Detail Penelitian Obat Bahan Alam

Judul Penelitian
Kandungan Kuersitrin pada Beberapa Jenis Benalu
Peneliti
Windi Gusviani
Asep Gana S.
Sukrasno
Abstrak
1. Uji respon imun
Dilakukan pada mencit BALB/c jantan. Dosis uji meliputi 1,5; 3,0; 30 mg/kg bb untuk daun
dewa serta 7,8; 15,6; dan 156 mg/kg bb untuk benalu teh, secara oral. Sebagai pembanding yang
bersifat imunostimulan digunakan Zymosin A dengan dosis 10 mg/kg bb secara intraperitoneal,
dan sebagai imunosupresi digunakan prednison 25 mg/kg bb secara oral.
2. Uji respon imun non spesifik
- uji aktivitas fagositosis system retikuloendotelial terhadap partikel karbon
Ekstrak uji dan pembanding diberikan pada mencit selama 5 hari. Pada hari ke-5 setelah
pemberian dilakukan penyuntikan koloid karbon (1,6 ml tinta Jerman pelican ditambahkan ke
dalam 8,4 ml larutan gelatin 1% b/v dalam NaCl 0,9 % b/v bebas pirogen) dengan dosis 0,1
ml/10 gr bb secara intravena. Darah mencit diambil sebelum penyuntikan koloid karbon dan
pada menit ke-3, 6, 9, 12, 15, dan 20 setelah penyuntikan kemudian dilisiskan menggunakan
asam asetat1 % v/v dan diukur transmitannya dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 675 nm. Dari data dihitung indeks fagositosis.
- uji aktivitas lisozim eksudat peritoneal dalam melisis E. coli
Mencit yang telah diberi ekstrak uji maupun pembanding selama 5 hari dikorbankan, kemudian
diisolasi eksudat peritonealnya dengan menggunakan larutan RPMI-1640. Eksudat peritoneal
yang diperoleh disonikasi selama 20 menit, lalu disentrifuga dengan kecepatan 5000 rpm pada
suhu –50oC selama 10 menit. Absorban supernatan sebelum dan setelah penambahan E. coli
ATCC 25922 (dibuat dengan menginokulasikan E. coli ATCC 25922 dalam nutrient Broth,
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, lalu dibuat suspensi dengan absorban 0,8 pada
panjang gelombang 405 nm) dengan masa inkubasi selama 10 menit diukur pada panjang
gelombang 405 nm, selanjutnya dihitung persen lisis bakteri.
- penimbangan bobot hati dan limpa
Mencit yang telah diberi ekstrak uji maupun pemanding selama 5 hari dikorbankan kemudian
diisolasi hati dan limpanya, dicuci, dikeringkan dan ditimbang.
- jumlah lekosit total
Mencit yang telah diberi ekstrak uji dan pembanding selama 5 hari diambil darahnya dan
dihomogenkan dalam larutan Turk (1 ml asam asetat glasial dan 1 ml larutan gentian violet 1%
b/v ditambah air suling sampai 100 ml, lalu disaring). Jumlah lekosit total dihitung dengan
menggunakan hemositometer dengan bantuan mikroskop
3. Uji respon imun spesifik
Sebagai antigen digunakan sel darah merah domba yang dibuat dengan cara menampung darah
segar domba dalam larutan Alsever (20,5 gr glukosa, 8 gr natrium sitrat, 4,2 gr asam sitrat
monohidrat dan 0,55 gr natrium klorida dilarutkan dalam 1 liter air suling, disterilisasi dengan
autoklaf pada suhu 121oC selama 30 menit), lalu dicuci 3 kali dengan NaCl 0,9% bebas pirogen.
Pelet darah dipisahkan dengan cara sentrifuga lalu dibuat suspensi dalam larutan dapar fosfat
0,15 M pH 7,2 yang mengandung 2.109 sel/ml. Dosis uji dan rute pemberian sama seperti uji
respon non spesifik. Ekstrak uji dan pembanding diberikan satu kali sehari selama 9 hari. Pada
hari ke-2 setelah pemberian ekstrak dimulai, mencit diimunisasi dengan sel darah merah domba
secara intraperitoneal.
- uji respon imun selular
Pada hari ke-7 pada mencit yang telah diimunisasi disuntikkan antigen yang sama sebagai
tantangan secara intradermal pada telapak kai kiri. Telapak kaki kanan mencit yang sama berlaku
sebagai kontrol. Pembengkakan kaki diukur sebelum, 24, dan 48 jam setelah penyuntikan
antigen tantangan menggunakan pletysmometer. Peningkatan volume kaki menunjukkan adanya
respon imun seluler.
- uji respon imun humoral
Mencit yang sama pada uji respon imun seluler sebelum diberi antigen tantangan pada hari ke-7
dan 14 diambil darahnya dan dipisahkan serumnya dengan cara sentrifuga. Serum yang diperoleh
sebelum pemberian antigen tantangan digunakan untuk penentuan titer antibody primer dan
serum yang diperoleh 7 hari setelah pemberian antigen tantangan digunakan untuk penentuan
titer antibodi sekunder. Penetuan titer antibodi total dilakukan dengan metode hemaglutinasi
menggunakan lempeng mikrotiter dengan dasar huruf V yang terdiri dari 8 baris A-H dan 12
kolom 1-12. Serum mencit yang berasal dari kelompok yang sama disatukan. Tiap serum diuji
triplo. Ke dalam sumur dari lempeng diisi 50 mikroliter dapar 0,15 M pH 7,2. Serum uji yang
telah diencerkan 1:6 dalam dapar fosfat yang sama ditempatkan pada kolom pertama baris yang
sesuai, selanjutnya dilakukan pengenceran 1:2 pada lempeng yang sama sampai pengenceran
terbesar pada kolom ke-12. Ke dalam tiap sumur yang berisi serum uji maupun kontrol
ditambahkan 25 µl antigen yang sama seperti digunakan pada imunisasi yaitu sel darah merah
domba. Hemaglutinasi yang terbentuk diamati secara visual setelah inkubasi 2 jam pada suhu
kamar. Pengenceran tertinggi yang memberikan hemaglutinasi menunjukkan titer antibodi total.
- uji aktivitas lisozim eksudat peritoneal mencit terimunisasi
Dilakukan untuk melihat interaksi respon imun spesifik dan non spesifik. Mencit diberi ekstrak
uji maupun pembanding selama 6 hari dan dimulai pada hari ke-8 setelah pemberian antigen
tantangan yaitu sel darah merah domba. Pada hari ke-4 selama pemberian ekstrak uji, dilakukan
penyuntikan paraffin cair secara intraperitoneal. Pada hari ke-7 dilakukan isolasi eksudat
peritoneal mencit dengan menggunakan larutan RPMI-1640 seperti pada penentuan uji aktivitas
lisozim eksudat peritoneal pada uji respon imun non spesifik.
Keterangan
Skripsi
Tahun
2002
Tempat Penelitian
Dept. Farmasi ITB
Kandungan Kimia
Hasil: kadar kuersitrin tertinggi dimiliki oleh Dendrophthoe pentandra (L) Miq. dari randu
sebesar 39,8 mg/g dan terendah dimiliki oleh Macroselon avenis (Blume) Danser dari teh sebesar
2,7 mg/g.
Uji Farmakologi
1. Uji respon imun

Dilakukan pada mencit BALB/c jantan. Dosis uji meliputi 1,5; 3,0; 30 mg/kg bb untuk daun
dewa serta 7,8; 15,6; dan 156 mg/kg bb untuk benalu teh, secara oral. Sebagai pembanding yang
bersifat imunostimulan digunakan Zymosin A dengan dosis 10 mg/kg bb secara intraperitoneal,
dan sebagai imunosupresi digunakan prednison 25 mg/kg bb secara oral.

2. Uji respon imun non spesifik

- uji aktivitas fagositosis system retikuloendotelial terhadap partikel karbon

Ekstrak uji dan pembanding diberikan pada mencit selama 5 hari. Pada hari ke-5 setelah
pemberian dilakukan penyuntikan koloid karbon (1,6 ml tinta Jerman pelican ditambahkan ke
dalam 8,4 ml larutan gelatin 1% b/v dalam NaCl 0,9 % b/v bebas pirogen) dengan dosis 0,1
ml/10 gr bb secara intravena. Darah mencit diambil sebelum penyuntikan koloid karbon dan
pada menit ke-3, 6, 9, 12, 15, dan 20 setelah penyuntikan kemudian dilisiskan menggunakan
asam asetat1 % v/v dan diukur transmitannya dengan menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 675 nm. Dari data dihitung indeks fagositosis.

- uji aktivitas lisozim eksudat peritoneal dalam melisis E. coli

Mencit yang telah diberi ekstrak uji maupun pembanding selama 5 hari dikorbankan, kemudian
diisolasi eksudat peritonealnya dengan menggunakan larutan RPMI-1640. Eksudat peritoneal
yang diperoleh disonikasi selama 20 menit, lalu disentrifuga dengan kecepatan 5000 rpm pada
suhu –50oC selama 10 menit. Absorban supernatan sebelum dan setelah penambahan E. coli
ATCC 25922 (dibuat dengan menginokulasikan E. coli ATCC 25922 dalam nutrient Broth,
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, lalu dibuat suspensi dengan absorban 0,8 pada
panjang gelombang 405 nm) dengan masa inkubasi selama 10 menit diukur pada panjang
gelombang 405 nm, selanjutnya dihitung persen lisis bakteri.

- penimbangan bobot hati dan limpa

Mencit yang telah diberi ekstrak uji maupun pemanding selama 5 hari dikorbankan kemudian
diisolasi hati dan limpanya, dicuci, dikeringkan dan ditimbang.

- jumlah lekosit total

Mencit yang telah diberi ekstrak uji dan pembanding selama 5 hari diambil darahnya dan
dihomogenkan dalam larutan Turk (1 ml asam asetat glasial dan 1 ml larutan gentian violet 1%
b/v ditambah air suling sampai 100 ml, lalu disaring). Jumlah lekosit total dihitung dengan
menggunakan hemositometer dengan bantuan mikroskop

3. Uji respon imun spesifik

Sebagai antigen digunakan sel darah merah domba yang dibuat dengan cara menampung darah
segar domba dalam larutan Alsever (20,5 gr glukosa, 8 gr natrium sitrat, 4,2 gr asam sitrat
monohidrat dan 0,55 gr natrium klorida dilarutkan dalam 1 liter air suling, disterilisasi dengan
autoklaf pada suhu 121oC selama 30 menit), lalu dicuci 3 kali dengan NaCl 0,9% bebas pirogen.
Pelet darah dipisahkan dengan cara sentrifuga lalu dibuat suspensi dalam larutan dapar fosfat
0,15 M pH 7,2 yang mengandung 2.109 sel/ml. Dosis uji dan rute pemberian sama seperti uji
respon non spesifik. Ekstrak uji dan pembanding diberikan satu kali sehari selama 9 hari. Pada
hari ke-2 setelah pemberian ekstrak dimulai, mencit diimunisasi dengan sel darah merah domba
secara intraperitoneal.

- uji respon imun selular

Pada hari ke-7 pada mencit yang telah diimunisasi disuntikkan antigen yang sama sebagai
tantangan secara intradermal pada telapak kai kiri. Telapak kaki kanan mencit yang sama berlaku
sebagai kontrol. Pembengkakan kaki diukur sebelum, 24, dan 48 jam setelah penyuntikan
antigen tantangan menggunakan pletysmometer. Peningkatan volume kaki menunjukkan adanya
respon imun seluler.

- uji respon imun humoral

Mencit yang sama pada uji respon imun seluler sebelum diberi antigen tantangan pada hari ke-7
dan 14 diambil darahnya dan dipisahkan serumnya dengan cara sentrifuga. Serum yang diperoleh
sebelum pemberian antigen tantangan digunakan untuk penentuan titer antibody primer dan
serum yang diperoleh 7 hari setelah pemberian antigen tantangan digunakan untuk penentuan
titer antibodi sekunder. Penetuan titer antibodi total dilakukan dengan metode hemaglutinasi
menggunakan lempeng mikrotiter dengan dasar huruf V yang terdiri dari 8 baris A-H dan 12
kolom 1-12. Serum mencit yang berasal dari kelompok yang sama disatukan. Tiap serum diuji
triplo. Ke dalam sumur dari lempeng diisi 50 mikroliter dapar 0,15 M pH 7,2. Serum uji yang
telah diencerkan 1:6 dalam dapar fosfat yang sama ditempatkan pada kolom pertama baris yang
sesuai, selanjutnya dilakukan pengenceran 1:2 pada lempeng yang sama sampai pengenceran
terbesar pada kolom ke-12. Ke dalam tiap sumur yang berisi serum uji maupun kontrol
ditambahkan 25 µl antigen yang sama seperti digunakan pada imunisasi yaitu sel darah merah
domba. Hemaglutinasi yang terbentuk diamati secara visual setelah inkubasi 2 jam pada suhu
kamar. Pengenceran tertinggi yang memberikan hemaglutinasi menunjukkan titer antibodi total.

- uji aktivitas lisozim eksudat peritoneal mencit terimunisasi

Dilakukan untuk melihat interaksi respon imun spesifik dan non spesifik. Mencit diberi ekstrak
uji maupun pembanding selama 6 hari dan dimulai pada hari ke-8 setelah pemberian antigen
tantangan yaitu sel darah merah domba. Pada hari ke-4 selama pemberian ekstrak uji, dilakukan
penyuntikan paraffin cair secara intraperitoneal. Pada hari ke-7 dilakukan isolasi eksudat
peritoneal mencit dengan menggunakan larutan RPMI-1640 seperti pada penentuan uji aktivitas
lisozim eksudat peritoneal pada uji respon imun non spesifik.

Ekstrak benalu teh dosis 15,6 dan 156 mg/kg bb meningkatkan aktivitas fagositosis yang paling
tinggi dengan indeks fagositosis k >1,3 (termasuk imunostimulan) dengan efek imunostimulasi
lebih rendah dibanding zymosan A (k>1,5).
Ekstrak benalu teh dosis 7,8; 15,6 dan 156 mg/kg bb dan daun dewa 30 mg/kg bb serta zymosan
A meningkatkan bobot hati namun secara statistik tidak bermakna dibanding kontrol. Ekstrak
benalu teh dosis 15,6 dan 156 mg/kg bb meningkatkan bobot limpa yang bermakna (P<0,05) dan
sebanding dengan peningkatan bobot limpa akibat pemberian zymosan A. Maka diduga ekstrak
mempunyai efek stimulasi pada respon imun spesifik.
Ekstrak benalu teh dosis 15,6 dan 156 mg/kg bb dan daun dewa 30 mg/kg bb dapat
meningkatkan persen lisis bakteri E. coli namun secara statistik tidak bermakna dibanding
kontrol. Penurunan dosis menurunkan persen lisis. Aktivitas ekstrak terhadap aktivitas
fagositosis sistem retikuloendotelial kurang, maka diduga ekstrak uji kurang berkhasiat terhadap
respon imun non spesifik.
Ekstrak benalu 156 mg/ kg bb dan daun dewa dosis 1,2 dan 3,0 mg/kg bb meningkatkan
peningkatan jumlah lekosit total yang bermakna (P<0,05) dibanding kontrol, sebanding dengan
akibat pemberian zymosan A. Ekstrak benalu 15,6 mg/kg bb dan daun dewa 30 mg/kg bb
meningkatkan jumlah lekosit sangat bermakna (P<0,01) dibanding kontrol, sebanding dengan
akibat pemberian zymosan A.
Pada waktu 24 dan 48 jam setelah penyuntikan antigen tantangan, ekstrak benalu teh dosis 7,8
dan 156 mg/kg bb serta daun dewa 30 mg/kg bb menyebabkan pembengkakan kaki mencit yang
bermakna (P<0,05), sedang ekstrak benalu teh 15,6 dan daun dewa 1,5 dan 3 mg/kg bb
menyebabkan pembengkakan kaki yang sangat bermakna. Hal ini berati ekstrak benalu dan daun
dewa dapat menstimulasi respon imun spesifik.
Ekstrak benalu dosis 7,8 dan 15,6 mg/kg bb serta daun dewa dosis 1,5; 3; dan 30 mg/kg bb
menyebakna peningkatan titer antibodi yang lebih tinggi dibanding kontrol, artinya ekstrak ini
dapat menstimulasi respon imun selular.
Persen lisis bakteri E. coli mencit yang terimunisasi meningkat secara bermakna setelah
pemberian ekstrak benalu 15,6 mg/kg bb. Secara tidak langsung terlihat ada interaksi sel T dan
makrofag.

Bagi mereka yang mengutip hasil penelitian ini wajib menuliskan sumbernya Sekolah Farmasi
ITB http://bahan-alam.fa.itb.ac.id