deteksi pada panjang gelombang maksimum 244 nm. Melalui
Metode yang digunakan adalah KCKT fase terbalik. Metode ini dipilih
memiliki teknik deteksi dengan sensitivitas yang lebih tinggi (Novakova dkk.,
untuk deteksi dengan panjang gelombang di atas 185 nm (Snyder, Kirkland, and
KCKT dalam analisis senyawa asam askorbat. Hal ini dikarenakan asam askorbat
39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pengganggu.
A. Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah fase gerak yang
diperoleh dari hasil optimasi oleh Jeversoon (2016) yaitu metanol : 0,01 M bufer
fosfat pH 3,0 (40 : 60). Menurut Snyder dkk. (2010), waktu retensi yang baik
adalah kurang dari 10 menit dan tailing factor yang baik adalah < 2. Komposisi
hasil optimasi tersebut menghasilkan waktu retensi 2,725 menit dan tailing factor
larutan asam askorbat dalam sistem KCKT yang digunakan. Pada pH rendah,
produk degradasi utama asam askorbat yaitu dehydroascorbic acid dapat ditekan
pembentukkannya. Asam askorbat sangat tidak stabil karena gugus hidroksi yang
terletak pada posisi alfa dan beta terhadap atom C karbonil sangat mudah
terionisasi pada pH yang semakin tinggi, maka dilakukan kontrol pada pH fase
gerak untuk membantu melindungi senyawa ini dari degradasi dalam aqueous
system dengan catatan tidak terdapat ion logam dalam pelarut yang digunakan.
Degradasi asam askorbat akan meningkat dengan adanya ion logam transisi
seperti Cu2+ dan Fe3+. Menurut Khan dan Sarwar (2001), ion Cu2+, Fe3+, Cr6+,
Mn2+ dan V5+ mampu meningkatkan kecepatan reaksi degradasi asam askorbat
40
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
jenis pelarut yang jumlah kandungan mineralnya terkontrol (Falah, Gunawan, dan
Haris, 2009). Ion logam merupakan salah satu mineral yang terdapat dalam air.
Parameter yang digunakan untuk melihat jumlah mineral dalam air adalah
dalam menghantarkan arus listrik melalui ion-ion yang terdapat dalam air tersebut
pembuatan air bebas mineral, air baku dialirkan melewati resin penukar ion yang
terdiri dari resin penukar kation, resin penukar anion, dan mixbead resin. Resin
penukar ion berfungsi untuk mengambil pengotor dalam air dengan cara
pertukaran ion yang bermuatan sama antara air dengan resin penukar ionnya.
Resin penukar kation akan mengambil pengotor kation dari air dan menukarnya
dengan ion H+ sedangkan resin penukar anion akan mengambil pengotor anion
dari air dan menukarnya dengan ion OH-. Selanjutnya sisa-sisa pengotor dalam air
akan dipertukarkan dengan ion yang sesuai pada mixed bed resin (Lestari dan
Utomo, 2007).
tergantung pada bidang aplikasinya. Sebagai contoh syarat konduktivitas air pada
industri dengan metal dan textile finishing adalah < 10 µS/cm (Harland, 1994).
Sampel injeksi yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan pelarut water
41
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
for injection yang memiliki batas konduktivitas ≤ 2,1 µS/cm (USP-38, NF-33).
Mengacu pada batas konduktivitas elektrik dari water for injection sebagai pelarut
penelitian ini akua DM yang digunakan tidak memiliki data konduktivitas dari
perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar.
panjang gelombang 200-400 nm. Berdasarkan profil spektra yang diperoleh pada
penelitian ini (Gambar 10) panjang gelombang maksimum asam askorbat adalah
244 nm. Hasil ini diperoleh dengan melihat kenaikkan respon serapan yang
(40, 50, dan 60 µg/mL) adalah untuk melihat apakah perbedaan konsentrasi
yang terbentuk dan panjang gelombang maksimum yang diperoleh benar milik
asam askorbat.
42
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 10. Spektra asam askorbat pada tiga level konsentrasi (40; 50; dan 60 µg/mL)
dalam pelarut bufer fosfat pH 3.
ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom seperti pada Gambar 11. Transisi
askorbat dalam pelarut asam dan deteksi pada panjang gelombang 243 nm adalah
9791,15 M-1 cm-1, menunjukkan bahwa asam askorbat akan mengalami transisi
Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom pada senyawa asam askorbat
yang berarti panjang gelombang hasil optimasi pada penelitian ini masuk dalam
yang terdapat dalam sampel, maka penting untuk menguji stabilitas dari senyawa
uji selama penelitian dengan maksud agar kondisi dalam sampel yang ditunjukkan
dari hasil pengukuran menunjukkan kondisi sesungguhnya dan bukan hasil dari
pengukuran stabilitas larutan baku untuk mengetahui stabilitas dari senyawa asam
konsentrasi yaitu 50, 100, dan 150 µg/mL dalam pelarut metanol : 0,01 M bufer
fosfat pH 3 (40 : 60) selama 4 jam dengan interval 1 jam. Pengujian stabilitas
harus mencakup total waktu yang digunakan selama analisis asam askorbat dan
dalam penelitian ini peneliti melakukan pengukuran larutan baku asam askorbat
kurang lebih selama 2 jam terhitung mulai dari penimbangan hingga selesai
pengukuran secara KCKT. Menurut Ahuja dan Dong (2005), larutan baku dapat
dikatakan stabil jika persen perubahan yang terjadi kurang dari 2%.
Hasil uji kestabilan larutan baku asam askorbat dapat dilihat pada Tabel
I, II, dan III. Konsentrasi asam askorbat hasil uji kestabilan dihitung terhadap
dilihat bahwa % perubahan yang diperoleh pada konsentrasi 50; 100, dan 150
44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
yang stabil ≥ 2 jam maka hasil pengujian stabilitas yang stabil dalam waktu 4 jam
ini memenuhi persyaratan. Larutan baku asam askorbat dinyatakan stabil dan
dapat dilakukan analisis kuantitatif pada sampel larutan injeksi merek ―X‖
Tabel II. Hasil uji kestabilan larutan baku asam askorbat replikasi 2
Tabel III. Hasil uji kestabilan larutan baku asam askorbat replikasi 3
Larutan Baku Asam Askorbat
Jam ke- 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL
AUC Konsentrasi AUC Konsentrasi AUC Konsentrasi
(mAU) (µg/mL) (mAU) (µg/mL) (mAU) (µg/mL)
0 3839183 58,911 6800041 101,087 10153895 148,862
1 3836529 58,873 6799386 101,078 10151630 148,829
2 3835568 58,859 6798513 101,065 10148625 148,787
3 3835508 58,859 6797668 101,053 10148385 148,783
4 3834241 58,841 6788846 100,928 10144997 148,735
45
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel IV. Persen perbedaan konsentrasi larutan baku asam askorbat replikasi
Kadar Teoritis Replikasi % perubahan antara jam ke-0 dengan jam ke-
(µg/mL) Ke- 1 2 3 4
1 0,064 0,051 0,052 0,070
50 2 0,064 0,051 0,052 0,070
3 0,064 0,051 0,052 0,070
1 0,009 0,022 0,034 0,159
100 2 0,009 0,022 0,034 0,159
3 0,009 0,022 0,034 0,159
1 0,032 0,075 0,078 0,127
150 2 0,032 0,075 0,078 0,127
3 0,032 0,075 0,078 0,127
Hal yang perlu menjadi perhatian dalam penelitian ini adalah senyawa
asam askorbat yang sangat tidak stabil pada aqueous solution. Faktor penyebab
degradasi harus dijaga seminimal mungkin agar tidak menghasilkan bias pada
hasil pengukuran kadar asam askorbat. Sample ―X‖ yang digunakan dalam
penelitian ini memiliki pengemas berupa ampul berbahan kaca bening dengan
fotooksidasi, selama preparasi vial sampel dan juga labu ukur wadah larutan yang
selalu diusahakan pada suhu rendah seperti: selama penelitian disimpan dalam
menjaga suhu larutan tetap rendah, dan dilakukan pengaturan suhu pada ruang
46
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
berupa parameter linearitas yang diukur dari nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998
(Kazakevich and Lobrutto, 2007). Pembuatan kurva baku ini menggunakan lima
konsentrasi yaitu 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL dalam tiga kali replikasi. Hasil
pengukurannya dapat dilihat pada Tabel V. Persamaan kurva baku yang diperoleh
digunakan untuk menetapkan kadar asam askorbat dalam sampel larutan injeksi
merek ―X‖.
askorbat dalam sampel larutan injeksi merek ―X‖ yaitu Y = 70202X – 296485
dengan nilai r = 0,9989 dari replikasi I. Persamaan kurva baku tersebut dipilih
berdasarkan nilai r dan nilai intercept-nya (A). Dapat dilihat dari ketiga replikasi
tersebut seluruh nilai r nya memenuhi syarat (≥ 0,998) dan dilihat dari nilai
47
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kurva baku dari replikasi I. Kurva hubungan antara AUC sebagai respon dengan
12000000
Area Under Curve (mAU)
y = 70202x - 296485
10000000 R² = 0,9979
8000000
6000000
Series1
4000000
Linear (Series1)
2000000
0
0 50 100 150 200
Konsentrasi (µg/mL)
E. Analisis Kualitatif
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sediaan larutan injeksi
pemutih kulit merek ―X‖ yang mengandung 1000 mg asam askorbat setiap 5 mL
retensi baku asam askorbat dengan waktu retensi sampel, semakin mirip waktu
menunjukkan puncak baku asam askorbat pada waktu retensi 3,030 menit, dan
pada 3,033 menit. Hal ini menunjukkan dalam sampel injeksi pemutih kulit merek
48
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 13. Kromatogram baku asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL dalam pelarut
metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60).
Gambar 14. Kromatogram sampel yang berlabel asam askorbat konsentrasi 100 µg/mL
dalam pelarut metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60).
49
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
penelitian ini dihasilkan puncak tunggal yang merupakan puncak asam askorbat
karena secara teori puncak metilparaben dan propilparaben akan muncul pada
waktu retensi yang lebih panjang dikarenakan sifatnya yang lebih non polar
dibandingkan dengan asam askorbat. Hal ini dapat dilihat dari nilai log P (oktanol
: air) metilparaben = 2,0 dan propilparaben = 3,0 yang lebih besar dari nilai log P
asam askorbat = 1,8 (Moffat dkk., 2011). Semakin besar nilai log P maka
gelombang UV yang digunakan dalam penelitian ini. Meskipun begitu tidak dapat
dipastikan kemurnian puncak AA dan waktu retensi ketiga senyawa ini karena
Gambar 15. Struktur asam askorbat yang memiliki gugus kromofor serta produk
degradasinya (asam dehidroaskorbat) yang tidak memiliki gugus kromofor. (Lee dkk.,
2004).
fase terbalik dengan fase gerak lebih polar daripada fase diam, dimana analit yang
50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
bersifat polar akan lebih kuat berikatan dengan fase gerak. Asam askorbat
merupakan suatu senyawa yang bersifat polar (log P oktanol : air = 1,8) sehingga
secara teori asam askorbat akan terelusi dengan cepat yang dapat ditunjukkan
dengan waktu retensi yang pendek. Interaksi asam askorbat dengan fase diam
adalah interaksi gaya London (Gambar 16) sedangkan interaksi yang terjadi pada
asam askorbat dengan fase gerak adalah interaksi hidrogen (Gambar 17).
Berdasarkan penjelasan interaksi yang terjadi antara asam askorbat dengan fase
diam dan fase gerak, dapat dikatakan bahwa interaksi asam askorbat dengan fase
diam merupakan interaksi yang bersifat lemah sehingga asam askorbat cenderung
Gambar 16. Interaksi asam askorbat Gambar 17. Interaksi asam askorbat
dengan fase diam oktadesilsilan dengan fase gerak metanol : bufer fosfat
F. Analisis Kuantitatif
sediaan larutan injeksi asam askorbat sebagai tahap awal identifikasi untuk
yang diperbolehkan untuk sediaan larutan injeksi cair adalah 0,30 mL dari volume
yang tertera pada label (Tabel VI) dan tidak ada vial yang memiliki volume
51
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kurang dari volume yang tertera pada label. Dari penetapan volume injeksi yang
dilakukan, tidak ada satu pun vial yang menyimpang dari persyaratan. Hal ini
menunjukkan bahwa dari enam kemasan sediaan larutan injeksi pemutih kulit
Tabel VI. Data penetapan volume injeksi sampel larutan injeksi asam askorbat
No Volume Terukur (mL)
1 5,19
2 5,05
3 5,15
4 5,22
5 5,18
6 5,09
dalam sampel yang mengandung 1000 mg asam askorbat setiap 5 mL (20% b/v).
Analisis kuantitatif dilakukan enam kali replikasi menggunakan enam vial sampel
dengan nomor batch yang sama. Dilakukan pembuatan larutan stok sampel
dengan konsentrasi 1000 µg/mL, lalu dibuat larutan sampel dengan konsentrasi
asam askorbat 240 ppm. Respon AUC sampel yang didapat kemudian
sehingga diperoleh kadar asam askorbat seperti yang tertera pada Tabel VII.
mengandung asam askorbat adalah 90-110% dari kadar yang tertera pada label
untuk asam askorbat pada sampel larutan injeksi merek ―X‖ penelitian ini adalah
412,479 ± 60,765 mg/5mL dan tidak ada satupun sampel yang masuk ke dalam
52
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
askorbat terukur tidak sesuai dengan kadar asam askorbat yang tertera pada label
kemasan. Nilai RSD yang diperoleh adalah 14,732% juga tidak memenuhi
Tabel VII. Hasil Pengukuran Kadar Sampel Injeksi Pemutih Kulit Merek “X”
Kadar Kadar
Kadar x faktor Kadar asam
Replikasi AUC asam asam
pengenceran askorbat
ke (mAU) askorbat askorbat
(µg/mL) (mg/5mL)
(µg/mL) (% b/v)
1 5709835 85,558 71298,048 7,130 356,490
2 5965200 89,195 74328,869 7,433 371,644
3 6648650 98,931 82442,170 8,244 412,211
4 6212242 92,714 77261,358 7,726 386,307
5 8565223 126,232 105192,913 10,519 525,965
6 6817926 101,342 84451,329 8,445 422,257
Rata-rata 412,479
SD 60,765
RSD (%) 14,732
tirosinase dengan berinteraksi dengan ion tembaga pada sisi aktif tirosinase
tirosinase agar tidak berikatan dengan tirosin (Acton, 2013). Maka dari itu asam
askorbat sebagai agen pemutih kulit tersedia dalam kadar yang cukup besar.
Apabila ternyata kadar asam askorbat lebih rendah dari yang tertera dalam label
akan terjadi subdosis dan efek dari sediaan obat tersebut tidak tercapai yang
merupakan senyawa yang sangat tidak stabil terutama dalam aqueous solution,
dalam aqueous solution. Asam askorbat memiliki nilai pKa = 4,2 (Moffat dkk.,
2011), pH media pembawa yang lebih besar dari pKa asam askorbat akan
pada penelitian ini menggunakan wadah berupa vial putih bening yang tembus
cahaya (Gambar 18). Dari sisi pengemasan dapat dikatakan bahwa kemasan
lainnya seperti suhu, oksigen, dan ion logam juga dapat menjadi penyebab
ketidakstabilan tersebut, sediaan sampel larutan injeksi asam askorbat ini tidak
memiliki nomor registrasi yang tertera pada labelnya baik pada kemasan primer
Gambar 18. Sampel injeksi pemutih kulit merek “X” yang menggunakan vial putih bening
54
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB V
A. KESIMPULAN
mg/5mL tidak sesuai dengan kadar yang tertera pada label kemasan sediaan
larutan injeksi pemutih kulit merek ―X‖ (batch F2076) berdasarkan persyaratan
B. KETERBATASAN PENELITIAN
terhadap senyawa hasil degradasi asam askorbat dan matriks yang terdapat dalam
sampel.
C. SARAN
kulit merek ―X‖ secara kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik perlu
55
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR PUSTAKA
57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kapur, A., Haskovic, A., Copra-Janicijevic, A., Klepo, L., Topcagic, A.,
Tahirovic, I., et.al., 2012, Spectrophotometric Analysis of Total AA
Content in Various Fruits and Vegetable, Bulletin of the Chemists and
Technologist of Bosnia and Herzegovina, pp. 39-42.
Kazakevich, Y., and Lobrutto, R., 2007, HPLC for Pharmaceutical Scientist,
Wiley and Sons inc., USA, pp. 96-101, 145-146, 462.
Khan, M. N. dan Sarwar, A., 2001, The Influence of Transition Metal Ions on the
Kinetics of Ascorbic Acid Oxidation by Methylene Blue in Strongly
Acidic Media, TUBITAK, 25, 433-440.
Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, Penerbit Universitas
Indonesia, Jakarta, hal. 202.
Koutchma, T.N., Forney, L.J., dan Moraru, C.I., 2009, Ultraviolet Light in Food
Technology: Principles and Applications, CRC Press, Boca Raton, p.
104.
Lee, J.S., Kim, J.W., Han, S.H., Chang, I.S., Kang, H.H., Lee, O.S., et al.,2004,
The Stabilization of L-ascorbic Acid in Aqueous Solution and Water-in-
Oil-in-Water Double Emulsion by Controlling pH and Electrolyte
Concentration, J. Cosmet. Sci., 55, 1-12.
Lestari, D.E. dan Utomo, S.B., 2007, Karakteristik Kinerja Resin Penukar Ion
Pada Sistem Air Bebas Mineral (GCA 01) RSG-GAS, Seminar Nasional
III SDM Teknologi Nuklir, Sekolah Tinggi Teknologi Nuklir – BATAN,
hal. 95-104.
Lestari, R., 2016, Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase
Terbalik untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan
Injeksi Obat Pemutih Kulit Merk “X”, Skripsi, Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
Mander, L.N., and Liu, H., 2010, Comprehesive Natural Products II: Chemistry
and Biology, Elsevier Science & Technology Books, Boulevard, United
Kingdom, p. 322.
Mitic, S.S., Kostic, D.A., Naskovic-Dokic, D.C., and Mitic, M.N., 2011, Rapid
and Reliable, HPLC Method for the Determination of Vitamin C in
Pharmaceutical Samples, Tropical Journey of Pharmaceutial Research,
pp. 105-111.
Moffat, A., David, M., and Widdop, B., 4th Ed., 2011, Clarke’s Analysis of Drugs
and Poisons, 4th edition, Pharmaceutical press, London, pp.507, 923.
Mulja, H. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,
Surabaya, p. 102.
58
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LAMPIRAN
60
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Replikasi I
64
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Replikasi II
72
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Replikasi III
80
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Konsentrasi 50 µg/mL
2. Konsentrasi 75 µg/mL
87
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Konsentrasi 50 µg/mL
2. Konsentrasi 75 µg/mL
90
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1. Konsentrasi 50 µg/mL
2. Konsentrasi 75 µg/mL
94
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
A. Replikasi 1
mg
µg/mL
V1 x C1 = V2 x C2
B. Replikasi 2
µg/mL
96
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
V1 x C1 = V2 x C2
C. Replikasi 3
µg/mL
V1 x C1 = V2 x C2
97
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Persamaan kurva baku yang digunakan adalah kurva baku replikasi I, yaitu:
Y = 70202X - 296485
12000000
y = 70202x - 296485
10000000
Area Under Curve (mAU)
8000000
6000000
Series1
4000000 Linear (Series1)
2000000
0
0 50 100 150 200
Konsentrasi asam askorbat (µg/mL)
98
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Y = AUC
X = kadar (µg/mL)
Replikasi ke:
1. X = = 85,558 µg/mL
2. X = = 89,195 µg/mL
3. X = = 98,931 µg/mL
4. X = = 92,714 µg/mL
5. X = = 126,232 µg/mL
6. X = = 101,342 µg/mL
102
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
SD = 60,765
Rata-rata = 412,479
= x 100%
= 14,732%
103
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BIOGRAFI PENULIS
2009, dan SMA PL Van Lith Muntilan 2009-2012. Penulis melanjutkan studi di
praktikum Kimia Organik, Analisis Farmasi dan Validasi Metode, dan asisten
Teknologi Bandung (ITB) tahun 2015. Selain itu penulis pernah berpartisipasi
Teknologi dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia pada tahun 2015 dengan
Meningkatkan Cara Hidup Sehat Bagi Anak-anak Bantaran Kali Code Selatan
105