Anda di halaman 1dari 21

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Seluruh gen manusia telah berhasil ditentukan urutan nukleotidanya. Persoalan
yang kini dihadapi oleh para ahli biologi molekuler adalah melakukan analisis dan
menentukan struktur dan fungsi gen serta pemetaan hubungan gen satu dengan
lainnya. Analisis ini sangat bermanfaat untuk mengenali lebih jauh mengenai proses
normal biokimia dan fisiologi yang terjadi di dalam tubuh manusia dan organisme
lainnya.
Analisis ini juga akan dapat membantu manusia untuk mengenali keadaan
patologis seseorang serta dapat memperkirakan proses tanggapannya terhadap adanya
rangsang dari luar, misalnya terhadap pemberian obat. Pemahaman tentang sistem
kesehatan yang didasarkan pada analisis genomik saat ini telah melahirkan suatu
cabang disiplin ilmu baru yang dinamakan Farmakogenomik. Salah satu teknologi
utama yang digunakan untuk pengembangannya adalah DNA microarray.
Melakukan analisis fungsi dan pemetaan hubungan satu dengan lainnya
memang sulit dibayangkan. Bagaimana membuat kemungkinan hubungan dari unsur-
unsur sebanyak itu. Ini akan menjadi sebuah gambaran yang menarik, karena hal itu
terjadi di dalam tubuh manusia sehingga memungkinkan bagi manusia untuk lebih
dapat memahami secara rinci mengenai peristiwa yang terjadi di dalam tubuhnya.
Oleh karena itu tidaklah berlebihan bila program tersebut dikatakan sebagai
suatu program ambisius yang sedang dikerjakan oleh manusia mengawali abad 21 ini.
Selain itu, mengikuti keberhasilan program sekuensing genom ini, juga dilakukan
program analisis keragaman genetik individu yang dinamakan Single Nucleotide
Polymorphism (SNP). Keberhasilan program tersebut akan berdampak sangat besar
terhadap kehidupan manusia, bahkan bisa jadi akan lebih luas dari perkiraan yang ada
pada saat ini.
Hasilnya, produk dari program ini akan menyediakan data lengkap mengenai
karakterisik asal manusia yang tersimpan di dalam gen-gen yang telah dipetakan
tersebut. Data lengkap gen atau data genomik ini akan membuka tabir mengenai
keseluruhan proses biokimiawi yang terjadi pada tubuh manusia yang berpengaruh
pada sifat-sifatnya. Pengetahuan yang lengkap tentang proses yang terjadi di dalam

1
tubuh manusia ini akan dapat merubah paradigma dalam ilmu-ilmu yang berkaitan
dengan manusia, misalnya ilmu biokimia kesehatan dan psikologi medis.
Adanya pergeseran atau perubahan, baik wujud, saat ataupun jumlah dalam
penyediaan protein yang signifikan, akan dapat menimbulkan kelainan atau penyakit.
Perbedaan pola penyediaan protein (ekspresi gen) sebenarnya secara alami terjadi di
antara individu. Bahkan dapat dikatakan bahwa tidak ada dua individu yang memiliki
kesamaan dalam pola penyediaan protein tersebut. Namun demikian, perbedaan-
perbedaan yang ada tersebut masih berada dalam batas kenormalan fungsi secara
keseluruhan sehingga masih akan kelihatan kewajarannya.
Perbedaan dalam hal penyediaan protein inilah yang menyebabkan adanya
kepastian perbedaan antara orang satu dengan lainnya. Perbedaan-perbedaan tersebut
dalam kenampakannya (fenotipe) akan terlihat misalnya dalam hal bentuk fisik,
kecerdasan, emosi, kemampuan dalam hal tertentu (bakat), kepekaan terhadap segala
rangsangan, penyakit bawaan, kerentanan terhadap segala pengaruh termasuk obat-
obatan dan sebagainya. Singkatnya, segala sifat-sifat yang melekat pada pribadi
seseorang dapat dilacak dari karakter sel-selnya dalam penyediaan protein (genotipe).
Masalahnya sekarang adalah bagaimana caranya untuk mendapatkan data pola
penyediaan protein dari seseorang dari sejumlah gen yang banyak itu? Masalah ini
tidak sederhana. Kalau hanya satu atau dua atau beberapa jenis gen yang akan
dianalisis memang dapat digunakan metoda-metoda yang sudah mapan yang tersedia
pada saat ini, misalnya, Northern blot (RNA), Southern blot (DNA) dan Westhern
blot (protein) ataupun dot blot. Akan tetapi, dengan jumlah gen yang sebanyak
puluhan ribu itu, metoda-metoda tersebut sudah tidak memungkinkan lagi.
Pengembangan teknologi baru yang dinamakan chip DNA atau DNA
microarray, telah menjanjikan untuk dapat mengatasi persoalan dalam analisis pola-
pola ekspresi sejumlah besar gen yang dimiliki manusia. Dinamakan chip DNA
karena teknologi ini menggunakan lempengan kecil (chip) yang terbuat dari kaca yang
di atasnya ditata sejumlah ribuan atau bahkan puluhan ribu jenis gen dalam bentuk
fragmen DNA hasil penggandaan dari cDNA. Selanjutnya chip yang memuat fragmen
DNA dari ribuan jenis gen tersebut digunakan untuk menganalisis ekspresi gen dari
suatu jenis sel dengan hibridisasi. Pola ekspresi genetik dan jenis gen yang dapat
dianalisis dengan teknik ini tergantung pada ketersediaan DNA dari gen yang ada
pada chip DNA.

2
Apabila seluruh gen yang dimiliki oleh manusia sudah dikenali, kemudian
semuanya dapat ditata pada chip DNA maka alat tersebut akan mampu menganalisis
ekspresi seluruh gen yang terdapat di dalam sel manusia. Dalam praktiknya, teknologi
ini membutuhkan alat bantu pengolah data yang berupa seperangkat komputer beserta
software-nya. Teknologi ini akan membantu manusia dalam melakukan identifikasi
seluruh sifat yang melekat pada seseorang. Selain itu teknologi ini juga akan dapat
membantu manusia dalam melakukan diagnosis, memonitor, dan memprediksi suatu
penyakit, menemukan dan mengembangkan obat baru serta menentukan pilihan obat
yang paling tepat untuk suatu penyakit dan pasien tertentu.
Teknik microarray tidak hanya berlaku untuk studi mengenai DNA, tapi juga
untuk protein. Hanya saja, untuk studi protein tidak semudah studi DNA dikarenakan
sifat protein yang dinamis, selalu berubah tergantung lingkungan sel sekitarnya. Pada
kesempatan kali ini akan dibahas mengenai studi DNA dan protein melalui teknik
microarray.

1.2 Perumusan Masalah


a. Apakah yang dimaksud dengan microarray DNA?
b. Bagaimanakah prinsip dasar dari kerja microarray DNA?
c. Bagaimanakah tahapan-tahapan dari sebuah teknologi microarray DNA?
d. Apakah yang dimaksud dengan proteomic profiling?
e. Bagaimanakah prinsip dasar dari kerja proteomic profiling?
f. Bagaimanakah tahapan-tahapan dari sebuah teknik proteomic profiling?

1.3 Tujuan
a. Menjelaskan pengertian dari microarray DNA?
b. Menjelaskan prinsip dasar dari kerja microarray DNA?
c. Menjelaskan tahapan-tahapan dari sebuah teknologi
microarray DNA?
d. Menjelaskan pengertian proteomic profiling?
e. Menjelaskan prinsip dasar dari kerja proteomic profiling?
f. Menjelaskan tahapan-tahapan dari sebuah teknik proteomic
profiling?

3
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Microarrays DNA

2.1.1 Definisi dan Sejarah Microarrays DNA


Microarray DNA merupakan salah satu teknik dalam biologi molekuler,
perkembangan dari teknik Southern bolt, dimana fragmen DNA ditempelkan pada
suatu substrat dan kemudian dikenali dengan sebuah gen atau fragmen nukleotida
yang telah diketahui urutannya. Teknik ini pertama kali digunakan untuk menganalisa
378 urutan nukleotida dari koloni bakteri yang telah mengalami lisis sel, masing-
masing mengandung urutan nukleotida yang berbeda yang kemudian diperiksa
keseluruhan replikannya untuk diekspresi pada jaringan normal dan jaringan tumor
(Augenlicht dan Kobrin, 1982). Teknik ini kemudian diperluas penggunaannya untuk
menganalisa lebih dari 4000 urutan DNA manusia menggunakan scan komputer dan
print-outnya digunakan untuk analisis kuantitatif urutan DNA jaringan tumor dan
jaringan normal pada manusia (Augenlicht et al, 1987), kemudian dibandingkan
dengan jaringan dengan kemungkinan sifat genetik yang berbeda (Augenlicht et al.,
1991). Pemanfaatan kumpulan urutan DNA yang berbeda dalam pengenalan ekspresi
gen juga ditemukan pada tahun 1987 dan urutan DNAs tersebut digunakan untuk
mengidentifikasi ekspresi mana yang dimodulasi oleh adanya interferon. Pada
awalnya urutan DNA ini diperoleh dari pembacaan cDNAs pada kertas filter
menggunakan pin-spotting device. Manfaat miniatur microarray untuk ekspresi gen
telah dipublikasikan pada tahun 1995 dan disusul dengan adanya penemuan genom
lengkap Saccharomyces cerevisiae pada tahun 1997.
Microarrays DNA dapat digunakan untuk mengetahui perubahan pada tingkat
ekspresi gen, utnuk mendeteksi single nucleotide polymorphisms (SNPs), atau untuk
penyusunan ulang urutan gen pada genom yang mengalami mutasi. Teknik ini sangat
sensisitif dan memberikan hasil dengan keakuratan yang tinggi.

2.1.2 Prinsip Dasar Miroarrays DNA


Microarrays DNA mendeteksi ekspresi pada tingkat genetik dengan cara
mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada ribuan gen terimobilisasi di atas permukaan
gelas (chip). Prinsipnya adalah mensintesis cDNA dari RNA yang diisolasi dari dua

4
kondisi yang berbeda (misal sel tumor dan sel normal), kemudian dilakukan
penandaan dengan menggunakan unsur radioaktif fluorosens multiwarna. cDNA yang
telah dilabeli ini kemudian dihibridisasi dengan sejumlah besar gen dari pustaka gen.
Hasil hibridisasi kemudian dianalisis dengan menentukan intensitas fluorosens relatif
untuk masing-masing gen dengan menggunakan scanner laser.

Gambar 1. Skema Tahapan Microarrays DNA

2.1.3 Tahapan-Tahapan dalam Microarrays DNA


Pada umumnya, ada beberapa tahapan utama yang harus dilakukan pada
microarrays DNA yaitu, preparasi microarrays, preparasi probe cDNA yang telah
dilabeli oleh fluoresens, proses hibridisasi, proses scanning serta analisis data dan
gambar.

2.1.3.1 Preparasi Miroarrays


Microarrays dapat dilakukan dengan dua format yang berbeda, yaitu :
oligonukleotida arrays dan cDNA microarrays. Array oligonukleatida diperoleh dari
proses pencetakan urutan pendek oligonukleatida yang mewakili suatu gen dengan
cara mensintesis secara langsung urutan nukleotida pada permukaan padatan
pendukung. Panjang urutan nukleatida dapat beragam, mungkin lebih panjang (60
probe) seperti Agilent atau lebih pendek sekitar 25 probe seperti Affymetrix. Panjang
urutan nukleotida bergantung pada tujuan penggunaan, probe yang lebih panjang akan

5
lebih spesifik dalam pengenalan gen individu target, namun probe yang lebih pendek
akan lebih murah dalam produksi pembuatannya.
Oligonukleatida dapat disintesis secara in situ, langsung di permukaan chip
atau disintesis terlebih dahulu kemudian disimpan ke dalam chip. Teknik ini tidak
membutuhkan pengelolaan pustaka klon sebagai database. Teknik ini sesuai untuk
analisis ekspresi genetik suatu organisme dengan susunan genomik yang lengkap.
Pada sintesis oligonukleatida secara in situ, oligonukleatida langsung dikemas
ke dalam suatu padatan pendukung. Affymetrix memperoleh urutan DNA dengan
menggunakan pendekatan potolitografi, dimana lampu merkuri digunakan untuk
menyinari permukaan chip melalui penutup potolitografi, secara selektif
menghilangkan gugus yang bersifat photo-labile dari rantai tumbuh oligonukleatida.
Masing-masing elemen berukuran sekitar 10µm, pada miniaturisasi lanjut, elemen-
elemen ini ditambahkan dengan menggunakan teknologi photoresist semikonduktor
non-linear. Teknik sintesis ini tidak memerlukan proses pemurnian oligonukleatida
dikarenakan randemen yang didapat sekitar 95% dan oligonukleatida yang disintesis
tidak lebih dari 25 basa nukleotida.
Sedangkan cDNA arrays diperoleh dari mencetak untai ganda cDNA ke
dalam padatan pendukung, seperti gelas atau nilon menggunakan robotic pins.
Terdapat dua tahapan utama dalam mikroaray cDNA adalah preparasi klon cDNA
yang diamplifikasi menggunakan teknik PCR lalu kemudian menotolkan klon cDNA
pada tingkat densitas yang tinggi ke atas slide kaca mikroskopik. Walaupun pada
umumnya kumpulan cDNA terbuat dari slide kaca, namun DNA dapat juga ditotolkan
pada fasa padat pendukung, misalnya nitroselulosa atau membran nilon yang
bermuatan. Tipe aray yang menggunakan fasa padat pendukung ini dikenal sebagai
paper arrays atau makroaray. Microarray yang menggunakan slide kaca hanya dapat
dipergunakan sekali dan membutuhkan biaya operasi yang tinggi pada proses
pelabelan kit dan proses scanningnya.

2.1.3.2 Preparasi Pelabelan cDNA dan Hibridisasi


Dalam microarray, nukleotida yang akan dianalisa disebut sebagai probe.
Probe merupakan mRNA yang diperoleh dari sel makhluk hidup, misalnya rambut,
kuku, air liur dan lain sebagainya. Untuk memperoleh mRNA, maka mRNA harus
dipisahkan dari seluruh komponen yang terdapat dalam suatu sel.

6
Dalam teknik isolasi mRNA, hal yang pertama dilakukan adalah lisis sel. Lisis
sel dapat dilakukan secara fisik maupun kimiawi. Cara kimiawi merupakan cara yang
paling sering digunakan dalam proses lisis sel dengan cara menambahkan dua jenis
senyawa, dimana senyawa pertama berfungsi untuk merusak dinding sel sedangkan
senyawa lainnya berfungsi untuk merusak membran sel. Proses lisis sel biasanya
dilakukan dengan cara menambahkan lisozim, etilendiamintriasetat (EDTA) dan
sodium dodesil sulfat (SDS). Lisozim berperan untuk merusak dinding sel karena
senyawa tersebut dapat memotong senyawa polimer. EDTA dapat mengikat ion
magnesium yang berfungsi dalam mempertahankan selubung sel dan sebagai kofaktor
bagi enzim-enzim yang dapat merusak DNA. SDS diperlukan untuk menghilangkan
molekul lipid, sehingga dapat digunakan untuk merusak membran sel. Sel yang telah
ditambahkan ketiga jenis senyawa tersebut kemudian dimasukkan ke dalam water
bath.
Di dalam ekstrak sel terkandung mRNA, DNA dan protein. Protein dapat
dihilangkan dengan cara menambahkan fenol atau campuran fenol-kloroform 1:1.
pelarut organik tersebut akan mengendapkan protein, namun DNA dan RNA akan
tetap berada dalam fasa larutannya. Jika jumlah protein cukup banyak, maka sebelum
penambahan fenol-kloroform, ke dalam campuran dapat ditambahkan proteinase K,
suatu enzim yang dapat memecah polipeptida menjadi fragmen-fragmen yang mudah
dihilangkan dengan penambahan fenol. Campuran kemudian disentrifugasi dan
didekantasi untuk memisahkan supernatan dan residunya. Fasa supernatan kemudian
ditambahkan isopropil alkohol, RNA yang tidak larut dalam isopropil alkohol akan
mengendap.
Langkah selanjutnya adalah mengkonversi mRNA menjadi cDNA kemudian
melakukan penandaan terhadap cDNA menggunakan bahan fluoresens. Fluoresens
yang sering digunakan adalah Cy3 yang berwarna hijau sebagai kontrol dan Cy5 yang
berwarna merah sebagai tes. Baik RNA total ataupun poli(A+) RNA dapat digunakan
dalam reaksi reverse transkriptase.
Terdapat dua macam penandaan yang dapat digunakan, yaitu direct labelling
dan indirect labelling. Pada direct labelling, Cy3 atau Cy5-labelled dUTP bergabung
secara dengan cDNA selama reverse transcription berlangsung. Walaupun ini paling
umum digunakan dalam microarray DNA, namum ini memiliki kekurangan yaitu
kompleks Cy5-labelled nukleotida lebih sukar untuk bergabung dengan cDNA
dibandingkan dengan kompleks Cy3-labelled nukleotida.
7
Pada indirect labelling, kompleks antara amino-allyl dan nukleotida yang
telah dimodifikasi bergabung dengan cDNA selama berlangsungnya proses sintesis
untai pertama cDNA untuk kedua sampel, dan selanjutnya terbentuk NHS-ester pada
senyawa sianin yang sesuai melalui suatu ikatan kovalen.
Pada proses direct labelling, labelled nukleotida yang tidak bergabung dengan
cDNA harus dihilangkan dari kompleks Cy5-labelled nukleotida-cDNA. Sedangkan
pada proses indirect labelling, kompleks amino-allyl-labelled nukleotida dan
fluoresens yang tidak berpasangan harus dihilangkan dari cDNA yang telah ditandai
dengan cara yang tepat. Teknik peghilangan yang tidak sesuai dapat memberikan hasil
berupa background yang kurang baik. Hal ini disebabkan karena Cy3 ataupun Cy5
sangat sensitif terhadap cahaya. Terpaan cahaya selama proses berlangsung harus
dihindari atau dibuat seminimal mungkin.
Tabel 1. Beberapa Kit Pelabelan dalam Microarray
Total RNA yang
Company Kit Labelling
dibutuhkan
Stratagene Fair Play labelling kit Indirect 10-20 µg
Clontech AtlasTM PowerscriptTM Indirect 3 µg
fluoroscent labelling kit
AtlasTM Glass fluoroscent 10 µg
labelling kit
Agilent Direct labelling kit Indirect 10 µg
Tech.
Perkin Elmer MICROMAXTM direct Direct 20-30 µg
labelling kit
MICROMAXTM TSA 0,5-1 µg
labelling kit
Genetix Hyspot direct labelling Direct
kit
Qiagen LabelStarTM array Direct dan indirect 0,2-50 µg
labelling kit
Genisphere ARRAY 350RPTM 0,5-2 µg

Hasil dari reaksi penandaan dapat dianalisa baik menggunakan


spektofotometer ataupun menggunakan gel agarosa. Pada spektrofotometer,
pengukuran perbandingan antara nukleotida dan senyawa fluorosens dilakukan

8
dengan cara membaca absorbansi pada 260 nm untuk DBA dan 550 nm untuk Cy3
atau 650 nm untuk Cy5. Cara lainnya adalah dengan melakukan running terhadap
sejumlah cDNA yang telah ditandai menggunakan laser scanner untuk memverifikasi
ukuran rata-rata dan kualitas dari cDNA yang telah ditandai.
Langkah selanjutnya adalah menghibridisasi cDNA yang sebelumnya telah
ditandai menggunakan radioisotop fluorosens dengan pustaka gen yang dimuat dalam
chip. Seperti halnya proses hibridisasi yang lain, hibridisasi dalam microarray DNA
pun membutuhkan spesifikasi yang tinggi dan sinyal background seminimal mungkin
untuk hasil yang baik. Selama proses hibridisasi berlangsung, pembentukan
gelembung harus dihindari karena dapat memberikan dampak pada analisis dengan
terbentuknya background yang berlebih.

2.1.3.3 Scanning serta Analisis Data dan Gambar


Setelah proses hibridisasi selesai, slide kemudian discan menggunakan laser
scanner yang mampu membedakan antara Cy3 dan Cy5-labelled probe untuk
menghasilkan scanning yang berbeda secara terpisah untuk masing-masing
penandaan. Hasil scanning kemudian dianalisis untuk menghitung jumlah relatif
ekspresi untuk masing-masing gen.
Hasil scanning yang baik memiliki background yang rendah, seragam serta
rasio yang baik antara sinyal dan pulsa. Analisis hasil scanning terdiri dari identifikasi
titik, determinasi background dan kalkulasi background dikurangi dengan intensitas
fluoresens untuk masing-masing sampel. Lokasi spot perlu diidentifikasi lebih dulu
dikarenakan adanya probe yang mengendap, artefak hibridisasi dan kontaminan
seperti debu di permukaan slide, dapat memberikan sinyal yang keliru.
Spot dapat diidentifikasi dengan mudah dikarenakan spot terletak dengan
susunan tertentu. Setelah spot berhasil teridentifikasi, langkah selanjutnya adalah
estimasi sinyal background. Background pada umumnya dapat dihitung di sekitar
posisi masing-masing spot. Kemudian background dikurangi dengan intensitas
fluorosens untuk masing-masing sampel. Rasio perbandingan Cy3 dan Cy5 yang
terukur digunakan untuk mengidentifikasi perbedaan ekspresi gen.
Data yang diperoleh kemudian dinormalisasi untuk menyesuaikan perbedaan
reaksi penandaan untuk kedua sampel, efisiensi deteksi penandaan menggunakan
fluorosens dan juga perbedaan pada kuantitas RNA dari sampel yang digunakan.

9
normalisasi yang biasa digunakan adalah mengukur intensitas fluorosens
total. Jumlah intensitas fluorosens di seluruh spot harus sama untuk kedua channel
karena jumlah RNA yang digunakan untuk reaksi penandaan masing-masing sampel
sama. Walaupun intensitas mungkin berbeda untuk beberapa spot pada kedua
channel, namun intensitas rata-rata per spot adalah sama. Intensitas rata-rata per spot
dapat dihitung dengan membagi intensitas total semua spot umtuk satu channel
dengan jumlah keseluruhan spot.
lain, satu atau lebih sampel RNA dapat ditambahkan pada konsentrasi yang
sama untuk masing-masing sampel, kemudian normalisasi dilakukan dengan
menganggap jumlah dari intensitas dari spot-spot tersebut dengan gen kontrol adalah
sama. Setelah normalisasi selesai, ekspresi gen yang berbeda dapat diidentifikasi.
2.2 Proteomic Profiling
2.2.1 Definisi Proteomic Profiling
Microarrays DNA telah memberikan hasil yang luar biasa dalam pengukuran
tingkat ekspresi gen. Bagaimanapun, sulit, jika tidak mungkin untuk memprediksi
lingkungan seluler yang senantiasa berubah-rubah hanya dengan memperhatikan
tingkat transkripsi DNA. Pada kenyataannya, tidak ada korelasi yang reliable antara
aktivitas gen dan konsentrasi protein. Hal inilah yang menyebabkan, pentingnya studi
proteomik dilakukan.
Proteomik merupakan kelanjutan dari studi genomik pada sistem biologi,
mengenai protein yang diproduksi oleh sebuah sel serta fungsi fisiologisnya. Studi
proteomik jauh lebih rumit daripada studi genomik dikarenakan DNA organisme
bersifat konstan sedangkan protein setiap sel berbeda dari waktu ke waktu tergantung
pada pengaruh lingkungan dan stimultan. Perilaku biologis sel ditentukan berdasarkan
pola ekspresi gen di dalam sel tersebut. Setiap sel manusia memiliki milyaran subunit
DNA yang mengkode puluhan ribu gen dan setiap sel hanya memiliki beberapa fraksi
gen yang aktif. Gen abnormal memberikan perubahan ekspresi gen atau protein yang
secara fungsional mewakili genom.
Bekerja dengan protein jauh lebih sulit daripada dengan asam nukleat. Selain
karena hal yang telah disebutkan, kesulitan lainnya adalah sifat protein yang tidak
dapat diamplifikasi. Selain itu, protein mudah terdenaturasi dengan adanya sedikit
perubahan kondisi percobaan, yang menyebabkan perubahan struktur.
Karena pentingnya fungsi yang dimiliki protein seperti metabolisme,
reproduksi sel, dan lain-lain maka studi proteomik menjadi hal yang penting untuk
10
dilakukan. Studi proteomik digunakan untuk mengidentifikasi penyakit sehingga
dapat bermanfaat dalam tindakan pencegahan, diagnosis dan pengobatan. Dengan
diketahuinya protein yang terekspresi untuk penyakit tertentu maka obat untuk
penyakit tersebut dapat diproduksi.

2.2.2 Deteksi Protein Menggunakan Teknik Microarray


Microarray protein hampir serupa dengan microarray DNA, terdiri atas spot
berukuran mikro dari antibodi, protein, atau peptida yang disusun pada sebuah chip.
Proteomik dengan microarray memiliki banyak keuntungan, diantaranya adalah
cepat, akurat, sensitif, dapat menganalisis ribuan analit dalam satu kali percobaan
serta jumlah sampel yang dibutuhkan relatif sedikit, baik jumlah material yang
disusun pada chip serta jumlah sampel yang harus dianalisis. Karena sampel yang
digunakan sedikit sehingga dapat meminimalkan jumlah reagen yang digunakan.
Perkembangan aplikasi microarray protein lebih lambat dibandingkan
microarray DNA karena adanya peningkatan komplesifitas protein. Sebagai contoh,
urutan asam nukleat berukuran hingga 50 pb dapat langsung diubah menjadi untai
komplementernya dan kekuatan ikatan antara keduanya pun dapat diketahui. Namun,
berbeda halnya dengan protein. Sejauh ini tidak ada persamaan matematika yang
dapat digunakan untuk mengkalkulasinya. Protein pasangan dan kekuatan ikatan yang
terbentuk ditentukan secara empiris. Lebih lanjut, asam nukleat lebih mudah disintesis
dan direplikasi. Sedangkan untuk sintesis peptida diperlukan biaya mahal dan protein
yang terekspresi sulit dimurnikan dan digandakan. Struktur dan sifat kimia yang
beragam menyebabkan satu teknik microarray tidak dapat digunakan untuk seluruh
protein.
Microarray protein dimulai dengan menempatkan larutan protein dari sumur
plate microtiter ke permukaan slide mikroskop. 40.000 unit protein, dengan diameter
150-250µL dapat dicetak pada slide mikroskop. Larutan protein diinkubasi dan
interaksi ikatan spesifik menempatkan komponen spesifik pada spot yang sesuai.
Protein yang saling berikatan dideteksi menggunakan luminecent atau radioisotop.
I. Array Printing
A. Chip atau Surface Array
Salah satu chip yang digunakan dalam microarray protein adalah FAST Slides
produksi Whatman. FAST Slides merupakan polimer berbasis nitroselulosa dengan
reprodusibilitas dan sensitifitas yang tinggi dalam uji microarray. Tidak seperti chip

11
lain, FAST Slides memiliki lapisan polimer tiga dimensi yang telah digunakan untuk
immobilisasi biomolekul selama beberapa dekade. Sifat material dan kombinasi
dengan area permukaan yang sangat luas dari struktur tiga dimensinya memberikan
kapasitas ikatan yang lebih tinggi dibanding struktur planar dan chip tiga dimensi
yang lainnya. Struktur tiga dimensinya memberikan respon yang linear antara jumlah
interaksi protein dan intensitas sinyal.

Gambar 2. Struktur Tiga Dimensi FAST Slides dari Analisis SEM, Perbesaran 10000x

FAST Slides dapat digunakan untuk mendeteksi interaksi protein-protein


(termasuk antigen-antibodi), protein-DNA, protein-RNA dan protein-ligan, baik di
bawah kondisi denaturasi ataupun tidak terdenaturasi. Studi proteomik dengan FAST
Slides pada umumnya digunakan untuk microarray protein di bawah kondisi tidak
terdenaturasi. Tidak seperti teknik blot, dengan menggunakan FAST Slides, protein
langsung disusun tanpa melewati tahap SDS-PAGE dan transfer elektron, yang dapat
mengakibatkan terjadi pengurangan aktivitas protein. Kontras dengan array
konvensional, sifat alami protein yang disusun dan dikeringkan pada matriks
nitroselulosa FAST Slides dapat senantiasa dipertahankan.

12
Gambar 3. Grafik Hasil Deteksi Protein dengan FAST Slides dan Film Nitroselulosa 2 Dimensi,
Diinkubasi dalam Larutan Rekombinan IL-6 pada Konsentrasi 2,5 mg/ml Menggunakan
Biotinilasi Anti-IL-6-Antibodi dan Streptavidin-Cy5

B. Buffers
Pada studi proteomik, diperlukan suatu pelarut yang sesuai untuk
mempertahankan sifat alami dari protein yang akan dianalisis. Karena itu, diperlukan
suatu buffer dengan pH dan kekuatan ionik yang sesuai, zat penstabilisasi seperti
inhibitor protease, khelator, dan lain-lain sebagainya. Pada umumnya, buffer yang
sering digunakan adalah PBS.
C. Buffer Tambahan
Beberapa studi proteomik memerlukan penambahan suatu detergen dan/atau
urea untuk merusak dinding sel atau kelarutan protein. Penggunan DMSO (Dimetil
Sulfat Oksida) pada umumnya tidak dianjurkan, dikarenakan tingginya konsentrasi
DMSO dapat memberi pengaruh negatif terhadap nitratselulosa dan bahkan
merusaknya. Penambahan DMSO yang masih diperbolehkan adalah konsentrasinya
tidak melebihi 5% dari total larutan.
D. Konsentrasi Protein
Konsentrasi protein dapat berbeda untuk satu protein yang satu dan yang lain.
Sebagai contoh, untuk studi antibodi, protein yang dispotkan ke chip memiliki
konsentrasi antara 250 dan 1000 µg/ml.

13
E. Waktu Pengeringan
Berdasarkan pengamatan telah diketahui bahwa ikatan protein terhadap
nitroselulosa (chip) akan meningkat sejalan dengan bertambah panjangnya waktu
pengeringan. Oleh karena itu, disarankan untuk menyimpan slide sehari semalam
dalam desikator pada suhu ruangan setelah proses arraying untuk memaksimalkan
kekuatan ikatan protein yang telah diarray.
F. Ukuran Spot
Pada umumnya, spot diusahakan sekecil mungkin untuk memberikan
kerapatan yang maksimal dan perbandingan sinyal terhadap background yang baik.

II. Assay Process

A. Attachment dan Blocking

Proses attachment yang sempurna hanya mengikat protein yang spesifik.


Namun, untuk memperoleh hal tersebut tidaklah mudah disebabkan beragamnya sifat
protein, misal dalam hal kepolaran, hidrofobisitas, muatan, ukuran dan struktur.
Proses attachment dapat berlangsung melalui mekanisme adsorpsi, afinitas ikatan
maupun ikatan kovalen. Mekanisme attachment secara adsorpsi adalah yang paling
mudah, dimana penempelan protein melalui gaya elektrostatis ataupun hidrofobik.
Chip yang biasa digunakan untuk adsorpsi protein yaitu poly(vinylidene
fluroide) (PVDF), nitrocelulose, polystirene atau poly-L-lysine yang dilapisis kaca
Seperti yang telah disebutkan, kesulitan dalam proses attachment protein adalah
terbentuknya ikatan dengan protein non spesifik. Untuk mencegahnya, diperlukan
suatu teknik blocking menggunakan suatu blocking agent, contohnya protein susu.
Teknik blocking lain yang dapat digunakan adalah penambahan larutan garam pekat,
surfaktan pekat, protein terdenaturasi atau pelapiasan chip dengan protein anionik.
Teknik blocking tersebut dapat mengurangi jumlah ikatan dengan protein non
spesifik. Walaupun demikian, kemungkinan untuk terbentuknya ikatan dengan protein
non spesifik masih ada. Dengan kata lain, tidak pernah diperoleh blocking yang
sempurna. Kesulitan lain adalah kemungkinan terjadinya pelepasan ikatan dengan
protein spesifik pada saat pencucian, terutama jika menggunakan larutan garam atau
surfaktan pekat.

14
Tabel 2. Beberapa Attachment Protein

Attachment yang diperoleh melalui mekanisme afinitas ikatan memiliki daya


ikat yang kuat dan selektifitas yang tinggi terhadap protein spesifik. Misalnya, ikatan
antara biotin dan avidin atau antara protein A dan IgG. Baik chip dan protein yang
akan ditempelkan, keduanya harus diderivatisasi terlebih dahulu dengan komponen
yang terlibat dalam interaksi biologis. Bila chip yang telah terderivatisasi resisten
terhadap adsorpsi protein non spesifik, maka background akan minimal sedangkan
intensitas dari ikatan spesifik akan meningkat.
Contoh derivatisasi adalah pelapisan chip dengan poli etilen glikol (PEG) yang
diderivatisasi dengan biotin atau septavidin. Antibodi yang mengandung biotin akan
terikat pada chip, sedangkan protein non spesifik akan dihilangkan oleh PEG.
Kelemahan dari tipe attachment ini adalah diperlukannya pekerjaan tambahan dalam
mempreparasi protein yang akan ditempelkan. Modifikasi pada tahap preparasi dapat
mengubah struktur alami protein tersebut.
Mekanisme attachment yang lain adalah berdasarkan ikatan kovalen. Protein
yang ditempelkan memiliki daya ikat yang paling kuat dibandingkan mekanisme
attachment lainnya. Daya ikat yang kuat ini memungkinkan untuk dilakukannya
perlakuan menggunakan hard surfactant untuk menghilangkan protein yang terikat

15
lemah dari chip. Reaksi antara gugus amin pada protein, baik dari residu lysin atau
gugus terminal amin, dengan gugus fungsi terimobilisasi, misalnya aldehida atau
suksinimida adalah metoda ikatan kovalen yang paling umum digunakan.
Pembentukan gugus aldehida pada permukaan chip melibatkan reaksi oksidasi
karbohidrat pada poliakrilamid atau agarosa serta ikatan silang gluteraldehida
terhadap poliakrilamid yang terimobilisasi atau aminoxilen. Contoh ikatan kovalen
lainya adalah molekul IgG yang terikat secara kovalen melalui reaksi oksidasi dengan
karbohidrat pada daerah Fc molekul membentuk aldehida dan mereaksikan aldehid
tersebut dengan hydrazide activated surface. Reaksi oksidasi terhadap antibodi
sebenarnya dapat merusak ikatan antigen. Mekanisme attachment secara kovalen
yang terbaik diperoleh dengan mereaksikan gugus amina protein dengan ikatan silang
gugus amina yang terimobilisasi.
Buffer yang biasa digunakan pada proses attachment adalah PBS (pH 7,2-7,5)
yang mengandung 0,05% Tween 20, 0,1% BSA dan zat aditif yang lain seperti
inhibitor protease. Waktu inkubasi biasanya selama 1-2 jam pada suhu ruangan untuk
studi antibodi.
G. Deteksi
Microarray protein dapat dideteksi menggunakan Enzyme-Linked
Immunosorbent assay (ELISA), deteksi radioisotop dan fluorosens baik secara
langsung maupun tidak langsung. Deteksi secara langsung menggunakan penandaan
langsung terhadap protein yang akan dianalisa. Sedangkang deteksi secara tidak
langsung melalui labelled-antibodi yang terikat terhadap protein yang dianalisis.
Deteksi secara tidak langsung umumnya menggunakan sandwich ELISA, dimana
antibodi monoklonal yang terikat pada plat mengikat antigen spesifik kemudian
antigen tersebut akan mengikat labelled-antibodi. Jumlah labelled-antibodi yang
terikat pada antigen menunjukkan jumlah antigen tersebut.

16
Gambar 4. Sandwich ELISA

Deteksi secara langsung ini paling efektif digunakan dalam microarray bila
hanya satu analit yang harus diidentifikasi, misalnya sebuah antigen tunggal atau
sebuah immunoglobulin. Antibodi kedua dapat dilabel menggunakan fluorosens atau
enzim yang menghasilkan senyawa luminesens.
Deteksi langsung terhadap protein yang akan dianalisis berguna untuk
mendeteksi protein nonantibodi dalam jumlah banyak. fluorosens adalah yang sering
digunakan. Namun, penandaan radioisotop adalah yang paling sesuai jika sejumlah
tertentu protein akan diinkubasi pada chip. Kelebihan penandaan menggunaan
radioisotop adalah tidak merusak struktur protein yang dilabel, seperti jika
ditambahkan senyawa fluorosens atau senyawa enzimatik.
Penandaan menggunakan flourosens lebih mudah dibandingkan menggunakan
radioisotop dan biasanya diperoleh dari ikatan kovalen antara gugus amina protein
dan gugus reaktif fluorophore terkonjugasi. Seperti N-hydroxysuccinimide. Penandaan
menggunakan fluorosens digunakan untuk mendeteksi protein suatu individu.
Kegunaan fluorosens adalah kemampuannya untuk mendeteksi banyak panjang
gelombang secara simultan dan perbandingan analit dengan jumlah sampel awal
secara kuantitatif.
deteksi yang lain adalah menggunakan spektrometri massa (MS). Tetapi ini
kurang efektif dikembangkan secara laboratorium. Teknik rolling cyrcle amplification
(RCA) merupakan teknik dengan sensitifitas tinggi yang ditunjukkan dengan
rendahnya limit deteksi. Teknik RCA ini dilakukan pada fasa padat untuk jumlah
protein lebih dari 100 lipatan. Pada deteksi secara tidak langsung, antibodi
ditempelkan dengan primer DNA dimana untai DNA diperpanjang menggunakan
RCA setelah antibodi terikat pada target. Oligonukleotida yang telah ditandai

17
berpasangan dengan komplementernya kemudian dihibridisasi untuk memperpanjang
untai DNA. Hasilnya adalah sinyal deteksi amplifikasi rata-rata.
Proses microarray protein menggunakan senyawa fluorosens ditunjukkan
pada Gambar 3.

Gambar 5. Microarray Protein


Dua buah sampel protein kompleks, protein standar dan protein tes ditandai
berturut-turut dengan senyawa fluorosens Cy3 dan Cy5, kemudian diinkubasi.
Senyawa fluorosens yang tidak terikat dengan protein kemudian dihilangkan dari
campuran. Kedua sampel kemudian digabungkan dan dipindahkan pada permukaan
chip. Setelah protein kedua sampel terikat secara kovalen pada spot yang sesuai
dengan ikatan protein spesifik, intensitas relatif sinyal dari fluorosens diukur.
Intensitas fluorosens menunjukkan ukuran kelimpahan protein. Penentuan intensitas
fluorosens sangat akurat dikarenakan ke dalam sampel ditambahkan suatu standar
internal untuk tujuan normalisasi.

2.3 Aplikasi Microarray


2.3.1 DNA Profilling
Salah satu aplikasi microarray DNA dalam biologis kanker adalah untuk
mempelajari proses metastasis pada tumor. Untuk beberapa kasus tumor, tumor yang
semula berada di dalam sel, kemudian berkembang dan menyebar ke organ lain,
misalnya tulang. Untuk mempelajari urutan DNA sebagai penyebab munculnya

18
metastasis tumor dapat dilakukan melalui teknik microarray DNA. Melalui suatu
teknik isolasi secara in vivo diperoleh sel tumor yang telah mengalami metastasis dan
urutan DNA tersebut kemudian dibandingkan dengan sel tumor yang belum
mengalami metastasis.
Studi microarray telah digunakan untuk mempelajari urutan DNA penyebab
metastasis tumor pada otak (Nishizuka et al., 2002). Aplikasi lain dari microarray
DNA adalah identifikasi dan analisis gen yang telah mengalami mutasi,
penelompokkan tumor, identifikasi biomarker tumor dan drug discovery.
2.3.2 Protein Profilling
Suatu array antigen, protein dan juga peptida berguna untuk studi mengenai
fungsi biologis protein dalam suatu organisme melalui suatu pengukuran interaksi
protein-protein, protein-asam nukleat, protein-molekul kecil, dan enzim-substrat.
Suatu array peptida dan protein juga dapat digunakan untuk menentukan respon imun
atau karakterisasi autoantigen dalam suatu penyakit autoimun. Contohnya, Robinson
et al. telah mengkoleksi dan menyusun ratusan peptida yang merupakan autoantigen
dalam sistem lupus erythematosus dan rhematoid arthritis. Setelah serum darah
diinkubasi pada chip, ikatan antibodi menunjukkan reaktivitas immunologis terhadap
protein yang bersangkutan. Penggunaan peptida arrays memberikan hasil yang lebih
baik untuk pemetaan dari penyebaran sisi autoreaktif. Sebagai tambahan, pola
penyebaran reaktifitas antigen pada individu dapat digunakan untuk merencanakan
proses perawatan/pengobatan terhadap penderita.

19
BAB III
PENUTUP

Microarrays DNA mendeteksi ekspresi pada tingkat genetik dengan cara


mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada ribuan gen terimobilisasi di atas permukaan
gelas (chip). Prinsipnya adalah mensintesis cDNA dari RNA yang diisolasi dari dua
kondisi yang berbeda (misal sel tumor dan sel normal), kemudian dilakukan
penandaan dengan menggunakan unsur radioaktif fluorosens multiwarna. cDNA yang
telah dilabeli ini kemudian dihibridisasi dengan sejumlah besar gen dari pustaka gen.
Hasil hibridisasi kemudian dianalisis dengan menentukan intensitas fluorosens relatif
untuk masing-masing gen dengan menggunakan scanner laser.
Microarrays DNA telah memberikan hasil yang luar biasa dalam pengukuran
tingkat ekspresi gen. Proteomik merupakan kelanjutan dari studi genomik pada sistem
biologi, mengenai protein yang diproduksi oleh sebuah sel serta fungsi fisiologisnya.
Studi proteomik jauh lebih rumit daripada studi genomik dikarenakan DNA
organisme bersifat konstan sedangkan protein setiap sel berbeda dari waktu ke waktu
tergantung pada pengaruh lingkungan dan stimultan. Microarray protein dimulai
dengan menempatkan larutan protein dari sumur plate microtiter ke permukaan slide
mikroskop. 40.000 unit protein, dengan diameter 150-250µL dapat dicetak pada slide
mikroskop. Larutan protein diinkubasi dan interaksi ikatan spesifik menempatkan
komponen spesifik pada spot yang sesuai. Protein yang saling berikatan dideteksi
menggunakan luminecent atau radioisotop.
Dengan adanya micoarray DNA dan protein ini dapat membantu manusia
dalam melakukan diagnosis, memonitor, dan memprediksi suatu penyakit,
menemukan dan mengembangkan obat baru serta menentukan pilihan obat yang
paling tepat untuk suatu penyakit dan pasien tertentu.

20
DAFTAR PUSTAKA

Albala, Joanna S., Ian Humpheiy-Smith.2003. Protein Arrays, Biochips and


Proteomic. University Of Utrecht: Marceld Ekkerin,Inc .

Augenlicht et al.. 1987. “Expression of Cloned Sequences in Biopsies of Human


Colonie Tissue and in Colonie Cells Induced to Differentiate In Vitro”. Cancer
Research, 47, 6017-6021.

Augenlicht et al.. 1991. ” Patterns of Gene Expression that Characterize


the Colonic Mucosa in Patients at Genetic Risk for Colonic Cancer”.
Proceedings National Academy of Sciences, 88, 3286-3289.

Augenlicht, LH, dan Kobrin. 1982. ” DE Cloning and Screening of Sequences


Expressed in A Mouse Colon Tumor”. Cancer Research, 42, 1088-1093.

Nishizuka I, et al.. 2002.”Analysis of Gene Expression Involved in Brain Metastasis


from Breast Cancer Using cDNA Microarray”. Breast Cancer, 9, 26-32.

Somasundaram, Kumaravel et al. 2002.” DNA Microarray Technology and its


Application in Cancer Biology”. Applied Genomic and Proteomic, 1, (2), 1-
10.

21