SPEKTROFOTOMETRI UV-VISIBLE

1. Definisi Spektrofotometri UV-Vis(1)

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh
suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu. Sinar ultraviolet (UV)
mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible)
mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran spektrofotometri
menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang
cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis
lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrum
UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari
analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

2. Prinsip Keja(2)
Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya
monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan
diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-
berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel
yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat
cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang

1
dilewatkan ini kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan
menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh
sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung
dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara
kuantitatif.

Gambar 1. Sketsa prinsip kerja spektrofotometer(3)

3. Komponen Utama Instrumentasi Spektrometer UV-Vis(3)

Instrumentasi spektrometer UV-Vis terdiri dari lima komponen utama, yaitu
sumber radiasi, wadah sampel, monokromator, detektor, amplifier, dan rekorder.
1. Sumber radiasi
Yang digunakan oleh spektrometer adalah lampu wolfram atau sering disebut
lampu tungsten, dan ada juga yang menggunakan lampu deuteurium (lampu
hidrogen).
2. Kuvet
Kuvet yang baik untuk spektrometer UV-Vis yaitu kuvet dari kuarsa yang dapat
melewatkan radiasi daerah ultraviolet. Sel yang baik tegak lurus terhadap arah
sinar untuk meminimimalkan pengaruh pantulan radiasi. Selain itu kuvet yang
digunakan tidak boleh berwarna.
3. Monokromator
Digunakan sebagai alat penghasil sumber sinar monokromatis.
4. Detektor

2
Memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor
akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik dan selanjutnya akan ditampilkan
oleh penampil data dalam bentuk angka digital.
Ketika cahaya dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator, cahaya dari
monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi.
Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara berulang-ulang,
sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya. Di
dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi
dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang
dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar, dan bergetar
(vibrasi) jika dikenai suatu energi. Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV
maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan
tereksitasi. Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya
yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum
lambert-beer atau Hukum Beer yang berbunyi “ jumlah radiasi cahaya tampak
(ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh
suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan ”.
Dalam analisis spektrometer terdapat tiga daerah panjang gelombang
elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200-380 nm), daerah visible
(380-700 nm), daerah inframerah (700-3000 nm).

Gambar 2. Rentang pembagian panjang gelombang elektromagnetik(3)

3
4. Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis(1)
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
a. Aspek kualitatif
Apabila data spektra UV-Vis digabung dengan cara lain seperti spektro IR,
resonansi magnet inti dan spektroskopi massa maka dapat digunakan untuk
identifikasi atau analisis kualitatif suatu senyawa.
b. Aspek kuantitatif
Dalam aspek kuantitatif menurut Farmakope spektra UV-Vis digunakan untuk
mengukur kadar senyawa obat dalam jumlah yang cukup banyak. Suatu berkas
radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi
yang diteruskan diukur besarnya, radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentuakn
dengan cara membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas
sinar yang diserap.
Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh
larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan.
Dalam hukum Lambert-Beer ada beberapa pembatasan yaitu:
 Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
 Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang memiliki penampang luas
yang sama
 Senyawa yang menyerap dalam larutan tidak tergantung terhadap yang lain
 Tidak terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforisensi
 Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

5. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometri UV-

Vis(1)
Untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan
spektrofotometri Uv-Vis harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang
berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan:
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Jika suatu senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah UV-Vis, maka
usaha yang dilakukan adalah merubah menjadi senyawa lain atau direaksikan
dengan pereaksi tertentu. Persyaratan pereaksinya yaitu:

4
  Reaksinya selektif dan sensitif
 Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel
 Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu lama
b. Waktu operasional (Operating time)
Digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya
untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional
ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan. Semakin lama waktu pengukuran, maka kemungkinan
senyawa berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas
warnanya menjadi turun, akibatnya absorbansi juga akan menurun. Maka dari
itu untuk pengukuran senyawa berwarna harus dilakukan pada saat waktu
operasional.
c. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang
gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Alasannya yaitu:
 Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya maksimal
 Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan
pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
 Jika dilakukan pengukuran ulang maka resiko terjadi kesalahan akan kecil
d. Pembuatan kurva baku
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa
garis lurus. Penyimpangan garis lurus biasanya disebabkan oleh:
 Kekuatan ion yang tinggi
 Perubahan suhu
 Reaksi ikutan yang terjadi
e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorban yang terbaca pada alat hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15%
sampai 70% jika dibaca sebagai transmitan. Karena dianggap bahwa kesalahan
dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik).

5
6. Standard Operating Procedure Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
Berikut ini adalah beberapa hal mengenai spektrofotometri UV-Vis beserta
Standard Operating Procedure (SOP):

Proses Analisa Spektrofotometri UV-Vis menggunakan cahaya untuk

menentukan absorbansi atau transmisi dari senyawa
kimia.
Jenis Sampel Padat dan cair
Alat Pelindung diri Mata : Kacamata pengaman
Baju : Jas laboratorium dan sarung tangan karet
Penyiapan Sampel - Jika sampel dalam keadaan padat, sampel harus
dilarutkan dengan suatu substrat transparan.
Substrat transparan diukur sebagai larutan blanko.
- Jika sampel dalam larutan, harus dicampur dengan
konsentrasi yang diinginkan dan pelarut yang
digunakan diukur sebagai larutan blanko.
Prosedur Analisa 1. Periksa ruangan UV-Vis untuk menjamin bahwa
kuvet sampel berada ditempat yang sesuai. Jika
tidak beralih, maka kuvet sampel yang benar akan
berada di kabinet atas peralatan.

2. Aktifkan UV-Vis dengan menekan tombol . Alat

ini tidak akan beroperasi sampai lampu pada tombol
berkedip berwarna hijau.
3. Masuk ke komputer yang terhubung dengan UV-
Vis tersebut.
4. Buka Cary Win UV dari desktop. Klik Scan untuk
memulai program.
5. Klik Setup ... untuk mengatur parameter
eksperimental.
a. Carry Tab
- Mengubah pengaturan berbagai panjang
gelombang.
- Mengatur kontrol Scan untuk kecepatan
yang sesuai. Pengaturan “Lambat” adalah

6
 pilihan yang baik jika untuk data publikasi.
b. Baseline Tab
- Pilih Zero/ Baseline correction
- Klik OK. Pop up akan muncul dan
memberitahu Anda jika baseline tidak valid,
klik OK.
6. Klik tombol Baseline di sisi kiri layar. Sebuah pop
up akan meminta Anda untuk menempatkan blanko
di kuvet. Setelah di tempatkan, klik OK.
7. Peralatan akan di baseline dan kedua pop up akan
muncul yang akan menginstruksikan Anda untuk
memblok sinar sampel. Setelah ini selesai, klik OK.
8. Setelah prosedur dasar dilakukan, klik Zero pada
panel sebelah kanan.
9. Setelah zero selesai, ambil larutan blanko dan
masukkan sampel Anda.
10. Go to Start di bagian tengah atas layar dan klik di
atasnya. Simpan data Anda ke folder file yang
benar. Klik Ok. pemindaian akan dimulai.
11. Setelah pemindaian selesai, sebuah pop up akan
muncul yang akan memungkinkan Anda untuk
memindai sampel lain. Jika Anda mengukur
beberapa sampel atau akan mengubah sampel Anda,
maka ubah nama sampel pada pop up box. Lalu,
klik OK atau klik Finish.

12. Matikan UV-Vis dengan menekan tombol .

13. Logoff komputer.

Prosedur Transfer Untuk mengakses data Anda, Anda dapat

Data melakukannya langsung dari program atau membuka

7
 data pengguna dari desktop dengan memilih file yang
sesuai. Setelah data Anda terbuka buka File, Save As,
dan menyimpannya sebagai file .csv. Ini akan
memungkinkan Anda untuk membuka data dalam
Excel.

DAFTAR PUSTAKA

1. Abdul Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

8
2. Zysk AM dkk. 2007. Needle Based Reflection Refractometry of  Scattering
Samples Using Coherence  Gated Detection. Di dalam Opticts Express (15)
No. 8. USA: University of Illinois at Urbana Champaign.

3. Apratiwi N. 2016. Studi Penggunaan UV-Vis Spectroscopy untuk

Identifikasi Campuran Kopi Luwak dengan Kopi Arabika. Skripsi Sarjana
Teknologi Pertanian. Lampung: Universitas Lampung.

4. Rostro L. 2012. Standard Operating Procedure Ultraviolet-Visible (UV-

Vis) Spectroscopy. Laboratorium Energi.