PERCOBAAN 5

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I. Tujuan
1. Mengenal dan memahami prinsip kromatografi lapis tipis (KLT)
2. Menerapkan metode KLT dalam identifikasi dan pemisahan senyawa dari
campurannya
II. Dasar Teori
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-
analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak.
Fase diam dapat berupa bahan padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam
bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat. Fase gerak biasanya
berupa gas atau cairan dengan perbandingan tertentu untuk mengelusi fase
diam. Jika gas digunakan sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai
kromatografi gas sedangkan pada kromatografi lapis tipis fase gerak yang
digunakan berbentuk cair.
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah tipe kromatografi cair yang fase
diamnya berupa lapisan tipis sorben partikel yang seragam dalam bentuk plat
gelas, aluminium atau plastik. Prinsip dasar KLT adalah larutan sampel
diaplikasikan ke dalam pelat, dan pelat dikembangkan dengan memasukkannya
ke dalam bejana tertutup dan bagian dasar dari bejana diisi dengan fase
geraknya (eluen) yang biasanya teridiri dari campuran dari beberapa pelarut.
Setelah pengembangan, pelat di angkat dari bejana dan ditandai untuk dihitung
nilai Rf-nya (perbandingan antara jarak pita yang terpisah dan jarak eluennya).
Eluen juga harus memenuhi persyaratan sebagai berikut:
1. Memiliki kemurnian yang cukup,
2. Stabil,
3. Memiliki viskositas rendah,
4. Memiliki partisi isotermal yang linier,
5. Tekanan uap yang tidak terlalu rendah atau tidak terlalu tinggi,
6. Toksisitas serendah mungkin
III. Alat
a. Oven
b. Plat KLT
c. Timbangan analitik
d. Pipa kapiler
e. Gelas beaker 100 mL
f. Lampu UV 254
g. Chamber
h. Gelas ukur
IV. Bahan
a. Campuran sulfonilamida
b. Eluen A (benzene:etil asetat:asam asetat = 80:18:2)
c. Eluen B (kloroform:methanol:asam asetat = 88:10:2)
d. Eluen C (Diklorometana:etanol = 50:50)
e. Pereaksi pDAB

V. Cara Kerja

1. Apabila pelat KLT belum aktif, diaktivasi dengan memanaskan di dalam oven
100°C selama 1 – 2 jam. Pelat tidak boleh tergores atau rusak.
2. Siapkan chamber yang bersih, dan eluen yang telah ditentukan sebanyak 50
ml. kemudian tutup rapat.
3. Masukkan eluen ke dalam chamber KLT kurang lebih setinggi 1 – 1.5 cm.
4. Siapkan pelat KLT yang telah diaktivasi.
5. Dengan pensil, secara hati-hati, beri garis 2 cm di atas permukaan pelat. Beri
titik pada garis tersebut dengan jarak titik 1.5 cm.
6. Totolkan standar pada titik tersebut, satu spot satu standar, dan selanjutnya
untuk sampel masing-masing kelompok.
7. Letakkan pelat KLT pada chamber yang sudah disiapkan dengan posisi spot
berisi standar dan sampel di bagian bawah. Pelat KLT harus diletakkan tegak
lurus dan tidak boleh miring.
8. Perhatikan elusidasi pada pelat KLT oleh fase gerak, angkat pelat ketika
elusidasi sudah mencapai 80 – 90% dari panjang pelat KLT, dan keringkan.
9. Periksa hasil elusidasi di UV.
10. Beri pewarnaan dengan pereaksi pDAB
11. Hitung Rf masing-masing spot pada pelat KLT.