BAB II

Media nutrisi

Unsur hara tanaman merupakan unsur kimiawi yang dapat dikategorikan sebagai
unsur hara esensial apabila:

a. Unsur hara berpengaruh langsung pada pertumbuhan dan reproduksi

tanaman. Jika tidak ada atau dengan defisiensi parah, tanaman akan mati
sebelum siklusnya selesai dari biji ke biji.
b. Unsur hara memainkan peran unik dalam metabolisme atau fisiologi
tumbuhan sehingga tidak ada unsur lain yang sepenuhnya menggantikan
fungsi ini. Substitusi parsial dimungkinkan. Misalnya, substitusi mangan
untuk magnesium dalam reaksi enzimatik dapat terjadi, tetapi tidak ada
unsur lain yang akan menggantikan magnesium dalam perannya sebagai
penyusun klorofil.

1. Nutrisi makro: Unsur yang umumnya terakumulasi 0,1% ke atas dari

massa kering jaringan tanaman dikategorikan sebagai unsur hara makro.
2. Nutrisi mikro: Unsur yang umumnya terakumulasi kurang dari 0,01%
massa kering jaringan tanaman dikategorikan sebagai unsur hara mikro.

Media kultur sel tanaman terdiri dari banyak senyawa berbeda, termasuk
makronutrien anorganik (garam N, P, S, K, Na, Ca, Mg) dan mikronutrien (garam
misalnya, I, Ni, Fe, Cu, B, Mn, Co), serta vitamin dan sumber karbohidrat
(biasanya sukrosa 2-5%). Media yang paling umum untuk kultur sel tumbuhan
adalah yang dirancang oleh Murashige dan Skoog (1962), Gamborg et al. B5
(1968), Schenk dan Hildebrandt (1972), dan White (1934).

Konstituen Utama

1. Campuran garam
2. Zat organic
3. Kompleks alam
 4. Bahan pendukung yang lembam
5. Pengatur pertumbuhan

Campuran Garam

1. MS (Murashige dan Skoog)

2. Gamborg's B5
3. Nitsch dan Nitsch
4. Putih

Garam Makronutrien

1. NH4TIDAK3 (Amonium nitrat)

2. KNO3 (Potasium nitrat)
3. CaCl2-2H2O (Kalsium klorida, anhidrat)
4. MgSO4-7H2O (Magnesium sulfida, garam Epsom)
5. KH2PO4 (Kalium di hidrogen fosfat)

Garam Mikronutrien

1. FeNaEDTA atau (Na2EDTA dan FeSO4) besi tetap tersedia hingga pH7.6-
8.0
2. H.3BO3 (Asam borat)
3. MnSO4-4H2O (Mangan sulfat)
4. ZnSO4-7H2O (Seng sulfat)
5. KI (Kalium iodida)
6. Na2Melenguh4-2H2O (Sodium molybdate)
7. CuSO4-5H2O (Cupric sulfat)
8. CoCl2-H2O (Cobalt klorida)

Sumber Karbon

1. Sukrosa (1,5 sampai 12%)

 2. Glukosa (Kadang-kadang digunakan dengan monokotil)

Peran elemen yang berbeda

Nitrogen:

Nitrogen adalah komponen utama yang disuplai dalam bentuk garam nitrat
atau amonium. Nitrogen merupakan bagian penting dari asam amino, protein,
asam nukleat. Nitrogen anorganik digunakan untuk mensintesis molekul organik.
Untuk sebagian besar tujuan, media nutrisi harus mengandung 25 hingga 60 mM
nitrogen anorganik. Sel-sel dapat tumbuh hanya pada nitrat, tetapi seringkali
terdapat efek menguntungkan yang berbeda dan kebutuhan untuk amonium atau
sumber nitrogen tereduksi lainnya karena nitrat itu sendiri membawa pH menuju
alkalinitas. Nitrat tidak dapat digunakan begitu saja untuk mensintesis molekul
organik tetapi harus direduksi menjadi amonia terlebih dahulu. Sebagian besar
tanaman lebih menyukai nitrat daripada amonium, meskipun hal sebaliknya juga
berlaku dalam beberapa kasus.

Kalium:

Kalium dibutuhkan pada konsentrasi 2 hingga 26 mM. Ini adalah kation

monovalen dengan mobilitas tinggi di tumbuhan. Garam kalium memiliki fungsi
penting dalam regulasi osmotik sel. Ion kalium sangat penting untuk aktivasi
banyak enzim. Dalam fotosintesis, K + mengatur keseimbangan ion dan pH
kloroplas.

Kalsium:

Kalsium sangat penting untuk keseimbangan kation-anion dengan

melawan anion organik dan anorganik. Konsentrasi kalsium 1-3 mM biasanya
cukup. Kalsium juga penting untuk perbanyakan sel dan akar. Kalsium, salah satu
komponen dinding sel, sebagian besar terikat pada dinding dan membran sel. Hal
ini dikarenakan banyaknya jumlah tempat pengikatan Ca ++ pada dinding sel dan
terbatas mobilitas kalsium melalui membran ke dalam sitoplasma. Kestabilan
membran sel sangat dipengaruhi oleh Ca ++.
Fosfor:

Fosfor hadir di pabrik dalam bentuk fosfat anorganik (iP). Konsentrasi 1-3
mM fosfat biasanya cukup. Ikatan fosfor pirofosfat berenergi tinggi, ketika diikat
ke atom P lain seperti pada ATP, sangat penting untuk metabolisme energi di
dalam sel. Fosfor merupakan elemen penting dalam DNA dan asam nukleat RNA.
Dalam fosfolipid, unsur ini sangat penting untuk metabolisme energi tumbuhan
dalam bentuk ester fosfat yang kaya energi.

Magnesium:

Unsur ini merupakan komponen penting untuk banyak reaksi enzim dan
sangat penting dalam fotosintesis. Magnesium sangat diperlukan untuk
metabolisme energi tanaman karena pentingnya dalam sintesis ATP.

Sulfur:

Ini harus direduksi terlebih dahulu untuk sintesis senyawa yang

mengandung sulfur seperti asam amino, protein, dan enzim. Belerang dalam
bentuk tak tereduksi digabungkan dalam sulfolipid dan polisakarida.

Boron: Boron diperlukan untuk sintesis dinding sel serta stabilisasi penyusun
dinding sel dan membran sel.

Klorin:

Klorin diambil sebagai klorida dan sangat aktif di dalam tumbuhan. Fungsi
utama ion berada dalam osmoregulasi. Klorida berperan dalam fotosistem II
selama reaksi Hill. Klorin juga mengatur pembukaan dan penutupan stomata dan
dengan demikian sangat penting dalam pengaturan potensi osmotik vakuola serta
proses yang berhubungan dengan turgor.

Tembaga:

Tembaga diambil oleh tanaman sebagai Cu ++ atau sebagai kompleks

kelat tembaga. Di dalam sel, tembaga sebagian besar merupakan bagian dari
kompleks enzim dan penting dalam reaksi redoks yang dilakukan oleh enzim ini.
Berguna dalam fotosintesis.

Kobalt:

Kobalt dianggap penting dalam fiksasi nitrogen. Pada tumbuhan tingkat

tinggi fungsi elemen ini tidak terlalu jelas.

Mangan:

Mangan diambil oleh tanaman sebagai ion Mn ++ bivalen tak terikat.

Unsur ini terikat kuat pada beberapa metaloprotein. Ion terlibat dalam reaksi Hill
dari fotosistem II di mana air dipecah menjadi oksigen dan proton.

Molibdenum:

Molibdenum digunakan sebagai kofaktor di banyak enzim, termasuk

nitrogenase dan nitrat reduktase. Ia juga terlibat langsung dalam reduksi N2.

Seng:

Seng diambil oleh akar sebagai Zn ++. Itu tidak teroksidasi atau tereduksi
pada tanaman. Ini adalah komponen penting dari sejumlah enzim, misalnya
alkohol dehidrogenase di zona meristem tanaman. Seng juga sangat penting untuk
sintesis protein.

Besi:

Besi umumnya ditambahkan sebagai kelat dengan asam etilen diamina

tetra asetat (EDTA). Dalam bentuk ini, besi tetap tersedia hingga pH 8,0. Ini
terutama terikat pada chelators dan senyawa kompleks pada tumbuhan.
Kebanyakan tanaman hanya menyerap ion besi (Fe3 +). Fungsi utama zat besi
adalah untuk membentuk kelat besi dan dua macam protein: protein haeme dan
protein belerang besi. Protein haeme yang paling terkenal adalah sitokrom,
berfungsi sebagai perantara elektron yang diperlukan untuk reduksi nitrat menjadi
nitrit oleh enzim nitrat reduktase dalam asimilasi nitrogen. Kelompok kedua dari
protein pengikat besi adalah protein belerang besi. Besi terikat pada kelompok tiol
(-SH) dari sistin dan / atau belerang anorganik. Ferridoxin adalah protein sulfur
besi yang paling umum. Ini berfungsi sebagai pembawa dalam reaksi transpor
elektron yang dikatalisis oleh reduktase nitrat, reduktase sulfat, sintesis NADP +
selama fotosintesis dan reduksi nitrogen oleh kompleks nitrogenase. Besi juga
penting dalam biosintesis klorofil.

Karbon dan sumber energi

Sumber karbon standar adalah sukrosa tetapi jaringan tanaman dapat

memanfaatkan berbagai karbohidrat seperti glukosa, fruktosa, laktosa, maltosa,
galaktosa dan pati. Dalam jaringan atau sel yang dibudidayakan, fotosintesis
dihambat sehingga karbohidrat dibutuhkan untuk pertumbuhan jaringan dalam
medium. Sukrosa, dengan konsentrasi 2-5% dalam medium, banyak digunakan.
Proses autoklaf memang menyebabkan perubahan gula melalui hidrolisis tetapi
tidak ada kekurangan pada rencana pertumbuhan ..

Senyawa Organik

Vitamin

1. Tiamin 1.0 mg / L
2. Asam nikotinat dan piroksidin 0,5 mg / L
3. Glisin 2.0 mg / L
4. Vitamin C (antioksidan) 100,0 mg / L
5. Asam amino dan amida: Asam amino dapat digunakan sebagai satu-
satunya sumber nitrogen, tetapi biasanya terlalu mahal.

2 asam amino yang paling umum digunakan:

• L-tyrosine, meningkatkan formasi tunas adventif.

• L-glutamin, dapat meningkatkan embriogenesis adventif.
Senyawa Organik Lainnya

Inositol: Merangsang pertumbuhan, Gunakan dengan kecepatan 100 mg / L

Purin / pirimidin
  Adenine merangsang pembentukan pucuk; Dapat menggunakan adenin
sulfat pada 100 mg / L

Asam organik

 Asam sitrat (150 mg / L) biasanya digunakan dengan asam askorbat (100

mg / L) sebagai antioksidan.
Senyawa fenolik

 Phloroglucinol-Merangsang rooting bagian tunas.

 L-tirosin merangsang pembentukan tunas.
Kompleks Alami

1. Endosperma kelapa
2. Emulsi ikan
3. Hidrolisat protein
4. Jus tomat
5. Ekstrak ragi
6. Agar kentang
Kompleks Inert Nutrisi

1. Agen pembentuk gel

2. Arang
3. Mendukung kertas saring
4. Bahan lainnya
Agen Pembentuk Gel

1. Ekstrak agar-agar dari agar-agar merah laut

Agar terlarut membentuk gel yang dapat mengikat air dan
menyerap senyawa. Semakin tinggi konsentrasi agar-agar, semakin kuat
ikatan airnya. Dengan konsentrasi yang lebih tinggi, medium menjadi
keras dan tidak memungkinkan difusi nutrisi ke dalam jaringan. Jadi
pertumbuhan in vitro dapat terpengaruh secara merugikan jika konsentrasi
agar-agar terlalu tinggi. Selain agar, alternatif berikut dapat digunakan.
2. Phytagar
 3. Agarose
4. Hidrogel
5. agar-agar
6. Gelrite
Arang

Arang aktif digunakan sebagai agen detoksifikasi. Detoksifikasi limbah

dari jaringan tanaman, kotoran. Konsentrasi yang biasanya digunakan adalah
0,3% atau lebih rendah. Jangan pernah menggunakan kembali.

Regulator Pertumbuhan

Hormon sekarang disebut sebagai zat pengatur tumbuh yang telah disintesis
secara alami pada tumbuhan tingkat tinggi, yang mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangannya. Ini biasanya aktif di lokasi yang berbeda dari tempat mereka
diproduksi dan ada serta aktif dalam jumlah yang sangat kecil. Dua kelas utama
zat pengatur tumbuh yang sangat penting dalam kultur jaringan tanaman adalah
auksin dan sitokinin, sedangkan yang lain tidak terlalu penting, yaitu giberelin,
asam absisat, etilen, dll. Beberapa zat pengatur tumbuh yang terjadi secara alami
adalah asam asetat indol (IAA), auksin dan zeatin dan isopentenil adenin (2 iP)
sebagai sitokinin, sedangkan lainnya adalah zat pengatur tumbuh sintetis.

1. Auksin
2. Sitokinin
3. Gibberellin
4. Asam absisat
5. Etilen

1. Auksin
Kata auksin berasal dari bahasa Yunani; auxein artinya
membesarkan atau menumbuhkan. Auksin efektif dalam pembentukan
kalus, rooting stek, dan induksi embriogenesis adventif. Pada tingkat sel,
auksin mengontrol dua proses utama yang bekerja sama dengan sitokinin,
yaitu siklus sel dan pembelahan sel di satu sisi, dan pemanjangan sel di sisi
lain. Rasio auksin: sitokinin merupakan sinyal penting dalam
pembentukan fenotipe sel dan juga dalam permulaan dan pemeliharaan
proses pembelahan sel. Aktivasi elongasi sel oleh auksin dimediasi oleh
peningkatan pengeluaran proton. Pembelahan sel normal memerlukan
sinkronisasi antara fase S dan pembelahan sel, menunjukkan bahwa
tingkat auksin dan sitokinin dalam kultur perlu disesuaikan dengan hati-
hati.
Karena mereka mampu memulai pembelahan sel, mereka terlibat
dalam pembentukan meristem yang menghasilkan jaringan yang tidak
terorganisir, atau organ yang ditentukan. Auksin merangsang diferensiasi
ikatan pembuluh darah. Sel, yang merespons auksin, kembali ke keadaan
terdiferensiasi dan mulai membelah. Auksin menyebabkan DNA menjadi
lebih termetilasi dari biasanya yang mungkin diperlukan untuk
pemrograman ulang sel yang terdiferensiasi. Dalam jaringan yang
terorganisir, auksin terlibat dalam pembentukan dan pemeliharaan
polaritas dan di seluruh tanaman efeknya yang paling menonjol adalah
pemeliharaan dominasi apikal.
a. Indole 3-Acetic acid (IAA)Indole 3-Butyric acid (IBA
b. α- Asam asetat naftalen (NAA)
c. 2,4-D (2,4-Dichloro fenoksi asam asetat)
d. 2,4,5-Trichloro phenoxy acetic acid (2,4,5-T) Indole 3- Asam asetat

Gbr. 13: Berbagai jenis Auksin

2. Sitokinin
Sitokinin mendorong pertumbuhan tunas ketiak, dan mengurangi
dominasi apikal dalam kultur pucuk tanaman berdaun lebar. Mereka
mengaktifkan sintesis RNA, merangsang sintesis protein dan aktivitas
beberapa enzim. Sitokinin, bersama dengan auksin, berperan dalam
pengaturan siklus sel dan pembentukan pucuk adventif dalam sel
tumbuhan. Kadar sitokinin yang tinggi merusak; menghasilkan banyak
tunas kecil, yang biasanya gagal memanjang; mereka juga dapat
menyebabkan daun dari beberapa spesies memiliki bentuk yang tidak
biasa, dan / atau menyebabkan tunas menjadi hiperhidrik. Konsentrasi
tinggi juga menghambat atau memperlambat pembentukan akar. Ini
mencegah pertumbuhan akar dan efek promotif auksin pada inisiasi akar.

Gambar 14: Berbagai jenis Sitokinin

a. 6 benzil amino purin

b. Kinetin
c. 2iP
d. Zeatin
e. PBA
f. Kinetin

3. Gibberellin
Umumnya tidak digunakan dalam kultur jaringan. Cenderung
menekan pembentukan akar dan pembentukan embrio adventif.
4. Asam Absisat
 Terutama penghambat pertumbuhan tetapi memungkinkan
perkembangan normal embrio, baik zigotik maupun adventif.
5. Etilen
Zat alami yang dihasilkan oleh kultur jaringan pada tingkat yang
cukup tinggi, terutama pada saat sel berada dalam tekanan. Ini
meningkatkan penuaan dan menekan embriogenesis dan perkembangan
secara umum.

Persiapan media MS

Persiapan larutan stok:

Menimbang produk yang diperlukan setiap kali media disiapkan,

merupakan proses yang memakan waktu dan membosankan, oleh karena itu
digunakan larutan pekat dari komposisi media yang diinginkan yang dapat
diencerkan secara memadai. Larutan pekat ini disebut larutan stok. Larutan stok
makro dan mikronutrien, vitamin dan zat pengatur tumbuh disiapkan dalam air
suling atau air demineralisasi dengan kemurnian tinggi.

a. Larutan stok makronutrien: Biasanya, larutan stok makronutrien

disiapkan 10x. Larutkan semua makronutrien satu per satu kecuali
(CaCl2untuk larutan stok makronutrien. Larutan stok CaCl2harus
disiapkan secara terpisah. Cara lain adalah dengan melarutkan
makronutrien yang berbeda satu demi satu dan CaCl 2 dilarutkan
secara terpisah dan kemudian ditambahkan ke sisa larutan stok untuk
menghindari pengendapan.
b. Larutan stok mikronutrien: Larutan stok semua mikronutrien
dengan 100x biasanya disiapkan. Karena tembaga dan kobalt
dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil, lebih disukai untuk
terlebih dahulu membuat larutan stok terpisah dari kedua garam ini
(100x) dan kemudian volume yang sesuai dapat dipipet dan
dimasukkan ke dalam larutan stok mikronutrien utama.
c. Besi-EDTA: Besi EDTA harus ditambahkan segar. Jika larutan stok
(100x) disiapkan, maka FeSO4 dan Na2EDTA harus dilarutkan secara
 terpisah, dapat dipanaskan untuk kelarutan yang efektif, kemudian
campur keduanya dan atur pH pada 5,5. Kemudian harus disimpan
dalam botol amber atau botol yang ditutup dengan aluminium foil.
d. Vitamin dan larutan stok pengatur tumbuh: Ini adalah solusi stok
sederhana. Semua zat pengatur tumbuh tidak larut dalam air. Senyawa
harus dilarutkan dalam beberapa ml pelarut dan kemudian
ditambahkan air secara perlahan untuk membuat volume yang
diperlukan. Konsentrasi senyawa dapat diambil sebagai mg / l atau
dalam molaritas.

Solusi stok untuk MS Medium

Gbr. 15: Solusi stok dan persiapan media MS