guntur

Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi

dan Isolasi(Elusi) Fragmen DNA Plasmid
dari Gel Agarose
Tahun 1960, seorang ahli genetika bernama Warner Arber dan Hamilton Smith menemukan sebuah
enzim yang dapat digunakan untuk memotong DNA utas ganda. Enzim tersenut sekarang dikenal
dengan enzim endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens
yang spesifik yang panjangnya antara 4 sampai dengan 6 pasang basa. Bagian pada DNA yang
dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi dinamakan sekuens pengenal. Sekuens pengenal
adalah suatu nukleotida(urutan basa) yang dikenali oleh enzim restriksi sebagai situs tempat
pemotongannya (Joung 2000).

Kerja enzim tersebut dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan memotong DNA (termasuk DNA
faga tertentu) yang asing bagi bakteri tersebut. Maksud dari kegiatan memotong DNA asing
tersebut tidak lain sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari
organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-
motong DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik- mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam
molekul DNA dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME. Selanjutnya enzim
tersebut akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Hasil pemotongan
enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end”
dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “sticky end”. Dengan
memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu molekul DNA(glick 1989).

Enzim restriksi yang biasa digunakan sekarang adalah enzim EcoR1 yang telah diisolasi oleh
Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Eschericia coli. Enzim EcoR1 ini memutus/ memotong
DNA pada bagian urutan basa GAATTC (sekuens pengenal bagi Enzim ecoR1 adalah GAATTC).
Enzim ini memotong tidak pada sembarang tempat tapi diantara basa G dan A(Guanin dan Adenin)
( Joung 2000)

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari
campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Fragmen tersebut berfungsi untuk pelacak gen DNA
lain dan bisa untuk divangkokkan ke fragmen DNA yang lain. Kegiatan untuk mendapatkan fragmen
murni tersebut dapat melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang
ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi, kemudian
dilanjutkan dengan elektroforesis pada gel. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang
akan diisolasi dan apabila telah ditemukan gel yang mengandung fragmen tersebut dipotong.
Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada
membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium
Dodesil Sulfat (George 2001)

Percobaan dengan isolasi fragmen DNA plasmid  diperoleh hasil yaitu tidak terdapat DNA yang
tumbuh ini lebih dikarenakan pada saat pengmbilan DNAny.hanya sedikit dan bahkan tidak ada
DNA yang terbawa, dan saat penyaringan oleh nylon hybond. Percobaan dengan pemotongan DNA
oleh enzim restriksi diperoleh dua DNA yang terpisah yang menunjukan keberhasilan pada proses
pemotongan. atau tidak sesuai.

Percobaan ini menggunakan DNA dari bakteri Eschericia coli dan enzim restriksi berupa EcoR1.
Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung
tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau
“sticky end”. Dengan memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu
molekul DNA.

Percobaan ini menggunakan beberapa larutan yaitu NaOAC, etanol, TAE dan H 2O. larutan NaOAC
dan Etanol iniberfungsi untuk pemurni DNA. H2O berfungsi sebagai larutan pelarut. Enzim restriksi
adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Seperti diketahui, di
dalam Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang berperan dalam proses rekombinasi DNA,
yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua
molekul DNA dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi/diambil dari DNA dengan memotong
sugar–phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur dan
dikombinasi (George 2001).
Daftar pustaka

George SP. 2001. Molecular and Biochemical Aspects of Extremophilic Actinomycete     [Thesis].
India: Division of Biochemical Sciences National Chemical Laboratory Pune

Glick BR. 1989. Molecular Biotechnology Principles and Application of Recombinant

DNA. Washington: ASM Press
Joung J. 2000. “A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-
protein interactions”. Proc Natl Acad Sci USA 13:7382–7387