NAMA : ARTA DIAN FITRAH

KELAS : XII AK B

ANALISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF

KARBOHIDRAT

I. Analisis Kualitatif
Karbohidrat dengan zat tertentu akan menghasilkan warna tertentu yg dapat dgunakan
untuk analisis kualitatif. Beberapa reaksi yang lebih spesifik dapat membedakan golongan
karbohidrat. Banyak cara untuk mengetahui atau mengidentifikasi karbohidrat dalam suatu
bahan alam, diantaranya adalah sebagai berikut:

1. Uji Molisch
Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat.
Dehidrasi heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan dehidrasi
pentose menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang
merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam
pereaksi molish.Uji molisch adalah uji kimia kualitatif untuk mengetahui adanya
karbohidrat. Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan
memberikan hasil positif. Sampel yang diuji dicampur dengan reagent Molisch, yaitu α-
naphthol yang terlarut dalam etanol 95%. Setelah pencampuran atau homogenisasi,
H2SO4 pekat perlahan-lahan dituangkan melalui dinding tabung reaksi agar tidak sampai
bercampur dengan larutan atau hanya membentuk lapisan. H2SO4 pekat (dapat digantikan
asam kuat lainnya) berfungsi untuk menghidrolisis ikatan pada sakarida untuk
menghasilkan furfural. Furfural ini kemudian bereaksi dengan reagent Molisch, α
-naphthol membentuk cincin yang berwarna ungu.
Reaksi :
.

KH (pentose) + H2SO4 pekat → furfural → + α-naftol → warna ungu

KH (heksosa) + H2SO4 pekat → HM-furfural → + α-naftol → warna ungu
Kedua macam reaksi diatas berlaku umum, baik untuk aldosa (-CHO) maupun
karbohidrat kelompok ketosa (C=O).

Prosedur kerja :
1. Masukkan 15 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering
danbersih
2. Tambahkan 3 tetes pereaksi Molisch. Campurkan dengan baik.
3. Miringkan tabung rekasi, lalu alirkan dengan hati-hati 1 mL H2SO4 pekat melalui
dinding tabung supaya tidak bercampur.
4. Perhatikan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan
yangmenandakan reaksi positif karbohidrat.
5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.
6. Lakukan tes terhadap larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa, maltosa,
arabinosa,larutan 1% amilum dan selulosa (kapas) yang disuspensikan dalam air.
2. Uji Benedict
Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat)
pereduksi (yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas) . Gula pereduksi meliputi
semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan maltosa.
Uji benedict berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh gugus aldehid atau keton bebas
dalam suasana alkalis, biasanya ditambahkan zat pengompleks seperti sitrat atau tatrat
untuk mencegah terjadinya pengendapan CuCO3.
Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan merah bata, kadang disertai dengan
larutan yang berwarna hijau, merah, atau orange. Pada uji Benedict, pereaksi ini akan
bereaksi dengan gugus aldehid, kecuali aldehid dalam gugus aromatik, dan alpha
hidroksi keton. Oleh karena itu, meskipun fruktosa bukanlah gula pereduksi, namun
karena memiliki gugus alpha hidroksi keton, maka fruktosa akan berubah menjadi
glukosa dan mannosa dalam suasana basa dan memberikan hasil positif dengan pereaksi
benedict. Untuk mengetahui adanya monosakarida dan disakarida pereduksi dalam
makanan, sample makanan dilarutkan dalam air, dan ditambahkan sedikit pereaksi
benedict. Dipanaskan dalam waterbath selama 4 - 10 menit. Selama proses ini larutan
akan berubah warna menjadi biru (tanpa adanya glukosa), hijau, kuning, orange, merah
dan merah bata atau coklat (kandungan glukosa tinggi). Sukrosa (gula pasir) tidak
terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Sukrosa mengandung dua monosakrida (fruktosa dan
glukosa) yang terikat melalui ikatan glikosidik sedemikian rupa sehingga tidak
mengandung gugus aldehid bebas dan alpha hidroksi keton. Sukrosa juga tidak bersifat
pereduksi.
Pengamatan yang dilakukan dalam uji Benedict ini dapat dilakukan dengan
mengamati perubahan warna dan terjadinya endapan. Warna larutan dapat terlihat
bermacam-macam tergantung dari konsentrasi karbohidrat yangg dipakai, larutan dapat
berwarna hijau, hijau kebiruan dan kuning. Pada uji Benedict terhadap glukosa dan
fruktosa larutan berwarna hijau kebiruan dan terdapat endapan merah bata di dalamnya
yang menandakan pengujian positif, sedangkan pada maltosa dan laktosa larutan
memiliki warna hijau kebiruan tanpa endapan merah batahal ini menunjukan bahwa
pengujian positif terdapat gula di dalamnya, tetapi pada pengujian terhadap sukrosa dan
pati warna yang terlihat adalah biru menandakan bahwa hasil uji negatif
mengindikasikan bahwa sukrosa dan pati tidak memiliki gula pereduksi yang dapat
mereduksi reagen benedict. Uji Benedict dapat dilakukan pada urine untuk mengetahui
kandungan glukosa. Urine yang mengandung glukosa dapat menjadi tanda adanya
penyakit diabetes. Sekali urine diketahui mengandung gula pereduksi, test lebih jauh
mesti dilakukan untuk memastikan jenis gula pereduksi apa yang terdapat dalam urine.
Hanya glukosa yang mengindikasikan penyakit diabetes. Berikut reaksi yang
berlangsung:
Reaksi:
R-COH + CuO → Cu2O (s) + R-COOH
Atau
KH + camp CuSO4, Na-Sitrat, Na2CO3 → Cu2O (endapan merah bata)
Pereaksi Benedict : Satu liter pereaksi Benedict dapat dibuat dengan menimbang
sebanyak 100 gram natrium karbonat anhydrous (Na2CO3), 173 gram natrium sitrat, dan
17,3 gram tembaga (II) sulfat pentahydrate, kemudian dilarutkan dengan akuadest
sebanyak 1 liter.
Prosedur kerja :
1. Masukkan 3 tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering
dan bersih
2. Tambahkan 2 mL pereaksi Benedict, kemudian dikocok.
3. Masukan kedalam penangas air selama 5 menit. Amati perubahan warna
endapannya.
4. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi
positif karbohidrat.
5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.
6. Lakukan percobaan ini dengan menggunakan larutan glukosa, galaktosa,
maltosa,fruktosa, laktosa, sukrosa dan larutan amilum.

3. Uji Barfoed
Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan jalan mengontrol
kondisi-kondisi percobaan, seperti pH dan waktu pemanasan. Pada analisa ini,
karbohidrat direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif
bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis. Uji Barfoed menggunakan reagen
Barfoed yang terdiri dari tembaga asetat dan asam asetat glacial sebagai pereaksi.
Diketahui bahwa disakarida merupakan agen pereduksi yang lemah, mereka tidak
membentuk ion kupri pada reagen Barfoed yang ada dalam keadaan asam, sedangkan
monosakarida merupakan agen pereduksi yang kuat dan mampu membentuk ion kupri
dalam reagen Barfoed dalam keadaan asam karena itu uji Barfoed ini digunakan untuk
membedakan disakarida pereduksi dengan monosakarida pereduksi dalam suatu sampel.
Pada proses pengujian, larutan dipanaskan, pemanasan terhadap sampel membantu
asamasetat glacial menghidrolisis disakarida menjadi monosakarida yang kemudian
akanmereduksi reagen, karena itu perbedaan waktu yang ada menjadi indikasi perbedaan
terhadap monosakarida pereduksi dan disakarida pereduksi. Monosakarida pereduksi
ditandai dengan terjadinya endapan merah bata kupro oksida (Cu 2O) pada saat di
panaskan dalam kurun waktu dua sampai tiga menit sedangkan disakarida pereduksi di
tandai dengan pembentukan endapan merah bata kupro oksida (Cu2O) dalam kurun
waktu sepuluh sampai dua belas menit.
KH + camp CuSO4 dan CH3COOH → Cu2O endapan merah bata
Prosedur kerja :
1. Masukkan 1 mL larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang masih kering
dan bersih.
2. Tambahkan 1 mL pereaksi Barfoed, kemudian dikocok.
3. Masukan kedalam penangas air selama 3 menit.
4. Kemudian didinginkan dalam air mengalir.
5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15 menit
sampai terlihat adanya reduksi.
6. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya
7. Lakukan percobaan ini dengan larutan glukosa, galaktosa, laktosa, sukrosa dan
maltosa.

4. Uji Seliwanoff
Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa (karbohidrat yang
mengandung gugus keton). Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl panas
menjadi asam levulinat dan 4-hidroksilmetilfurfural. Jika dipanaskan karbohidrat yang
mengandung gugus keton akan menghasikan warna merah pada larutannya. Disakarida
sukrosa yang mudah dihidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa memberi reaksi positif
dengan uji Seliwanoff. Glukosa dan karbohidrat lain dalam jumlah banyak dapat juga
memberi warna yang sama. Pada pengujian dilakukan pemanasan pada larutan,
pemanasan akan membantu proses hidrolisis disakarida yang akan menghasilkan
monosakarida ketosa, dan kemudian member warna. Keberadaan HCl dalam reagen pada
saat fruktosa yang berada dalam golongan ketosa bereaksi dengannya akan menghasilkan
warna merah cherry dengan struktur kimia yang kompleks. Sebaliknya golongan
disakarida seperti maltosa dan laktosa tidak bereaksi (negatif) pada saat mereka
dihidrolisis menjadi monosakarida aldosa, dengan kata lain aldosa tidak bereaksi dalam
uji Seliwanoff ini. Pada dasarnya uji ini memiliki dua tahapan penting yang harus
dilewati pada pendidihan,yaitu proses dehidrasi yang dialami fruktosa oleh reagen
Seliwanoff yang menghasilkan pembentukan hidroksi metil furfural dan kondensasi
hidroksi metil furfural dengan resorcinol sehingga membentuk senyawa kompleks
berwarna merah cherry. Hasil yang didapat pada uji ini dapat diidentifikasi dari warna
larutan yang berubah pada saat bereaksi. Jika sampel berubah menjadi warna merah
cherry, itu menunjukan bahwa di dalam sampel terdapat ketosa, tetapi jika sampel
berwarna biru kehijauan atau peach menunjukan bahwa sampel memiliki aldosa.
KH (ketosa) + H2SO4 → furfural → + resorsinol → warna merah.
KH (aldosa) + H2SO4 → furfural → + resorsinol → negatif
Prosedur kerja :
1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah
diisi 2 mL pereaksi Seliwanoff.
2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna
yangterjadi.
3. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya
4. Lakukan percobaan ini dengan larutan fruktosa, glukosa, dan sukrosa.
5. Terjadinya perubahan warna merah dan endapan menunjukan reaksi positif untuk
ketosa, bila endapan dilarutkan dalam alcohol terjadi larutan berwarna merah.

5. Uji Fehling
Prinsip reaksi ini yaitu menggunakan gugus aldehid pada gula untuk mereduksi
senyawa Cu2SO4 menjadi Cu2O (enpadan berwarna merah bata) setelah dipanaskan
pada suasana basa (Benedict dan Fehling) atau asam (Barfoed) dengan ditambahkan agen
pengikat (chelating agent) seperti Na-sitrat dan K-Na-tatrat.

6. Uji Tollens
Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan
heksosa. Aldehidadapat mereduksi pereaksi Tollens sehingga membebaskan unsur perak
(Ag).
Pereaksi tollens, pengoksidasi ringan yang digunakan dalam uji ini, adalah larutan basa
dari perak nitrat. Larutannya jernih dan tidak berwarna. Untuk mencegah pengendapan
ion perak sebagai oksida pada suhu tinggi, maka ditambahkan beberapa tetes larutan
amonia. Amonia membentuk kompleks larut air dengan ion perak. Pereaksi Tollens
mengandung ion diammin perak(I), [Ag(NH3)2]+. Ion ini dibuat dari larutan perak (I)
nitrat. Caranya dengan memasukkan setetes larutan natrium hidroksida ke dalam larutan
perak (I) nitrat yang menghasilkan sebuah endapan perak (I) oksida, dan selanjutnya
tambahkan larutan amonia encer secukupnya untuk melarutkan ulang endapan tersebut.
 
Pereaksi Tollens sering disebut sebagai perak amoniakal. Endapan perak pada uji ini
akan menempel pada tabung reaksi yang akn menjadi cermin perak. Oleh karena itu
Pereaksi Tollens sering juga disebut pereaksi cermin perak.
Prosedur kerja :
1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah
diisi2 mL pereaksi Tollens.
2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna
yangterjadi.
3. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya
4. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, glukosa dan gummi arabikum.

7. Uji Osazon
Pada uji Osazon, yang mendasarinya adalah pemanasan karbohidrat yang memiliki
gugus aldehida atau keton bersama fenilhidrazin berlebihan akan membentuk hidrazon
atau osazon. Osazon yang terbentuk mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang
spesifik. Osazon dari disakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila
didinginkan, namun sukrosa tidak membentuk osazon karena gugus aldehida dan keton
yang terikat pada monomernya sudah tidak bebas, sebaliknya osazon monosakarida tidak
larut dalam air mendidih. Beberapa larutan uji menunjukkan reaksi positif dengan
membentuk kristal berwarna kuning yang disebut dengan osazon yaitu larutan fruktosa
dan galaktosa dan larutan lainnya tidak membentuk kristal osazon. Setelah diamati di
bawah mikroskop, bentuk kristal dari fruktosa adalah pentagonal sedangkan pada
galaktosa segi empat runcing.
Prosedur kerja :
1. Masukkan 5 mL larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi.
2. Masukkan campuran fenil hidrazon Na-asetat kering.
3. Kocok dan panaskan dalam penangas air selama 30 menit.
4. Dinginkan, kemudian diperiksa endapan yang terbentuk di bawah mikroskop.
5. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya.
6. Lakukan percobaan ini dengan larutan arabinosa, sukrosa, glukosa, fruktosa,
maltosa,dan galaktosa.

8. Uji Iodium
Karbohidrat dengan golongan polisakarida akan memberikan reaksi dengan larutan
iodium dan memberikan warna yang spesifik bergantung pada jenis karbohidratnya.
Analisa dengan iodin akn berwarna biru, amilopektin dengan iodin akan berwarna merah
violet, glikogen dengan iodin akan berwarna merah cokelat, begitu juga dengan dekstrin.
Uji Iodium Dilakukan untuk menentukan polisakarida. Larutan uji dicampurkan dengan
larutan iodium. Hasil positif ditandai dengan amilum dengan iodium berwarna biru, dan
dekstrin dengan iodium berwarna merah anggur.

KH (poilisakarida) + Iod (I2) →  warna spesifik (biru kehitaman)

Prosedur kerja :
 1. 2 ml larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau porselin tetes.
2. Kemudian ditambahkan dua tetes larutan iodium.
3. Kemudian warna spesifik yang tebentuk diamati.

9. Uji Fermentasi
Dalam ragi terdapat enzim-enzim yang dapat mencerna amilum sampai menjadi CO2
dan H2O, juga terdapat enzim sukrosa (invertase) maupun fruktokinase. Oleh karena
amilum, glukosa, fruktosa, maltosa, dan sukrosa dapat diragikan. Dalam ragi tidak
terdapat laktosa, maka laktosa tidak dapat dipecahkan. Hal ini dapat digunakan untuk
membedakan apakah gula dalam urin glukosa atau fruktosa. Enzim ragi pada umumnya
baik bekerja pada temperatur 37o C – 40o C.

II. Analisis Kuantitatif

Ada beberapa macam metode yang dapat kita gunakan untuk analisa kadar gula reduksi
secara kuantitatif yaitu :

1. Metode Fisika

Ada dua (2) macam, yaitu :

a. Berdasarkan indeks bias

Cara ini menggunakan alat yang dinamakan refraktometer, Refraktometer
adalah alat yang digunakan untuk mengukur kadar/ konsentrasi bahan terlarut.
Misalnya gula, garam, protein, dsb. Prinsip kerja dari refraktometer sesuai dengan
namanya adalah memanfaatkan refraksi cahaya. Refraktometer ditemukan oleh Dr.
Ernest Abbe seorang ilmuan dari German pada permulaan abad 20 (Anonim, 2010).
 Pengukurannya didasarkan atas prinsip bahwa cahaya yang masuk melalui prisma-
cahaya hanya bisa melewati bidang batas antara cairan dan prisma kerja dengan
suatu sudut yang terletak dalam batas-batas tertentu yang ditentukan oleh sudut
batas antara cairan dan alas.

yaitu dengan rumus :

X = [(A+B)C - BD)]
dimana :
X = % sukrosa atau gula yang diperoleh
A = berat larutan sampel (g)
B = berat larutan pengencer (g)
C = % sukrosa dalam camp A dan B dalam tabel
D = % sukrosa dalam pengencer B –

Cara Kerja:
 Refraktometer dibersihkan terlebih dahulu dengan tisu ke arah bawah
 Refraktometer ditetesi dengan aquadest atau larutan NaCl 5% pada bagian
prisma dan day light plate
 Refraktometer dibersihkan dengan kertas tissue sisa aquadest / NaCl yang
tertinggal
 Sampel cairan diteteskan pada prisma 1 – 3 tetes
 Skala kemudian dilihat ditempat yang bercahaya dan dibaca skalanya
 Kaca dan prisma dibilas dengan aquades / NaCl 5% serta dikeringkan dengan
tisu, dan
 Refraktometer disimpan di tempat kering

b. Berdasarkan rotasi optis

Cara ini digunakan berdasarkan sifat optis dari gula yang memiliki struktur
asimetrs (dapat memutar bidang polarisasi) sehingga dapat diukur menggunakan
alat yang dinamakan polarimeter atau polarimeter digital (dapat diketahui hasilnya
langsung) yang dinamakan sakarimeter. Menurut hokum Biot; “besarnya rotasi
optis tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan tebal cairan”
sehingga dapat dihitung menggunakan rumus :
[a] D20 = 100 AL x C
 [a] D20 = rotasi jenis pada suhu 20oC menggunakan
D = sinar kuning pada panjang gelombang 589 nm dari lampu Na
A = sudut putar yang diamati
C = kadar (dalam g/100 ml)
L = panjang tabung (dm) sehingga C = 100 AL x [a] D20

2. Metode Kimia
Metode ini didasarkan pada sifat mereduksi gula, seperti glukosa, galaktosa, dan
fruktosa (kecuali sukrosa karena tidak memiliki gugus aldehid). Fruktosa meskipun tidak
memiliki gugus aldehid, namun memiliki gugus alfa hidroksi keton, sehingga tetap dapat
bereaksi. Dalam metode kimia ini ada dua (2) macam cara yaitu :
a. Titrasi
Untuk cara yang pertama ini dapat melihat metode yang telah distandarisasi
oleh BSN yaitu pada SNI cara uji makanan dan minuman nomor SNI 01-2892-
1992.
b. Spektrofotometri
Adapun untuk cara yang kedua ini menggunakan prinsip reaksi reduksi
CuSO4 oleh gugus karbonil pada gula reduksi yang setelah dipanaskan terbentuk
endapan kupru oksida (Cu2O) kemudian ditambahkan Na-sitrat dan Na-tatrat serta
asam fosfomolibdat sehingga terbentuk suatu komplek senyawa berwarna biru
yang dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm.
c. Cara Luff Schoorl
Prinsipnya yaitu Monosakarida dioksidasi oleh CuO dari reagen Luff Schoorl
menjadi Cu2O.kemudian kelebihan CuO dari reagen luff Schoorl akan bereaksi
dengan KI suasana asam membentuk I2 yang akan bereaksi dengan cara dititrasi
dengan Na- tiosulfat dengan indikator amilum.
Cara Kerja:
1) Persiapan Sampel
Pada prosedur kerja dalam praktikum ini, sampel yang ingin dilakukan
pengujian telah tersedia sehingga dalam praktikum ini kami tidak
melakukan proses persiapan sampel.
2) Prosedur Kerja Analisa
Berikut prosedur kerja pengujiannya:
 Pipet sample sebanyak 5 ml ke dalam erlenmeyer kemudian tambahkan
 35 ml aquades dan 10 ml larutan luff.
 Panaskan sampai mendidih
 Dinginkan dalam wadah berisi air.
 Tambahkan 10 ml larutan KI 25% dan 17 ml H2SO4 6N perlahan-lahan
lewat dinding.
 Tambahkan 2 ml amilum, amati perubahan warna yang terjadi (biru tua).
 Titrasi dengan larutan Natrium tiosulfat 0,005N sampai warna biru tua
hilang.
 Catat volume titrasi.

3. Metode Nelson-Somogyi

Metode ini dapat digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi dengan
menggunakan pereaksi tembaga arseno molibdat. Kupri mula-mula direduksi menjadi
bentuk kupro dengan pemanasan larutan gula. Kupro yang terbentuk selanjutnya
dilarutkan dengan arseno molibdat menjadi molibdenum berwarna biru yang menunjukkan
ukuran konsentrasi gula dan membandingkannya dengan larutan standar sehingga
konsentrasi gula dalam sampel dapat ditentukan. Reaksi warna yang terbentuk dapat
menentukan konsentrasi gula dalam sampel dengan mengukur absorbansinya.
(Sudarmadji.S.1984)
Cara Kerja :
 Diambil 1 ml larutan sampel.
 Ditambahkan 1 ml reagen Nelson pada tiap-tiap tabung reaksi dan dipanaskan
dalam air mendidih selama 20 menit, kemudian didinginkan 5 menit dalam air
mengalir.
 Ditambahkan 1 ml reagen arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung reaksi, dikocok
sampai homogen dan larut sempurna.
 Ditambahkan 7 ml aquadest pada tiap-tiap tabung reaksi, kemudian dikocok.
 Ukur absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
 Kadar gula reduksi sampel ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva
standard.

4. Metode enzimatis

Untuk metode enzimatis ini, sangat tepat digunakan untuk penentuan kagar suatu
gula secara individual, disebabkan kerja enzim yang sangat spesifik. Contoh enzim yang
dapat digunakan ialah glukosa oksidase dan heksokinase Keduanya digunakan untuk
mengukur kadar glukosa.
Glukosa oksidase
D- Glukosa + O2 oleh glukosa oksidase à Asam glukonat dan H2O2
H2O2 + O-disianidin oleh enzim peroksidase à 2H2O + O-disianidin
teroksdasi yang berwarna cokelat (dapat diukur pada l 540 nm).

Heksokinase
D-Glukosa + ATP oleh heksokinase à Glukosa-6-Phospat +ADP
Glukosa-6-Phospat + NADP+ oleh glukosa-6-phospat dehidrogenase à Glukonat-6-
Phospat + NADPH + H+ Adanya NADPH yang dapat berpendar (memiliki gugus
kromofor) dapat diukur pada l 334 nm dimana jumlah NADPH yang terbentuk setara
dengan jumlah glukosa. Menggunakan enzim spesifik untuk karbohidrat yang akan
diuji. Contoh enzimnya yaitu glukosa oksidase dan heksokinase.

5. Metode Dinitrosalisilat (DNS)

Metode ini digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri.
Teknik ini hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi, misalnya glukosa. Glukosa
memiliki gugus aldehida, sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil. Gugus
aldehida yang dimiliki oleh glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi
gugus karboksil dan menghasilkan asam 3-amino-5-salisilat pada kondisi basa dengan
suhu 90-100oC. Senyawa ini dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm.
Cara membuat pereaksi DNS :
 Sebanyak 5 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 5 g NaOH 2 N dilarutkan dalam 100 mL
aquades (larutan A).
 Sebanyak 150 g natrium kalium tartarat dilarutkan dalam 200 mL aquades (larutan
B). Larutan A dan B dicampur, lalu ditera dalam labu takar dengan aquades hingga
volume akhirnya menjadi 500 mL, kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik
selama satu malam.
Cara kerja :
 Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 200, 400, 800,
1200, 1600, dan 2000 ppm.
  Masing-masing larutan diambil 1 mL, lalu tambahkan 3 mL pereaksi DNS.
 Kemudian, masing-masing larutan divorteks dan dipanaskan dalam air mendidih
selama 5 menit.
 Setelah dingin, masing-masing larutan diencerkan 5 kali dan divorteks kembali.
 Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm,
kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar.
 Pengukuran kadar gula pereduksi pada sampel dilakukan dengan cara mengambil 1
mL sampel kemudian ditambahkan 3 mL pereaksi DNS.
 Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai
pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

6. Metode Asam Fenol Sulfa

Metode ini disebut juga dengan metode TS (total sugar) yang digunakan untuk
mengukur total gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula
sederhana, oligosakarida, dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat
pekat yang akan menghasilkan warna jingga kekuningan yang stabil.
Cara Kerja:
 Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 100, 200, 300,
400, dan 500 ppm.
 Masukkan 0,5 mL dari masing-masing larutan ke dalam tabung yang terpisah,
kemudian rendam dalam air, lalu tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL H2SO4
pekat dengan hati-hati melalui dinding tabung.
 Biarkan selama 10 menit, lalu vorteks dan biarkan kembali selama 20 menit.
 Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm,
kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar.
 Pengukuran sampel dilakukan dengan cara memasukkan 0,5 mL larutan sampel ke
dalam tabung, lalu rendam dalam air, kemudian tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan
2,5 mL H2SO4 secara hati-hati.
 Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai
pengukuran yang diperoleh diplot padakurva standar.