Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ ditumbuhkan ke media baru.
Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar jika
terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating
loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle. Inoculating
loop cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok
digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab inoculating.
c. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)
Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan
mikroba.Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat berupa kapas,
tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil. Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat
diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak (deep tube agar) dan agar miring
(slants agar). Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas
permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak terlalu lebar dan hindari jarak
media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alasan
efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10-12 ml tiap tabung.
d.Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)
Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan. Labu Erlenmeyer dapat digunakan
untuk meracik dan menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung akuades, kultivasi
mikroba dalam kultur cair, dll. Terdapat beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat
ditampungnya yaitu 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml, dsb.
e. Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di dalam mikrobiologi, dapat
digunakan untuk preparasi media media, menampung akuades dll.
f.Gelas ukur (Graduated Cylinder)
Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas ukur memiliki
beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya.
g.Cawan Petri (Petri Dish)
Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang
ke cawan bagian bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai
macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15-
20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.
h.Batang L (L Rod)
Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan mediaagar supaya bakteri yang
tersuspensidalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini juga disebut spreader.
i.Tabung Durham (Durham Tube)
Tabung durham yaitu tabung yang memiliki bentuk yang sama dengan tabung reaksi tetapi
memiliki ukuran yang lebih kecil dibanding tabung reaksi. Berfungsi untuk menampung hasil
fermentasi mikroorganisme berupa gas. Dalam penggunaannya, maka tabung durham itu ditempatkan
terbalik di dalam tabung reaksi yang lebih besar dan tabung ini kemudian diisi dengan medium cair.
Setelah seluruhnya disterilkan dan medium sudah dingin, maka dapat dilakukan inokulasi. Jika bakteri
yang ditumbuhkan dalam media tersebut memang menghasilkan gas, maka gas akan tampak sebagai
gelembung pada dasar tabung durham.
j.Termometer (thermometer)
Termometer adalah batang kaca yang panjangnya 300 mm, diameter 6-7 mm berisi air raksa
dan gas, serta dilengkapi dengan skala derajat Celcius. Berfungsi untuk mengukur suhu suatu larutan
atau ruang inkubator. Prinsip kerjanya yaitu mengukur suhu sesuai laju air raksa di dalam
thermometer.
1.Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)
Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar
bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan
diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau
yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru
(paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol.
Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu
larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga
mampu mempercepat proses homogenisasi. Pengadukan dengan bantuan batang magnet Hot plate dan
magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS® misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L, dengan
kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm dan dapat dipanaskan sampai 425oC.
n. Autoklaf (Autoclave)
Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu benda
menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (1210C, 15 lbs) selama kurang lebih 15 menit.
Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan
meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganisme.
Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh
bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama,
endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri
tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan
atmosfer normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel
vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C.
Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121
°C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf
akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa
semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika
cairan dalam volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih
lama untuk mencapai suhu sterilisasi. Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya
Bacillus stearothermophilus.
Sementara itu, untuk mengecek alat autoklaf masih bekerja baik atau tidak, diperlukan
pengetesan menggunakan indikator biologi. Indikator biologi yang lazim digunakan adalah
endospora Bacillus stearothermophilus. Spora bakteri tersebut dipakai karena sporanya dapat resistan
terhadap panas. Apabila setelah sterilisasi masih ditemukan spora bakteri tersebut, berarti alat autoklaf
sedang bermasalah. Cara pengecekan dimulai dengan menaruh strip yang mengandung spora bakteri
dengan material yang disterilisasi pada autoklaf. Setelah proses sterilisasi selesai, tiap strip
ditempatkan di dalam medium cair. Apabila terjadi perubahan warna pH indikator pada medium cair,
berarti proses sterilisasi tidak berjalan sukses.
Penangas air besfungsi untuk menyimpan media agar (yang digunakan untuk analisa dengan
teknik tuang / pure plate ) supaya media tetap dalam kondisi leleh/cair, bisanya suhu diatur pada
kisaran 40-45oC. Untuk menjaga air pada penangas air tidak terkontaminasi mikro organisme maka
perlu ditambahkan citric acid 0.3% dan potassium sorbat 0.1%.
p. pH Meter
pH meter berfungsi untuk mencek derajat keasaman / pH media, karena derajat keasaman
sangan berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba.
Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF) adalah alat
yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola pengaturan dan penyaring
aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasi sinar UV beberapa jam sebelum digunakan.
Microbiological safety cabinet (MSC) adalah suatu tempat atau ruangan yang didesain untuk
memproteksi suatu pekerjaan dari kontaminasi, contohnya adalah transfer box atau laminar flow.
Selain itu, MSC berguna untuk menciptakan keadaan yang aseptis pada saat pembuatan medium atau
manipulasi objek mikroorganisme. Alat MSC mempunyai berbagai tipe sirkulasi udara, setidaknya
ada tiga tipe. Salah satu tipenya, udara yang telah terfiltrasi dialirkan ke seluruh MSC agar tercipta
sirkulasi udara yang baik, kemudian dikeluarkan melalui suatu exhaust air. Sirkulasi udara bersih
tersebut dapat mencegah kontaminasi pada saat melakukan kegiatan pembuatan medium atau
manipulasi objek mikroorganisme (Collins & Lyne, 2004).
s.Colony counter
Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di
dalam cawankarena adanya kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran
yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada
cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset.
Mikroskop ini berfungsi untuk melihat objek yang membutuhkan perbesaran tidak terlalu
besar. Di Laboratorium Mikrobiologi, mikroskop stereo biasanya digunakan untuk mengamati secara
detail bentuk koloni dan jamur.
CATATAN PENTING :
Pewarnaan yang menggunakan metode pemanasan preparat : Acid Fast & Spora
Pewarnaan yang menggunakan metode pelunturan: Gram (alkohol 95-96%) & Acid Fast (alkohol
asam)
Pada pewarnaan dengan metode pemanasan : selama pemanasan preparat tidak boleh kering & tidak
boleh mendidih
Semua jenis pewarnaan terdapat tahap pencucian dengan air (pergunakan air kran) , kecuali pada
pewarnaan Neisser
Staphylococcus sp. Gram positif, coccus, umumnya bergerombol seperti buah anggur
Streptococcus sp. Gram positif, coccus , umumnya berjajar membentuk rantai
Escherechia coli Gram negatif, batang / bacill kecil, umumnya sendiri-sendiri
Bacillus subtilis Gram positif , mempunyai spora ( tampak transparan pada pewarnaan Gram),
batang besar, umumnya berjajar membentuk rantai
Mycobacterium tuberculosis Batang panjang kurus, Acid Fast / Tahan Asam, umumnya
bergerombol atau sendiri - sendiri
Mycobacterium leprae Batang panjang kurus, Acid Fast / Tahan Asam, umumnya bergerombol
membentuk formasi melingkar seperti potongan melintang cerutu (globi / globus) / sendiri – sendiri
Preparat yang ditemukan bakteri bentuk batang Tahan Asam disimpulkan sebagai BTA positif
4. Macam2 uji yg digunakan pada identifikasi bakteri (teori ada di buku praktikum)
1. Bentuk Kuman dan Sifat Gram
Sediaan dicat Gram untuk mengetahui bentuk dan sifat Gram kuman.
• Kuman Gram positif berwama biru tua/ungu karena tercat oleh crystal violet.
• Kuman Gram negatif berwarna merah karena tercat oleh safranin.
• Bentuk kuman bisa berupa batang lurus, batang bengkok, bulat (kokus), atau pleiomorfik
(ada berbagai bentuk kuman dalam satu sediaan).
2. Kebutuhan Oksigen
Sebagai langkah awal identifikasi kuman yang tidak diketahui, kuman ditanam pada dua lempeng
medium universal (misalnya blood agar plate) dan diinkubasikan pada suasana aerob dan
anaerob. Interpretasi hasilnya adalah sebagai berikut:
• Kuman tumbuh di plate aerob tetapi tidak tumbuh di plate anaerob kuman obligat aerob
• Kuman tumbuh di plate anaerob tetapi tidak tumbuh di plate aerob kuman obligat
anaerob
• Kuman tumbuh di kedua plate (aerob dan anaerob) kuman fakultatif anaerob
3. Uji Katalase
Uji ini mendeteksi adanya enzim katalase. Kuman yang memiliki enzim ini dapat mengubah
H202 (hidrogen peroksida) menjadi H 20 dan 02. Perlu diketahui bahwa enzim katalase terdapat
dalam sel darah merah. Oleh karena itu, berhati-hatilah dalam mengambil koloni dari lempeng
agar darah supaya tidak ada medium yang ikut terbawa.
Ada dua teknik untuk melakukan uji katalase. Cara pertama adalah dengan meneteskan H 202
3% ke dalam tabung yang berisi biakan cair kuman. Cara kedua adalah dengan menaruh kuman
pada gelas objek dan meneteskan H202 3% ke atasnya. Metode pertama (dengan tabung) lebih
aman secara teknis. Pada waktu gelembung gas terbentuk dan memecah, sebenarnya terbentuk
aerosol yang tidak tampak oleh mata telanjang, dan kuman yang diperiksa akan ikut terhambur
ke udara dalam aerosol tersebut. Aerosol ini lebih mudah terhambur pada teknik yang
menggunakan gelas objek.
Interpretasi hasil uji katalase adalah sama untuk kedua metode tersebut:
• Katalase positif timbul gas seketika.
• Katalase negatif tidak timbul gas, atau baru timbul setelah 20-30 detik.
4. Hemolisis
Kuman mengadakan hemolisis untuk memperoleh nutrisi (misalnya Fe) dari hemoglobin.
Adanya hemolisis ditandai oleh perubahan warna medium di sekitar koloni.
• Hemolisis alfa degradasi hemoglobin tidak sempurna terbentuk wama kehijauan di
sekitar koloni. Hemolisis ini lebih nyata pada chocolate agar daripada blood agar, karena
chocolate agar mengandung eritrosit yang sudah di-lisis-kan sehingga hemoglobinnya keluar
(ini yang menyebabkan warna coklat).
• Hemolisis beta degradasi total hemoglobin wama medium menjadi hilang di sekitar
koloni, terbentuk daerah jernih tak berwarna. Hemolisis ini lebih nyata pada blood agar.
• Hemolisis gamma tidak terjadi hemolisis tidak terjadi perlu bahan wama medium
di sekitar koloni.
5. Uji Koagulase
Uji ini mendeteksi adanya enzim koagulase yang berfungsi menggumpalkan plasma yang
ada di sekitar kuman (untuk apa?). Ada dua teknik untuk melakukan uji koagulase:
a. Dengan gelas objek
1. Bagilah gelas objek menjadi dua daerah. Teteskan satu tetes air atau PZ steril
pada masing-masing daerah tersebut.
2. Ambillah koloni kuman yang akan diperiksa dan buatlah suspensi kuman pada
kedua daerah itu.
3. Tambahkan satu tetes plasma pada satµ suspensi, aduk rata. Tambahkan satu tetes air
atau PZ steril pada suspensi satunya, aduk fata.
4. Miringkan gelas objek ke sana ke mari. Amatilah ada/tidaknya koagulasi pada suspensi.
5. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya koagulasi suspensi dalam 10-15 detik
setelah penambahan plasma. Suspensi yang tidak diberi plasma harus tetap tampak
keruh secara merata. Jika suspensi yang tidak diberi kuman juga menunjukkan
koagulasi, maka hasil uji ini tidak dapat diinterpretasikan.
6. Hasil yang negatif perlu dikonfirmasikan dengan uji koagulase dengan tabung.
b. Dengan tabung
1. Siapkan 0,5 ml plasma dalam tabung reaksi.
2. Ambillah koloni kuman yang akan diperiksa dan buatlah suspensi dalam plasma
tersebut.
3. lnkubasikan tabung pada suhu 35°C selama empat jam.
4. Amatilah ada/tidaknya koagulasi dengan cara memiringkan tabung perlahan-lahan.
JANGAN mengocok atau memiringkan tabung dengan kasar, karena hal ini dapat
menghancurkan koagulasi yang sudah terbentuk.
5. Jika tampak ada koagulasi, maka hasilnya dilaporkan positif. Jika tidak tampak ada
koagulasi setelah inkubasi selama empat jam , maka tinggalkan tabung pada suhu
kamar selama 18 jam dan periksa kembali. Jika masih tidak ada koagulasi, hasilnya
dinyatakan negatif.
lnterpretasi hasil:
• Koagulase positif terjadi koagulasi (penggumpalan).
• Koagulase negatif tidak terjadi koagulasi.
6. Uji Kepekaan Antibiotika
Kepekaan terhadap antibiotika diuji dengan metode difusi cakram (Kirby-Bauer). Mula-mula
dibuat suspensi kuman yang diperiksa dalam Mueller-Hinton Broth dengan kekeruhan 0,5
McFarland . Suspensi ini digoreskan secara merata pada permukaan Mueller-Hinton Agar Plate
dan ditempeli cakram antibiotika yang diujikan. Setelah inkubasi secara aerob pada 37°C selama
16-18 jam, hasil biakan dibaca sebagai berikut:
• Kuman yang sensitif terhadap antibiotika yang diujikan akan menunjukkan zona hambatan
pertumbuhan kuman, yaitu daerah yang tidak ditumbuhi kuman di sekitar cakram
antibiotika.
• Kuman yang resisten terhadap antibiotika yang diujikan tidak menunjukkan zona hambatan
pertumbuhan kuman, sehingga koloni kuman tampak tumbuh sampai ke tepi cakram
antibiotika.
7. Uji Oksidase
Uji ini mendeteksi adanya enzim sitokrom oksidase. Dalam uji ini digunakan reagen tetra-
metil-p-fenilen-diamin di-hidro-klorida. Reagen ini berubah warna menjadi biru gelap jika
bereaksi dengan enzim sitokrom oksidase.
Ada dua teknik untuk melakukan uji oksidase. Cara pertama adalah dengan meneteskan 2-3
tetes reagen pada koloni yang dicurigai pada lempeng agar. Cara kedua adalah dengan
membasahi secarik kertas saring dengan reagen, lalu mengambil koloni yang dicurigai
dan mengusapkannya pada kertas saring tersebut. Uji oksidase dengan cara kedua
(kertas saring) lebih disukai karena reagen uji oksidase bersifat toksik dan akan
membunuh kuman yang diuji.
Jika reagen dituangkan pada lempeng agar, sejumlah besar koloni bisa mati sehingga tidak
bisa diperiksa lagi.
Uji oksidase tidak boleh dilakukan dengan menggunakan ose yang terbuat dari stainless
steel atau nikhrom karena dapat memberikan hasil positif palsu.
Interpretasi hasil uji oksidase adalah sama untuk kedua metode tersebut:
• Oksidase positif timbul warna biru tua dalam sepuluh detik.
• Oksidase negatif tidak timbul warna biru tua.
• Jika warna biru tua baru muncul setelah 10-60 detik, pemeriksaan ini harus diulangi.
8. Motilitas
Kuman ditanam pada medium semisolid yang mengandung agar dalam konseotrasi rendah (lihat
halaman 11). Hasil biakan dibaca sebagai berikut:
• Kuman yang motil menunjukkan pertumbuhan keluar dari garis penanaman, kadang-kadang
sampai membentuk kekeruhan di seluruh bagian medium.
• Kuman yang non-motil hanya tumbuh pada garis penanaman. dan medium di sekitar garis
tersebut tetap tampak jernih.
9. Uji Indol
Kuman ditanam dalam broth yang mengandung asam amino tryptophan. Setelah diinkubasikan,
kedalam biakan diteteskan reageo Ehrlich atau reageo Kovac.
• Indol positif terbentuk cincin merah di permukaan biakan .
• lndol negatif tidak terbentuk cincin merah di permukaan biakan .