PHARMACY, Vol.11 No.

02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

AKTIVITAS FAGOSITOSIS MAKROFAG

DARI FRAKSI N-HEKSAN HERBA SAMBILOTO (Andrographis paniculata, (Burm.F) Nees)
TERHADAP MENCIT YANG DIINDUKSI VAKSIN HEPATITIS B

MACROFAG PHAGOCYTIC ACTIVITY OF N-HEXANE FRACTION OF ANDROGRAPHIS

HERBS (Andrographis paniculata, (Burm.F) Nees) IN MICE INDUCED BY HEPATITIS B
VACCINE

Mamik Ponco Rahayu

Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta

Jl. Letjen. Sutoyo, Mojosongo, Surakarta, Indonesia 57127
Email: pi_er@yahoo.co.id (Mamik Ponco Rahayu)

ABSTRAK

Herba sambiloto (Andrographis paniculata Burm. Nees) mengandung komponen

senyawa kimia yang mempunyai aktivitas sebagai imunomodulator. salah satu
kandungan zat aktifnya adalah andrographolida yang aktif sebagai hepatoprotektor.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas dari A. paniculata sebagai
imunomodulator terhadap mencit Balb/c yang telah diinduksi vaksin hepatitis B.
Ekstraksi herba sambiloto menggunakan alat Soxhlet dengan pelarut yang berseri.
Vaksin hepatitis B digunakan sebagai penginduksi mencit Balb/c. Sebagai tolak ukur
imunostimulator adalah peningkatan aktivitas fagositosis makrofag. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa tiga fraksi aktif dengan peningkatan aktifitas fagositosis makrofag
tertinggi sampai terendah yaitu F2, F3, dan F1. Hasil analisis fitokimia menunjukkan
kandungan golongan senyawa dari fraksi FI adalah terpenoid, F2 adalah steroid,
terpenoid, dan flavonoid; F3 dan F5 adalah terpenoid; serta fraksi F4 mengandung
alkaloid.

Kata kunci: hepatitis B, herba sambiloto (A. paniculata Burm. Nees), imunomodulator,
vaksin.

ABSTRACT

Andrographis herbs (Andrographis paniculata Burm. Nees) contains many active

compounds and showed imunomodulatory activity. One of its component,
andrograpolide, has hepatoprotector activity. Therefore, the aim of this study was to find
out the immunomodulator compounds from A. paniculata in the BALB/c mice induced by
hepatitis B vaccine. Andrographis herbs was extracted using Soxhlet by series of solvents.
The isolation process was guided by in vivo imunommodulatory activity in in Balb/c mice
induced by hepatitis B vaccine. The imunostimulant activity was assesed through the
phagocytic activity of macrophage. The most active extract was fractionated by vaccum
column chromatography and further phytochemically identified. The fraction enhanced
phagocyte activities of macrophage were F2, F3, and F1. The results of phytochemical

181
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

analysis showed that the group of compounds from F1 was terpenoid, F2 were steroid,
terpenoid, and flavonoid; F3 and F5 were terpenoid; and F4 was alkaloid.

Key words: andrographis herbs (Andrographis paniculata Burm. Nees), imunomodulator,

hepatoprotector, hepatitis B vaccine.

182
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

Pendahuluan terinfeksi dengan virus hepatitis B dan

Indonesia adalah negara yang membersihkan hati dari virus (American
mempunyai carrier hepatitis B terbanyak Liver Foundation, 2006). Ada 3
nomor tiga setelah Cina dan India. kemungkinan tanggapan kekebalan
Menurut WHO, Indonesia termasuk tubuh terhadap virus hepatitis B pasca
daerah hepatitis B yang endemis dengan periode akut. Pertama, jika tanggapan
tingkat penderita sedang dan berat. kekebalan tubuh lebih kuat, maka akan
Penderita hepatitis B sebagian besar terjadi pembersihan virus, dan pasien
akan sembuh dengan baik dan hanya sembuh. Kedua, jika tanggapan
sebagian kecil saja yang langsung kekebalan tubuh lemah, maka pasien
meninggal oleh ganasnya virus atau tersebut akan menjadi carrier inaktif.
karena ketahanan tubuh yang rendah. Ketiga, jika tanggapan tubuh bersifat
Sepersepuluh kasus hepatitis B akan intermediate (antara dua hal di atas)
berkembang menjadi hepatitis menahun maka penyakit akan terus berkembang
dan 20% penderita hepatitis kronik ini menjadi hepatitis B kronis.
dalam waktu 25 tahun sejak tertular Selama ini upaya pencegahan
akan mengalami sirosis hepatis dan terhadap hepatitis B telah dilakukan
karsinoma hepatoseluler. Sebagian dengan cara pemberian vaksin hepatitis
pasien hepatitis B menahun, penyakitnya B, namun Ediati et al. (2007) dalam
dapat menjadi tidak aktif lagi, namun penelitiannya menunjukkan bahwa
sebagian lagi akan terus memburuk vaksin hepatitis B ini dapat
dalam hitungan tahun. Pasien dengan menyebabkan berbagai reaksi yang
hepatitis menahun aktif inilah yang berbalikan seperti adanya nekrosis pada
memikul risiko komplikasi, yaitu menjadi pola histopatologinya, suddent death
sirosis atau menjadi kanker hati. Kedua infant syndrome (SIDS), mielitis, multiple
komplikasi ini umumnya berakhir dengan sclerosis, dan optic neuritis. Menurut
kematian (American Liver Foundation, pandangan sistem pengobatan
2006). tradisional obat-obat alam termasuk
Pengobatan hepatitis B dapat obat-obat nabati, dapat mèmpengaruhi
melalui immunomodulator meliputi mekanisme pertahanan alamiah tubuh.
semua bahan yang memacu respon imun Seiring dengan makin berkembangnya
untuk menghancurkan sel hati yang pemahaman mengenai respon imun

183
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

tubuh dalam menghadapi infeksi dapat menghambat pertumbuhan

maupun penyakit lain, makin Plasmodium falciparum secara in vitro
berkembang pula penelitian mengenai dengan sifat imunostimulan terhadap
komponen yang dapat mempengaruhi sekresi IFN-γ dan imunosupressan
respon imun tersebut. terhadap sekresi TNF-ά. Senyawa murni
Pemberian senyawa yang andrografolid mempunyai aktivitas
bersifat hepatoprotektif dan imunostimulan yang lebih rendah
imunostimulan diduga dapat daripada ekstrak sambiloto,
memperbaiki aktivitas dan mengurangi dimungkinkan ada senyawa-senyawa
efek samping akibat pemberian vaksin lain yang secara sinergis meningkatkan
hepatitis B. Ada beberapa obat respon imun mencit terhadap antigen sel
tradisional yang memiliki kedua aktivitas darah merah domba. Oleh karena itu
tersebut, salah satunya adalah tanaman dilakukan fraksinasi ekstrak sambiloto
sambiloto (Andrographis paniculata menggunakan pelarut yang berbeda
Ness) dengan kandungan aktifnya polaritasnya sehingga dapat diketahui
andrografolid. Senyawa andrografolid senyawa-senyawa aktif yang mempunyai
merupakan senyawa diterpen lakton, aktifitas sebagai imunomodulator.
memiliki berbagai aktivitas seperti Vaksin hepatitis B sebagai
penghambatan pertumbuhan tumor antigen dapat menginduksi produksi
melalui aktivasi limfosit T (Sheeja dan antibodi anti-HBs yang memberikan
Kuttan, 2007). Kapil et al., (1993) imunitas terhadap hepatitis B. Produksi
melaporkan andrografolid dan anti-HBs dapat ditingkatkan atau
andrografisid bersifat hepatoprotektif diturunkan oleh senyawa aktif yang
terhadap karbon tetraklorida yang terdapat dalam bahan alam. Dalam
bersifat toksik pada hepar tikus secara in penelitian ini digunakan vaksin hepatitis
vivo. Ekstrak sambiloto dapat B yang mengandung 5 µg/0,5 mL HbsAg
meningkatkan produksi IFN-γ dari mencit karena lebih aman dibanding dengan
yang divaksinasi dengan Salmonella virus hepatitis yang aktif. Makrofag juga
typhimurium. berperan pada reaksi imunologis tubuh,
Widyawaruyanti et al. (1999) dengan menelan, memproses, dan
melaporkan bahwa ekstrak non polar menyimpan antigen dan menyampaikan
dan semi polar dari herba sambiloto informasi kepada sel-sel berdekatan

184
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

secara imunologis kompeten (limfosit (hepatoprotektor). Bahan penyari: n-

dan sel plasma). Makrofag mempunyai heksana, etil asetat, metanol. Bahan KLT:
reseptor yang mengikat antibodi dan fase diam (silika gel GF254); fase gerak
menghancurkan antigen yang khas (toluen, n-heksana, etil asetat, metanol,
terhadap antibodi itu sehingga perlu kloroform). Bahan untuk makrofag:
dilakukan pengamatan terhadap media RPMI, pen-strep, fungizone, FBS,
peningkatan aktivitas dan kapasitas natrium bikarbonat, PBS, kloroform,
makrofag. metanol, cat Giemsa (Merck), sumuran
Hewan uji yang digunakan microplate, coverslip, lateks (diameter
dalam penelitian ini adalah mencit 3,0 µm, polimer dari polistirena, Sigma).
Balb/c, dengan pertimbangan mencit Alat
adalah binatang yang mempunyai Alat yang digunakan adalah
respon imun yang baik (Mangkuwidjojo, kromatografi kolom vakum, mikroskop
2003), dan galur Balb/c telah cahaya, timbangan Sartorius, vacuum
dikembangkan di Fakultas Farmasi UGM. rotary evaporator, cawan petri,
o
Tujuan dari penelitian ini untuk inkubator CO2 5% 37 C, gunting, pinset
mengetahui aktivitas senyawa-senyawa steril, spuit injeksi, haemositometer,
aktif imunomodulator yang diisolasi dari sentrifugator, mesin vortex, laminar air
ekstrak sambiloto terhadap terhadap flow, plate 96 well, kapiler berheparin,
mencit Balb/c yang diinduksi vaksin eppendorf tube, tip biru, tip kuning, alat-
hepatitis B. alat gelas yang lazim digunakan di
laboratorium.
Metode Penelitian Jalannya Penelitian
Bahan 1. Determinasi tanaman dan identifikasi
herba sambiloto
Bahan utama: herba sambiloto
Tahap pertama penelitian ini
diperoleh dari daerah Matesih,
adalah melakukan determinasi herba
Karanganyar dan mencit Balb/c (umur
sambiloto untuk memantapkan
kurang lebih 3 bulan, dengan berat
kebenaran dan kemurnian sampel
badan kurang lebih 20 g diperoleh di
yang digunakan dalam penelitian.
Laboratorium Farmakologi, Fakultas
Dengan memperhatikan ciri-ciri
Farmasi, UGM, Imboost®
morfologi yang ada dalam herba
(imunostimulator); curcuma plus®

185
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

sambiloto dengan menggunakan polaritasnya dari n-heksana, etil

petunjuk pustaka dibuktikan di asetat dan metanol secara soklet
Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, sesuai dengan prosedur dalam
B2P2TO2T Tawangmangu, Kecamatan sediaan galenik (Sarker et al., 2006).
Tawangmangu, Kabupaten 5. Fraksinasi ekstrak sambiloto
Karanganyar, Jawa Tengah. Pemisahan senyawa-senyawa
2. Pengumpulan bahan aktif dari ekstrak sambiloto dengan
Herba sambiloto diambil secara menggunakan kromatografi lapis tipis
keseluruhan mulai dari bagian atas (KLT) dan kromatografi kolom vakum
tanah sampai bunganya. Bagian (KKV). Fase diam yang digunakan
untuk daun yang diambil berwarna adalah silika gel GF254 dan sebagai
hijau gelap, bebas dari penyakit fase geraknya pelarut organik dan
ditandai dengan tidak adanya bercak- campurannya dengan polaritas yang
bercak hitam atau lubang. semakin meningkat. Prosedur
Pengambilan herba dilakukan pada pelaksanaan KLT dan KKV disesuaikan
sore hari. menurut Sarker et al. (2006). Hasil
3. Pengeringan dan penyerbukan fraksinasi yang mempunyai profil KLT
Bahan yang akan dikeringkan yang sama digabung dan ditandai
dicuci bersih di bawah air kran untuk sebagai fraksi untuk digunakan uji
menghilangkan kotoran dan cemaran, imunomodulator dengan uji aktivitas
setelah itu dipotong-potong fagositosis sel makrofag.
kemudian herba dikeringkan dengan Berdasarkan penelitian
dioven pada suhu 40 oC. Pengeringan sebelumnya, hasil pengukuran jumlah
dilakukan hingga diperoleh kadar air IgG dengan metode Elisa tak
< 5%. Bahan yang sudah kering langsung, ekstrak n-heksana
segera diserbuk dengan mesin dibanding kontrol positif dan ekstrak
penyerbuk, serbuk yang didapat yang lain mempunyai perbedaan yang
diayak dengan ayakan No. 40. signifikan. Tahap selanjutnya untuk
4. Pembuatan ekstrak herba sambiloto mengetahui fraksi aktif dari ekstrak n-
Ekstrak sambiloto diperoleh heksana dilakukan fraksinasi dengan
dengan penyarian bertingkat metode kromatografi kolom vakum.
menggunakan pelarut yang berbeda Sebelum dilakukan fraksinasi, ekstrak

186
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014
n-heksana diperiksa profilnya dengan
kromatografi lapis tipis (KLT)
menggunakan fase diam silika gel
GF254 nm dan fase gerak berupa
tunggal maupun campuran yaitu n-
heksana, etil asetat, dan metanol.
Fase diam yang digunakan untuk
fraksinasi adalah silika gel F254 tanpa
gypsum seberat 40 g dimasukkan ke
dalam kolom (20 cm x 5 cm)
kemudian di atasnya ditaburkan
ekstrak dalam bentuk serbuk. Elusi
dilakukan secara gradien dimulai dari
pelarut nonpolar sampai polar
sehingga diharapkan senyawa dapat
terpisah secara berurutan mulai dari
yang nonpolar sampai polar. Eluen
yang digunakan yaitu n-heksana; n-
heksana-etil asetat (9:1); n-heksana-
etil asetat (8:2); n-heksana-etil asetat
(7:3); n-heksana-etil asetat (6:4); n-
heksana-etil asetat (5:5); n-heksana-
etil asetat (4:6); etil asetat, etil
asetat-metanol (9:1); etil asetat-
metanol (8:2); etil asetat-metanol
(7:3); etil asetat-metanol (6:4); etil
asetat-metanol (5:5).
6. Persiapan hewan uji dan pengambilan
sampel uji
Sejumlah 30 ekor mencit sehat
umur ± 12 minggu berat ± 20 g dibagi
menjadi 3 kelompok @ 5 ekor yaitu
187
ISSN 1693-3591
kelompok I sebagai kelompok ekstrak
yang dibagi menjadi 3 grup @5 ekor
(ekstrak n-heksana, ekstrak etil
asetat, ekstrak metanol); kelompok II
@5 ekor sebagai kontrol positif
imunostimulator (Imboost®),
hepatoprotektor (curcuma plus®) dan
kelompok III @5 ekor sebagai kontrol
negatif (CMC 1%). Kelompok hewan
uji diaklimatisasi selama 1 minggu
sebelum diberi vaksin hepatitis B,
untuk kelompok hewan uji ekstrak
dengan pemberian peroral dengan
dosis 2,7 mg/20 g BB mencit Balb/c
sekali sehari masing-masing
kelompok. Setelah dikondisikan pada
semua kelompok dilakukan vaksinasi I
(dihitung sebagai hari ke-0 setelah 7
hari pengkondisian) dengan diberi
vaksin hepatitis B yang dilakukan
secara intraperitoneal. Vaksinasi
kedua dilakukan pada hari ke-28,
selama pemberian vaksin tetap diberi
perlakuan yang sama pada masing-
masing kelompok.
7. Uji aktivitas makrofag
a. Isolasi sel makrofag
Mencit yang sudah dibius dengan
kloroform, diletakkan dalam posisi
terlentang, kulit bagian perut
dibuka dan dibersihkan selubung
peritoneumnya dengan alkohol
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

70%. Mencit disuntikkan ± 10 ml menempel dalam coverslip.

medium RPMI-1640 dingin ke Suspensi sel yang telah dihitung,
dalam rongga peritoneum, tunggu diuji fagositosisnya dengan latexs
± 3 menit sambil ditekan-tekan antigen dan masing-masing
secara perlahan. Cairan peritoneal efektornya pada sumuran
diaspirasi dari rongga peritoneum microplate 24 yang telah diberi
dengan cara menekan organ coverslip bulat, setiap sumuran
dalam dengan 2 jari, cairan 200 µl. Suspensi sel diinkubasi 37
o
diaspirasi dengan spuit injeksi, C, 30 menit dalam inkubator 5%
dipilih pada bagian yang tidak CO2. Kemudian ditambahkan
berlemak dan jauh dari usus. medium RPMI komplit
Aspirat yang didapat ditampung 1ml/sumuran dan diinkubasi lagi
dalam tabung sentrifus dan selama 2 jam. Sel dicuci dengan
disentrifus pada 1.200 rpm, 4 oC RPMI 2x, kemudian ditambahkan
selama 10 menit. Supernatan medium komplit 1 ml/sumuran
dibuang, kemudian ditambahkan 3 dan diinkubasi lagi selama 24 jam,
ml RPMI komplit (mengandung kemudian dilakukan uji aktivitas
FBS 10%) pada pellet yang fagositosis makrofag dengan
diperoleh. Jumlah sel yang didapat metode lateks secara in vitro.
dihitung dengan menggunakan b. Uji aktivitas fagositosis makrofag
dengan metode lateks
hemositometer, kemudian
Uji kemampuan fagositosis non
diresuspensikan lagi dengan
spesifik dilakukan dengan
medium RPMI komplit sehingga
menggunakan latex beads
didapat suspensi sel dengan
diameter 3 µl. Latex beads
kepadatan 1,5 x 105/ml sel tiap
diresuspensikan dalam PBS
sumuran maka dibagi menjadi 24
sehingga didapat konsentrasi 2,5 x
sumuran, volume tiap sumuran
107/ml. Diambil media dengan
200 µl, sehingga diresuspesikan
cara menyedot sehingga tinggal
dengan media RPMI sebanyak
makrofag dalam coverslip. Masing-
4800 µl, sebelum dimasukkan
masing bahan uji ditambahkan
sumuran 200 µl penambahan
dalam media RPMI 400 µl dengan
coverslip dilakukan agar sel bisa

188
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

5 macam dosis, kontrol sesuai, didukung dengan pereaksi

imunostimulator, dan kontrol air- pendeteksi.
tween, direplikasi sebanyak 3 kali, 1. Analisis data
diinkubasi 4 jam. Kemudian Data yang diperoleh dievaluasi
ditambahkan 400 µl suspensi secara statistik yang melibatkan
lateks dalam PBS, diinkubasi semua kelompok perlakuan. Metode
dalam inkubator CO2 selama 60 statistik yang digunakan terlebih
menit. Media diambil dengan cara dahulu dilakukan uji normalitas dan
menyedot dan dicuci dengan PBS uji homogenitas varian. Jika data
3x untuk menghilangkan lateks dinyatakan normal dan homogen
yang tidak terfagositosis. maka digunakan uji ANOVA
Selanjutnya dilakukan dilanjutkan uji LSD, jika hasil yang
pengeringan pada suhu ruangan diperoleh sebaliknya maka digunakan
dan difiksasi dengan metanol analisis non-parametrik yaitu uji
selama 30 detik. Metanol dituang Kruskall Wallis dan dilanjutkan
dan ditunggu hingga kering, dengan uji Mann Whitney dengan
kemudian dicat dengan Giemsa taraf kepercayaan 95%.
20% selama 30 menit dan dicuci
dengan akuades kemudian Hasil dan Pembahasan
diangkat dari sumuran kultur dan Determinasi tanaman
dikeringkan pada suhu ruangan. Determinasi dalam penelitian ini
Setiap 100 sel makrofag yang dilakukan untuk mengetahui nama
memfagisitosis partikel latex di ilmiah tumbuhan dan urutan
hitung dengan menggunakan klasifikasinya dan meyakinkan
mikroskop cahaya dengan kebenaran tanaman yang diambil.
perbesaran 400x. Masing-masing Determinasi ini dilakukan di B2P2TO2T
konsentrasi yang diuji dilakukan Tawangmangu, Karanganyar. Hasil
replikasi tiga kali. determinasi adalah sebagai berikut:
8. Identifikasi senyawa 1b_2b_3b_4b_12b_13b_14b_17b_18b_
Identifikasi senyawa yang aktif 19b_20b_21b_22b_23b_24b_25b_25b_
dilakukan dengan KLT dengan fase 26b_27b_28b_29b_30b_31b_403b_404
diam silika gel GF254, fase gerak yang b_405b_414b_415b_451b_466b_467b_

189
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

468b_469b_470b_471a_472b_473b_478 fraksi 2. Senyawa terpenoid bukan

b_479b_480b_481a 187. dan mungkin hanya memiliki sedikit
Acanthaceae 1b_36b_39b_40b_ gugus kromofor sehingga deteksi
42a_43a_44a 37. Andrographis 1a tidak dapat dilihat secara jelas
Andrographis paniculata (Burm.F) Ness. dengan sinar visibel, UV254 dan UV365
Identifikasi kandungan kimia nm. Setelah disemprot dengan
Identifikasi kandungan kimia dari vanillin asam sulfat dan dipanaskan,
fraksi 1 sampai 5 menggunakan KLT nampak fraksi 2 mempunyai jumlah
dengan fase diam silika gel 60 GF254 nm bercak yang lebih banyak yaitu 4
dan selulosa dengan berbagai macam bercak dengan Rf masing-masing
eluen. Identifikasi yang dilakukan 0,38; 0,52; 0,67 dan 0,78. Fraksi 3 ada
terhadap senyawa golongan metabolit 3 bercak dengan Rf masing-masing
sekunder dari A. paniculata meliputi 0,11; 0,52; 0,94. Fraksi 1 hanya
terpenoid, steroid, flavonoid, dan muncul 1 bercak dengan Rf 0,94.
alkaloid. Warna spot setelah disemprot
a. Identifikasi kandungan terpenoid dengan vanillin asam sulfat sama
Senyawa terpenoid dapat dengan warna pembanding yaitu
dideteksi dengan pereaksi semprot merah violet, sehingga dari hasil ini
vanillin asam-sulfat memberikan fraksi 1, 2, dan 3 mengandung
warna merah sampai biru (Sarker et senyawa terpenoid. Banyaknya spot
al., 2006; Wagner, 1984). Identifikasi yang sama dengan pembanding
kualitatif terpenoid dengan fase gerak kemungkinan pada fraksi 2 dan 3 ada
toluen – etil asetat (93:7), sebagai beberapa tipe terpenoid. Gambar 1
pembanding digunakan thymol. merupakan gambar kromatogram
Berdasarkan hasil identifikasi secara hasil identifikasi kualitatif golongan
KLT terlihat senyawa thymol pada senyawa dari fraksi 5 dengan
UV254 menunjukkan peredaman, profil menggunakan pereaksi anisaldehid-
o
kandungan senyawa kimia dari asam sulfat pada suhu 110 C.
masing-masing fraksi dapat dilihat Tampak perubahan warna menjadi
pada Gambar 1, deteksi dengan UV254 ungu kebiruan pada bercak setelah
dan UV365 nm terlihat komponen disemprot dengan pereaksi
terbanyak ada di fraksi 3 kemudian anisaldehid-asam sulfat.

190
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591
1693

b. Identifikasi kandungan steroid Perubahan

erubahan warna terjadi setelah
Identifikasi kualitatif terhadap direaksikan
ksikan dengan Lieberman
golongan senyawa steroid dengan Burchard,, dari fraksi 1 sampai 4
fase gerak benzena – etil asetat menunjukkan warna spot yang
(65:35) dan sebagai pembanding sesuai dengan pembanding yaitu
ß-sitosterol
sitosterol (Stahl, 1969)
1969). merah violet hanya fraksi 2
2.
Profil kandungan senyawa Berdasarkan kesamaan ini
kimia dari masing
masing-masing fraksi kemungkinan steroid terdeteksi
dapat dilihat pada G
Gambar 3, hanya di fraksi 2 dengan Rf 0,76
deteksi dengan UV 254 dan 365 dan 0,82.
nm dengan reagen Lieberman
Burchard sebagai penyemprot.

a b c
Gambar 1. Identifikasi kualitatif terpenoid dengan sistem fase diam: silika gel
GF254 nm; fase gerak: toluen
toluena – etil asetat (93:7);
7); deteksi: a) UV254 b)
UV 365 nm c). vanillin asam sulfat.

c. Identifikasi golongan flavonoid kedua silika gel. Hasil masing

masing-masing
Identifikasi kualitatif terhadap kromatogram dapat dilihat pada Gambar
golongan senyawa flavonoid 4.
menggunakan dua macam fase diam Deteksi adanya senyawa golongan
yang pertama dengan selulosa dan flavonoid menurut Wagner (1984)
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591
1693

dengan reagen
agen amoniak dan sitroborat. nm warna bercak kuning dan setelah di
Berdasarkan hasil identifikasi terhadap uapi amonia warna
na menjadi lebih
golongan senyawa flavonoid kuning. Bercak terdeteksi hanya 1
diperkirakan hanya fraksi 2 yang dengan Rf 0,86.
,86. Total flavonoid setelah
mengandung flavonoid. Deteksi dengan ditetapkan kadarnya dengan
ngan TLC scanner
UV 254 nm terjadi peredaman, UV 365 diperoleh 1,97%.
1,97

Gambar 2. Identifikasi kualitatif terpenoid terhadap fraksi 5 dengan sistem fase diam:
diam
silika gel GF254 nm; fase gerak: toluena – etil asetat (93:7);
7); deteksi: a) UV254
b) UV365 nm c) aanisaldehida-H2SO4 (110 oC).

Gambar 3. Identifikasi kualitatif steroid dengan sistem fase diam: silika gel GF 254 nm;
fase gerak: benzena
enzena:etil asetat (65:35); deteksi: a) UV254 b) UV365 nm c)
Liebermann-Boucard.
Boucard.
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591
1693

Gambar 4 . Identifikasi kualitatif flavonoid dengan sistem fase diam:: silika gel GF254 nm;
Fase gerak: kloroform : etil asetat (1 : 1); deteksi a) UV254 b) UVV365 nm c)
sitroborat.

d. Deteksi golongan alkaloid setelah disemprot dengan D

Dragendroff
Identifikasi kualitatif golongan nampak warna jingga atau kuning
senyawa alkaloid dilakukan terhadap (Sarker et al., 2006 ). Profil kandungan
fraksi 4 dengan fase gerak kloroform : senyawa kimia dari fraksii 4 dapat dilihat
etil asetat (7:3) menggunakan pada Gambar 5. Fraksi 4 nampak warna
Dragendroff sebagai penyemprot. jingga dengan D
Dragendroff,
Deteksi alkaloid dikatakan positif jika dimungkinkan ada kandungan alkaloid.

Gambar 5. Identifikasi kualitatif alkaloid dengan sistem fase diam:: silika gel GF254 nm;
Fase gerak: kloroform : etil asetat (7:3); deteksi a) UV254 b) UV365 nm c)
Dragendroff.
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

Tabel 1. Hasil identifikasi golongan senyawa pada fraksi

Identifikasi Golongan Senyawa
No Fraksi
Terpenoid Steroid Flavonoid Alkaloid
1 Fraksi 1 + - - -
2 Fraksi 2 + + + -
3 Fraksi 3 + - - -
4 Fraksi 4 - - - +
5 Fraksi 5 + - - -
Keterangan : + = mengandung golongan senyawa
- = tidak mengandung golongan senyawa

Uji aktivitas imunostimulator terhadap memacu aktifitas makrofag yaitu dengan

fraksi
memfagositosisnya. Kemampuan sel
Uji aktivitas imunostimulator
makrofag untuk menempel pada
dilakukan pada 5 fraksi dari n-heksana
coverslips membedakannya dengan sel-
dengan pemberian dosis pada masing-
sel lainnya. Pengecatan dengan Giemsa
masing fraksi berbeda karena
akan memberikan warna pada makrofag
diperhitungkan berdasarkan rendemen
sehingga makrofag tampak berwarna
yang dihasilkan dari proses fraksinasi
keunguan sedangkan lateks tidak akan
terhadap dosis awal pemberian ekstrak.
berwarna, sehingga dapat digunakan
Semakin banyak ekstrak yang
untuk membedakan antara lateks yang
terfraksinasi maka pemberian dosis juga
terfagositosis dan yang tidak
akan semakin besar, sehingga dari sini
terfagositosis. Kemampuan fagositosis
dapat diketahui juga komponen yang
sel makrofag diukur dengan cara
dapat memberikan aktivitas.
menghitung peningkatan jumlah partikel
Uji aktivitas fagositosis sel makrofag
lateks intra-sel.
terhadap fraksi n-heksana
Uji kemampuan fagositosis Gambar 6 menunjukkan adanya
makrofag yang distimulasi oleh perbedaan aktivitas fagositosis lateks
pemberian fraksi dilakukan dengan oleh sel makrofag antara kelompok yang
menggunakan lateks sebagai bahan uji. diberi perlakuan dengan kelompok
Lateks merupakan makromolekul yang negatif. Gambar 6a terlihat adanya sel-
dianggap benda asing yang sangat sel makrofag yang lebih banyak
direspons baik oleh mencit maupun memfagositosis lateks dengan
manusia dan memiliki ukuran seperti membentuk pseudopodia dan fagosome
bakteri. Dengan adanya lateks akan

194
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591
1693

dibandingkan
dingkan gambar 6b
6 tidak memfagosit lateks.

Gambar 6. (a) Kultur sel makrofag dengan pemberian perlakuan dan (b) kultur sel
makrofag tanpa pemberian perlakuan.
perlakuan

Keterangan: F1= Fraksi 1 dosis 0,126 mg/20 g BB mencit Balb/c

F2= Fraksi 2 dosis 0,569 mg/20 g BB mencit Balb/c
F3= Fraksi 3 dosis 1,446
1, mg/20 g BB mencit Balb/c
F4= Fraksi 4 dosis 0,094
0, mg/20 g BB mencit Balb/c
F5= Fraksi 5 dosis 0,220
0, mg/20 g BB mencit Balb/c
®
Kontrol positif=
positif=Imboost dosis 0,65 mg/20 g BB mencit Balb/c

Gambar 7. Rata-rata
rata jumlah lateks yang difagosit oleh 100 makrofag.
makrofag

Perhitungan jumlah lateks yang yang bermakna (p<0,05)

05) antara
difagosit oleh 100 makrofag berdasarkan kelompok kontrol negatif dengan kelima
hasil uji anova satu arah
h dengan tingkat kelompok fraksi. Dari gambar histogram
kepercayaan 95%
% diperol
diperoleh perbedaan di atas dapat dilihat jumlah lateks yang
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

difagosit oleh 100 makrofag mempunyai ekstraseluler (mikroba) dan intraseluler

rata-rata yang berbeda-beda. Fraksi 2 (virus). Kemampuan fraksi ini dalam
mempunyai kemampuan terbesar untuk meningkatkan aktifitas fagositosis
meningkatkan jumlah lateks yang makrofag terhadap lateks lebih poten di
difagositosis oleh makrofag dengan banding Imboost® sebagai kontrol positif
rata-ratanya 397,00±17,52 kemudian dengan kandungan ekstrak echinacea
berturut-turut fraksi 3 (393,00 ±35,17), 250 mg.
fraksi 1 (329,00±30,41), fraksi 4 (297,33 Perbedaan aktivitas fagositosis
± 24,70) dan terakhir fraksi 5 kemungkinan dipengaruhi pemberian
(293,00±4,58). Analisis lanjutan dengan dosis yang berbeda dan sifat fisik-kimia
LSD untuk mengetahui perbedaan antar kandungan senyawa yang dihasilkan.
kelompok, fraksi 2 menunjukkan Fraksi 1 dengan kandungan terpenoid
perbedaan yang bermakna dengan mempunyai daya fagositosis yang lebih
semua kelompok perlakuan. Hasil uji ini rendah dibandingkan fraksi 2, meskipun
menunjukkan kelompok kontrol positif lebih tinggi dibandingkan dengan fraksi 4
(Imbost ®) berbeda secara bermakna dan 5 tetapi secara uji LSD tidak
dengan kelompok kontrol negatif tanpa menunjukkan perbedaan yang signifikan
pemberian ekstrak. Sehingga dapat sehingga kemungkinan belum bisa
dinyatakan bahwa penggunaan CMC 1% dikategorikan sebagai imunostimulator
sebagai pembawa ekstrak tidak karena efek yang ditimbulkan belum
mempengaruhi kemampuan fagositosis begitu jelas. Pemberian dosis yang kecil
lateks oleh makrofag. Fraksi 3 juga dari fraksi 1 kemungkinan
mempunyai kemampuan dalam mempengaruhi aktivitas sehingga belum
meningkatkan fagositosis lateks oleh mampu menunjukkan efek respon
makrofag akan tetapi fraksi 3 tidak imunnya apakah sebagai imunosupresor
menunjukkan hasil yang lebih rendah atau imunostimulator. Aktifitas dari
dibanding terhadap kontrol positif. fraksi 1 kemungkinan juga dipengaruhi
Kemampuan fraksi 2 untuk oleh sifat fisika-kimia dari senyawa
meningkatkan aktivitas fagositosis sel kimia. Makrofag dapat menghancurkan
makrofag kemungkinan menunjukkan sel-sel terinfeksi dan sel-sel tumor
peran sel tersebut dalam menghilangkan bekerjasama dengan antibodi. Aktivitas
dan membunuh benda asing secara ini disebut antibody dependent cell

196
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

mediate cytotoxicity (ADCC/sitotoksisitas kelompok perlakuan yang lain. Fraksi 1

dengan perantara sel yang tergantung mempunyai aktivitas hepatoprotektor
pada antibodi) (Weir, 1990). Fraksi 1 yang lebih tinggi jika dibandingkan
dengan jumlah IgG yang tertinggi dengan fraksi-fraksi yang lain dilihat dari
ternyata dapat meningkatkan aktifitas penghitungan jumlah inti piknotik.
fagositosis sel makrofag. Peningkatan Aktifitas dari fraksi 1 kemungkinan juga
aktivitas melalui respon imun yang dipengarui oleh sifat fisika-kimia dari
berbeda ini kemungkinan disebabkan senyawa kimia. Kemungkinan karena
opsonisasi. Efek opsonisasi yang kandungan terpenoid dari fraksi 1
diperantarai baik C3b maupun Fc akan sehingga mampu memberikan
menyebabkan terjadinya fagositosis dan penekanan terhadap reaksi peradangan.
perusakan oleh sel makrofag. Triterpen mempunyai aktivitas
Perbedaan aktivitas kemungkinan antiinflamasi melalui sistem imun
dipengaruhi oleh senyawa-senyawa yang dengan menekan sekresi iNOS sebagai
terkandung di masing-masing fraksi. pemacu makrofag. Fraksi 1 dengan
Hasil identifikasi secara kromatografi kandungan terpenoid mempunyai daya
lapis tipis dengan eluen yang sesuai dan fagositosis yang lebih rendah
berbagai pereaksi semprot di perkirakan dibandingkan fraksi 2, meskipun lebih
fraksi 1 mengandung golongan senyawa tinggi dibandingkan dengan fraksi 4 dan
terpenoid. F2 mengandung golongan 5 tetapi secara uji LSD tidak
senyawa terpenoid, steroid, dan menunjukkan perbedaan yang signifikan
flavonoid. F3 mengandung golongan sehingga kemungkinan belum bisa
senyawa terpenoid; F4 mengandung dikategorikan sebagai imunostimulator
golongan senyawa alkaloid dan karena efek yang ditimbulkan belum
terpenoid. Berdasarkan hasil identifikasi begitu jelas. Aktifitas dari fraksi 1
secara KLT terlihat bahwa fraksi 2 kemungkinan juga dipengarui oleh sifat
mempunyai jenis golongan senyawa fisika-kimia dari senyawa kimia. Fraksi 2
kimia yang terbanyak dibanding fraksi yang poten dalam mempengaruhi
yang lain, dimungkinkan ada efek aktifitas fagositosis kurang memiliki
sinergisme antar senyawa sehingga aktifitas yang tinggi dibanding fraksi 1,
fraksi 2 ini mempunyai aktifitas sebagai tetapi masih menunjukkan hasil yang
imunostimulator yang kuat dibanding berbeda secara bermakna dengan

197
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

kontrol positif dan negatif. Makrofag mengandung golongan senyawa

dapat menghancurkan sel-sel terinfeksi
dan sel-sel tumor bekerjasama dengan
antibodi. Aktivitas ini disebut ADCC
(Weir, 1990). Berdasarkan penelitian
sebelumnya (Rahayu, 2009) bahwa fraksi
2 dengan jumlah IgG yang tertinggi
ternyata dapat meningkatkan aktifitas
fagositosis sel makrofag. Peningkatan
aktivitas melalui respon imun yang
berbeda ini kemungkinan disebabkan
opsonisasi. Efek opsonisasi yang
diperantarai baik C3b maupun Fc akan
menyebabkan terjadinya fagositosis dan
perusakan oleh sel makrofag. Fraksi 2
yang poten dalam mempengaruhi
aktifitas fagositosis kurang memiliki
aktifitas yang tinggi dibanding fraksi 1,
tetapi masih menunjukkan hasil yang
berbeda secara bermakna dengan
kontrol positif dan negatif.
terpenoid. F2 mengandung golongan
senyawa terpenoid, steroid, dan
flavonoid. F3 mengandung golongan
senyawa terpenoid, F4 mengandung
golongan senyawa alkaloid dan
terpenoid. Perlu dilakukan penelitian
lebih lanjut mengenai aktivitas fraksi 2
sebagai pemacu fagositosis makrofag
secara in vivo, pemacu sekresi ROI
maupun NO, proliferasi limfosit.
Daftar Pustaka
American Liver Foundation, 2006.
Hepatitis B,
www.liverfoundation.org,
diakses tanggal 5 Februari 2008.
Ediati, S., 2007. The immunomodulatory
mechanism extract of Morinda
citrifolia L., fruit on
hepatocelluler carcinoma of
mice. International Conference
on Traditional Medicine and
Medicinal Plants, Surabaya, 8-9.

Kapil, I.B., Koul, S.K., Banerjee, dan

Kesimpulan
Gupta, B.D., 1993.
Fraksi n-heksana mempunyai Antihepatotoxic effect of major
diterpenoid constituent of
aktivitas sebagai imunostimulator
Andrographolid paniculata.
melalui aktifitas fagositosis makrofag. Biochemical Pharmacology, 46:
182-185.
Aktifitas tertinggi dalam meningkatkan
aktifitas makrofag dari tertinggi yaitu F2, Mangkuwidjojo, S., 2003. Pedoman
workshop teknologi dasar
F3, F1. Hasil identifikasi secara
antibodi monoclonal. Jogjakarta:
kromatografi lapis tipis dengan eluen Laboratorium Ilmu Hayati UGM.
yang sesuai dan berbagai pereaksi
Sarker, S.D., Latif, Z., dan Gray, A.I.,
semprot memperkirakan fraksi 1 2006. Natural products isolation,

198
PHARMACY, Vol.11 No. 02 Desember 2014 ISSN 1693-3591

Second Edition. New Jersey: Wagner, H., 1984. Immunostimulants of

Humana Press Inc. fungi and higher plants.
Springer-Verlag.
Sheeja, K., Kuttan, G., 2007. Activation of
cytotoxic T lymphocyte Widyawaruyanti, A., 1999. Uji
responses and attenuation of imunostimulan andrographolid
tumor growth in vivo by terhadap sekresi IFN-γ dan TNF-ά
Andrographis paniculata extract oleh sekresi limfosit T helper-1
and andrographolide. mencit dalam percobaan kultur
Immunopharmacol sel. Surabaya: Airlangga
Immunotoxicol, 29(1):81-93. University Library.

199