Makalah Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)

BAB I

 PENDAHULUAN

   1.1             Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan
antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau
zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903
menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun.
Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke
bagian bawah kolom

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan
antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan
yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang
stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin
suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat
golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern,  baru lengkap bila disebut kromatografi cairan kinerja
tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik  merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan
dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya
metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak
kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok
karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada
tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil
(1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-1).
Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada
dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak
mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik

1.2 Rumusan Masalah

1.    Pengertian HPLC
2.    Jenis- jenis HPLC

3.    Instrument HPLC

4.    Prinsip kerja HPLC

5.    Aplikasi HPLC

6.    Manfaat Penggunaan HPLC

7.    Kelebihan dan Kekurangan HPLC

8.   Penggunaan alat

9.   Analisa data

10. preparasi sampel

1.3 Tujuan

   a.   Mengetahui Pengertian HPLC

   b.   Mengetahui Jenis- jenis HPLC

   c.   Mengetahui Instrument HPLC

   d.   Mengetahui Prinsip kerja HPLC

   e.   Mengetahui Aplikasi HPLC

   f.    Mengetahui Manfaat Penggunaan HPLC

   g.   Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC

   h.   Mengetahui cara pengoperasian alat

   i.    Mengetahui cara pengolahan data

BAB II

PEMBAHASAN

   A.    PENGERTIAN

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana fase
geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.
Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit
dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang
dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang
cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya
yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang
dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak
dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan
adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem
kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan untuk
menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun
pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan
atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan
KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi lainnya, antara
lain :

a) Cepat :: waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang  uncomplicated  waktu analisis kurang dari 5 menit bisa
dicapai.

b) Resolusi tinggi :: berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT karena pengaruh
yang besar dari fase diam dan fase geraknya.

c) Sensitivitas detektor :: detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi
kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor
fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram).

d) kolom dapat digunakan kembali :: berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat
digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sehingga satu
kolom dapat digunakan berulang kali untuk berbagai jenis sampel.

e) Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah :: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena terurai oleh suhu  tinggi atau volatilitasnya rendah dan dapat dianalisis secara KCKT.

f) Mekanisme pemisahan lebih variatif :: banyaknya pilihan fase gerak dan fase diam yang digunakan
serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase gerak memungkinkan terjadinya
pemisahan dengan berbagai mekanisme.
g) Mudah rekoveri sampel :: umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga komponen sampel tersebut dapat
dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor.

Namun, jika dibandingkan dengan kromatografi lapis tipis kinerja tinggi, KCKT memiliki beberapa
kelemahan, yaitu :

1. Tidak dapat menganalisis lebih dari satu jenis sampel sekaligus

2. Kromatogram tidak dapat disimpan sebagai dokumen otentik

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam analisis farmasi
yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya
adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu
tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan
KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan
pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral
yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif.

Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode
ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang
memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1.                  Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

2.                  Analisis ketidakmurnian (impurities)

3.                  Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)

4.                  Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion

5.                  Isolasi dan pemurnian senyawa

6.                  Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip

7.                  Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

   B.     Jenis- Jenis HPLC

          Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar
dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding
dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi
solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan
berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya
solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-
polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer.
Untuk solut yang bersifat asam lemah  atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH
fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies
yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan
terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase
gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan
menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh
penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada
resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan
mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup
dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus
(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang
jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium,
dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar
tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti
tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase
diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam
interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

    C.    Instrument HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan
suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat
dilihat pada gambar di bawah ini :

1 . Wadah fase gerak (Reservoir)

          Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung
fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu
detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.

     Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi
sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat
berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor
penentu keberhasilan proses pemisahan.

      Persyaratan fase gerak HPLC:

1.    Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.

2.    Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatografi.

3.    Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.

4.    Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

5.    Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).

6.    Sesuai dengan detector.

  Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a)    HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar.
Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel
silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.

b)   HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak polar.
Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.

     Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’  pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan
dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

2. Pompa
          Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

      Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:

    a)      Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan
pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya
ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di
ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. 

     b)      Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada
tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

     c)      Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas
pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta
kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari
material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau
manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel
volume (misalnya 20 – 500 μL).
      Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a)   Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak
dipengaruhi

b)   Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi
Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c)    Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10
μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada
kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

      Syarat- syarat injektor yang baik :

·                     Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin

·                     Mudah digunakan

·                     Keberulangan tinggi

Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

4. Kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Perbandingan kedua
kolom dapat dilihat di bawah ini :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor

Tabung Stainless steel Stainless steel

 kolom Panjang 3,10,15,20 dan 25 cm Panjang 25 dan 50 cm

Diameter luar 0,25 inci Diameter luar 0,25 inci

Diameter dalam 4,6 cm Diameter dalam 1 atau 2 mm

Fase diam Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi secara
kimiawi (bonded phase), atau
polimer-polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter
partikel 3,5 atau 10µm dengan
kisaran sempit.
Porous, silika ukuran kecil, silika yang
dimodofikasi secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-polimer
stiren/divinil benzen.Rata-rata
diameter partikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.

Tekanan 500-3000 psi 1000-5000 psi

operasional
(35-215 bar (70-350 bar)

Fase gerak Hidrokarbon+pelarut Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau

terklorinasi atau alkohol untuk
fase normal. Untuk fase
terbalik (reversed phase)
digunakan metanol atau
asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3
ml/menit
alkohol untuk fase normal. Untuk fase
terbalik (reversed phase) digunakan
metanol atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir 10-100
µl/menit.Modifikasi instrumen
Sistem penghantaran pelarut yang
mampu memberikan kontrol aliran di
bawah 10µl/menit.Katup injeksi
sampekl bervolume kecil;sel detektor
bervolume kecil.

Kinerja Efisiensi meningkat dengan Sangat efisiensi dan sensitif, akan

bekurannya ukuran partikel tetapi lambat,konsumsi fase gerak
fase diam, akan tetapi umur hanya ¼ dari kolom konvensional.
kolom dengan ukuran partikel
3 µm lebih pendek.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:

  Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

  Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa.
  Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan
kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

  Fase Diam

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak
dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi
dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan
gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan
sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan.

5. Detektor

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a.    mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;

b.    mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil;

c.    stabil dalam pengopersiannya;

d.   mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;

e.    signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas         (kisaran dinamis linier);

f.     tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas suhu

 Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir

Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah

Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah

Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah

Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C

Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C

Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada

massa

elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

   D.    Prinsip Kerja HPLC

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya

terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling
membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya
untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum
yang puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi <
golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.

HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT
yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain
yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai
spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat
tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam
sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang
digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa
carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk
tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk
analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh
pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi.
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat
peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan
banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan
dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC
sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

   E.     Kelebihan Dan Kekurangan Metode Analisis Dengan HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu
suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak
kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya.

Kelebihan itu antara lain:

   a . Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran

   b . Mudah melaksanakannya

   c . Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

   d . Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi yang baik

   e . Dapat digunakan bermacam- macam detektor

   f  . Kolom dapat digunakan kembali

  g . Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.

  h . Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan
pada suhu kamar.

   i . Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.

  j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya sangat tinggi
seperti polimer

   k . Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas

l.  Banyak pilihan fasa geraknya Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis
yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu
analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai 

  m. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif
dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan
terutama dicapai hanya dengan rasa diam.

  n. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada HPLC
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

  o. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam HPLC dapat mendeteksi
kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-macam zat.

  p. Detektor- detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-
12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll, dapat
juga digunakan dalam HPLC

  q. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom HPLC
dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan

   r. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe
eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

  s. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC tidak menyebabkan
destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel
tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.

  t. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.

    
Sedangkan kekurangannya adalah:

a.       Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

b.      Hanya bisa digunakan untuk asam organic

c.       Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi

d.      Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

   F.     Teknik Pengoperasian Alat

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa
yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan
kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut
sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,
waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran    partikel)

 Komposisi yang tepat dari pelarut

 Temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi
sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang
mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda
menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang
berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui
berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar
UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat
bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang
dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya
menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang
salah dari pelarut.

   G.    Analisis Kromatogram/ interpretasi data

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda
mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu
mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur
senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang
dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui
jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut,
tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang
dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini
dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna
hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan
sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu
berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam
sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat
mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.
Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini
mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi
sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y
yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

   H.    Contoh Analisa

      Penerapan HPLC Dalam Analisis Senyawa (Obat) Dalam Campuran

HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil
samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan
metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan
spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang
baik sulit diperoleh.

Penggunaan KCKT dalam bidang farmasi

Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat baik
dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati .Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang
memberikan sensitifitas  dan spesifitas yang tinggi. Berikut ini adalah beberapa contoh penggunaan
KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi :

Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak Detektor

Fluoresen
Asetonitril-asam
Adriamisin (serum) C18 fosfat 0,01 N ph EK : 465 nm
2,3 (50:50)
EM : 580 nm

Aktinomisin (Serbuk) C18 CH3CN-H2O (1:1) Elektrometer

KH2PO4 0,05M;
Allopurinol (tablet) C18; 4 x 30 cm UV 254 nm
1,5 ml/menit

1. Parasetamol:

  Nama Kimia                 : 4- Hidroksiasetanilida

  Rumus Molekul            : C8H9NO2

  Berat Molekul              : 151,16

  Pemerian                      : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.

  Kelarutan                     : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut
dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-amino fenol

yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan pengganti yang baik untuk
analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan saluran cerna dan pada mereka
dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak menguntungkan. Asetaminofen merupakan
analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan
analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti
methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi
tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini
tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol
digunakan sebagai analgesic dan antipiretik.

Pengujian kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya HPLC
memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat yang
sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan injektor khusus /
syringe yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini dilakukan agar tidak terjadi
penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari pelarutnya. Sampel didorong cepat saat
melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen
pada sampel dipisahkan berdasarkan pada perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa
diamnya. Solut yang interaksinya kurang kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut
lainnya. Komponen akan keluar dari kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh
detektor. Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa
organik yang dapat menyerap sinar UV. Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm
dengan mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm.
Teknik yang dilakukan kali ini merupakan “reverse phase” atau fasa terbalik karena teknik ini
menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non-
polar. Penggunaan fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel
uji tidak bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC
tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan
sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian parasetamol dalam obat,
waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini
menghasilkan suatu citra berupa kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas
komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan kromatogram
ini berupa grafik lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit
melebar dan tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom
HPLC, difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu
sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer massa
disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter pemisahan
dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner kolom C-18 yaitu
15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas. Parameter- parameter ini
dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan kromatogram seperti pelebaran pada puncak.
Adanya pelebaran puncak pada kromatogram mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang
belum terpisahkan dalam kolom. Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel akan
semakin sulit dipisahkan secara efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat
dihitung kadar parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari
sampel obat sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa
rata-rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar
615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar 615,98
mg per tabletnya.

2. Kafein

Rumus struktur :

  Nama Kimia                 : 1,3,7-Trimetil xantin

  Rumus Molekul            : C8H10N4O2

  Berat Molekul              : 194,19

  Pemerian                      : serbuk putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal,
tidak berbau, rasa pahit.

  Kelarutan                     : Agak sukar larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform,
sukar larut dalam eter. (Depkes RI, 1995).

Dalam penetapan kandungan kafein digunakan sampel berupa minuman berkafein. HPLC yang
digunakan adalh jenis HPLC Series 200 dengan detector 275 nm Perkin Elmer, Kolom : Supelcosil LC :
18, ( 25 cm X 4,6mm, 5 μm ). Menggunakan asam asetat 70% dan methanol 30% sebagai fasa gerak.
Proses pengerjaan terdiri dari 2 tahap, yaitu tahap preparasi dan tahap injection ke HPLC.

ANALISIS KUANTITATIF

Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak

Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa
lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar / konsentrasi zat yang
menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur lebar atau tinggi Puncak, yang
kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau tinggi Puncak diekspresikan sebagai
suatu persentase dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan komposisi
dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel berikut:

Peak area
No
Kafein standar Kafein dalam sampel

1 2601417,40 2216635,31

Berdasarkan data table diatas, maka kadar kafein dalam sampel ( teh poci ) dapat dianalisis dengan
mengunakan persamaan :

  Cx     = Ax / Ap X Cp
= x 200 ppm

= 170,42 ppm

Maka dalam 1 mL sampel yang diuji terdapat 0,17042 mg kafein.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:

Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen muncul
sebagai suatu puncak yang terpisah pada kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi,
atau ditahan di dalam kolom, atau, terelusi tanpa terdeteksi. Kita harus mengasumsi bahwa kita
memperoleh respons detektor yang sama untuk setiap komponen

Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

Kafein berkhasiat menstimulasi SSP, dengan efek menghilangkan rasa letih, lapar dan mengantuk,
juga daya konsentrasi dan kecepatan reaksi dipertinggi, prestasi otak dan suasana jiwa diperbaiki.
Kofein juga memperkuat kontraksi jantung, vasodilatasi perifer dan diuretis. Kofein digunakan
sebagai penyegar. Zat ini sering dikombinasikan dengan Parasetamol atau asetosal untuk
memperkuat efek analgetisnya.

Kafein dosis sedang menyebabkan insomnia, ansietas dan agitasi. Dosis tinggi diperlukan untuk
memperlihatkan toksisitas berupa muntah dan konvulsi. Dosis letal sekitar 10 g (kira-kira 100 cangkir
kopi) yang menimbulkan aritmia jantung. Kematian karena kafein sangat tidak mungkin. Letargi,
iritabel dan sakit kepala terjadi pada pengguna yang secara rutin minumg lebih dari 600 mg kopi per
hari ( sekitar 6 cangkir kopi per hari) dan mendadak berhenti. (Mycek, 2001).

Preparasi Sampel

·         Sampel harus dalam bentuk larutan

·         Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak boleh
terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.

Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.

Preaparasi Fase Gerak

·         Fase Gerak ( eluen ) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC. Untuk air
digunakan akuabidest.

·         Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore kemudian diawagaskan ( di digest )
dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.

·         Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan untuk menghindari
adanya gelembung pada selang penghubung.

·         Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di gunakan.
              BAB III

PENUTUP

 Kesimpulan

a. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector, pengolahan
data.

b. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa
berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering
digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping
proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah
menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

c. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan
pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak
tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena
detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan
instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan
harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus
mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal
sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya.

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press.
Surabaya.

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran. Bandung.

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham, 1994, Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik,
Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 2008, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta.

Putra,Effendy D. L., 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan Farmasi
Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara :3

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan.  Kanisius. Yogyakarta

http://ruangdiskusiapoteker.blogspot.co.id/2012/06/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

http://paramita-kromatografi.blogspot.co.id/2012/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt_6.html