Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2015 Edit

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)
SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
FARMASI
Program Studi Farmasii

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Tim Penyusun :
Puteri Amelia, M.Farm., Apt
Saiful Bahri, M.Si
Eka Putri., M.Si., Apt
Prof. Dr. Atiek Soemiati, MS., Apt
TAHUN 2016
PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
TIM PENYUSUN :
Puteri Amelia, M.Farm., Apt

Saiful Bahri, M.Si
Eka Putri., M.Si., Apt
Prof. Dr. Atiek Soemiati, MS., Apt
Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif hidayatullah
Jakarta
2 0 16
Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 2

KATA PENGANTAR
Alhamdulillaahirobbil’aalamiiin, Puji syukur kehadirat Allah SWT sehingga buku

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta ini selesai disusun.
Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi diadakan untuk membantu

mahasiswa dalam melaksanakan praktikum Mikrobiologi Farmasi sehingga
diharapkan dapat menunjang pemahaman mahasiswa terhadap teori-teori yang telah
diberikan dalam perkuliahan dan menemukan korelasi antara ilmu yang mereka
pahami dengan praktek di lapangan.
Penuntun praktikum ini disusun sedemikian rupa agar kebih rinci dan sistematis, juga
dilengkapi dengan gambar sehingga memudahkan mahasiswa memahami dan
mempersiapkan diri sebelum melakukan kegiatan praktikum. Materi yang disajikan
dalam Penuntun praktikum ini mencakup teknik dasar yang lazim dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi Farmasi pada umumnya.
Harapan kami, buku ini dapat bermanfaat bagi mahasiswa yang melaksanakan
praktikum mikrobiologi farmasi serta bagi mahasiswa yang memerlukannya. Segala
kritik dan saran yang bersifat membangun tentang isi buku ini sangat dihargai demi
perbaikan kualitas lebih lanjut.
Jakarta, Februari 2016
Tim Penyusun

TATA TERTIB
Demi kelancaran pelaksanaan praktikum mikrobiologi, praktikan diwajibkan

mematuhi tata tertib berikut ini :
a. Praktikan diwajibkan memakai jas laboratorium sebelum memasuki
laboratorium dan dilepas di luar laboratorium.
b. Praktikan wajib memakai sepatu pada saat praktikum.Praktikan dilarang
berbicara yang tidak perlu dan membuat gaduh.
c. Memakai pakaian yang sopan pada saat praktikum (praktikan wanita tidak
diperbolehkan menggunakan celana jeans ketat, jilbab dimasukkan ke
dalam jas lab).
d. Praktikan yang datang terlambat lebih dari 20 menit tidak diperkenankan
mengikuti praktikum.
e. Tidak akan diadakan praktikum khusus bagi praktikan yang tidak mengikuti
praktikum sesuai jadwalnya.
f. Praktikan menyerahkan tiket masuk berupa alur kerja kegiatan praktikum
sebelum masuk ke laboratorium kepada asisten praktikum untuk
selanjutnya diberi paraf.
g. Pre-Test akan dilaksanakan pada awal praktikum untuk mengetahui sejauh
mana persiapan praktikan terhadap penguasaan materi praktikum.
h. Praktikan akan dinilai keterampilannya selama praktikum dan akan
diakumulasikan dengan nilai Pre-test dan Laporan praktikum, sehingga
menjadi nilai formatif.
i. Laporan sementara dibuat pada saat praktikum dan akan dimintakan
persetujuan Assisten/Dosen pembimbing sebelum praktikum selesai.
Laporan Akhir Praktikum harus dibawa saat masuk pada praktikum
berikutnya.
j. Setelah praktikum selesai, praktikan :
a. Membuang cairan ditempat yang disediakan.
b. Menjaga kebersihan meja dengan menyemprotkan alkohol dan
mengeringkan dengan kain bersih.
c. Mengecek kembali peralatan yang telah disediakan dan
mengembalikan ketempat semula.
d. Mengganti kerusakan alat yang telah dirusakkan dengan spesifikasi
sama paling lambat 1 minggu menjelang ujian akhir praktikum.
11. Aturan/tata tertib yang belum tercantum disampaikan kemudian.

DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR .............................................................................................. 3
TATA TERTIB PRAKTIKUM ................................................................................... 4
DAFTAR ISI ........................................................................................................... 5
1. Pengenalan Alat-alat Dasar dalam Mikrobiologi ............................................. 6
2. Sterilisasi dan Pembuatan Media ..................................................................... 23
3. Teknik Pemindahan Kultur Biakan Mikroorganisme .......................................... 40
4. Pembuatan Preparat Kering dan Pewarnaan Sel Bakteri …................................ 48
5. Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme ……………………………………………………………… 58
6. Enumerasi Mikroorganisme ............................................................................... 67
7. Isolasi Mikroorganisme dari Lingkungan ......................................................... 73
8. Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme ............ 86
9. Aktivitas Biokimia dari Mikroorganisme …...................................................... 92
10. Uji Sterilitas Sediaan Farmasi ....................................................................... 102
11. Pengendalian Mikroorganisme ....................................................................... 108
12. Uji Aktivitas Antimikroba Metode Dilusi …………............................................. 115
13. Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak Sampel ….................................................. 123
14. Mikrobiologi Produk Pangan ………………………………………………………………………… 130
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………….………………………………… 141

Praktikum 1
PENGENALAN ALAT – ALAT DASAR

DALAM MIKROBIOLOGI
TUJUAN : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap alat yang umum
digunakan dalam praktikum mikrobiologi.
LANDASAN TEORI
Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu diketahui :
2. Alat Gelas dan
3. Alat Non Gelas
1. Alat-alat elektrik keramik
a) Mikroskop cahaya a) Cawan Petri a) Jarum inokulum/ose
b) Autoklaf elektrik b) Pipet ukur b) Pinset
c) Incubator c) Pipet tetes c) Rubber bulb
d) Hot plate & stirrer d) Tabung reaksi d) pH meter universal
e) Colony counter e) Labu Erlenmeyer
g) Mikropipet g) Mortar & pestle
h) Beaker glass
i) Buncen burner
j) Gelas ukur
k) Batang L/Drigalsky
l) Tabung durham
1.a. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope)

Mikroskop cahaya merupakan salah satu alat untuk melihat sel
mikroorganisme. Sel bakteri yang tidak dapat dilihat dengan mata telanjang dapat
kita lihat dengan menggunakan mikroskop cahaya.
Berikut merupakan pejelasan tentang cara bagian-bagian dan spesifikasi mikroskop

cahaya yang tersedia di prodi Farmasi FKIK UIN Jakarta

Bagian-bagian Mikroskop:
1. Lensa okuler, digunakan ntuk memperbesar bayangan yang dibentuk lensa
objektif
2. Pemutar lensa objektif, digunakan untuk memutar objektif sehingga mengubah
perbesaran
3. Tabung pengamatan/tabung okuler
4. Meja benda, digunakan untuk meletakkan Spesimen
5. Kondensor, digunakan untuk mengumpulkan cahaya supaya tertuju ke lensa
objektif
6. Lensa objektif, digunakan untuk Memperbesar spesimen
7. Pengatur kekuatan lampu, digunakan untuk memperbesar dan memperkecil
cahaya lampu
8. Tombol on-off
9. Cincin pengatur diopter, digunakan untuk menyamakan focus antara mata kanan
dan kiri
10. Pengatur jarak interpupillar
11. Penjepit kaca objek
12. Sumber cahaya
13. Sekrup pengatur vertikal, digunakan untuk menaikkan atau menurunkan object
glass
14. Sekrup pengatur horizontal, digunakan untuk menggeser ke kanan/kiri objek glas
15. Sekrup fokus kasar, digunakan untuk Menaik turunkan meja benda (untuk

mencari fokus) secara kasar dan cepat
16. Fine focus knob (sekrup fokus halus)
Menaik turunkan meja benda secara halus dan lambat
17.Observation tube securing knob (sekrup pengencang tabung okuler)
18. Condenser adjustment knob (sekrup pengatur kondenser)
Untuk menaik-turunkan kondenser
Cara Menggunakan Mikroskop :

1. Lampu dinyalakan
a. tekan tombol on (8)
b. Kekuatan lampu diatur dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan objek pada meja benda
a.Objek glas diletakkan diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika
meja benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b. Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan
diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup vertikal dan
horizontal (13) dan (14).
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x lalu putar sekrup
kasar (15) sehingga meja benda bergerak ke atas untuk mencari fokus.
b.Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2) pada perbesaran
selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x. Kemudian putar sekrup halus (16) untuk
mendapatkan fokusnya
c.Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi.
1.b.Autoklaf (Autoclave)
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang
digunakan dalam mikrobiologi dengan menggunakan uap air panas bertekanan.
Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu
121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon
tiap inchi (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan
biasanya 15 menit untuk 121oC.

Diagram autoklaf vertical :
1. Tombol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran uap
3. pengukur tekanan
4. kelep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termometer
7. Lempeng sumber panas
8. Aquades (dH2O)
9. Sekrup pengaman
10. batas penambahan air
Cara Penggunaan :
1.Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.
Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas
tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan
karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan.
Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.
3.Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap
yang keluar dari bibir autoklaf.
Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
4. Nyalakan autoklaf, timer diatur dengan waktu minimal 15 menit, suhu 121oC.
5.Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf
dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup

(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak
tekanan mencapai 2 atm.
6.Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati.
1.c. Inkubator (Incubator)

Inkubator adalah alat untuk
menginkubasi atau memeram mikroba pada
suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi
dengan pengatur suhu dan pengatur waktu.
Kisaran suhu untuk inkubator produksi
Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70oC.
1.d. Hot plate stirrer dan Stirre bar

Hot plate stirrer dan Stirrer bar (magnetic
stirrer) berfungsi untuk menghomogenkan suatu
larutan dengan pengadukan. Pelat (plate) yang
terdapat dalam alat ini dapat dipanaskan sehingga
mampu mempercepat proses homogenisasi.
Pengadukan dengan bantuan batang magnet

Hot plate dan magnetic stirrer seri SBS-100 dari SBS®
misalnya mampu menghomogenkan sampai 10 L,
dengan kecepatan sangat lambat sampai 1600 rpm
dan dapat dipanaskan sampai 425oC.
1.e. Colony counter

Alat ini berguna untuk membantu perhitungan jumlah koloni yang tumbuh
setelah melalui masa inkubasi. Alat ini dilengkapi kaca pembesar dengan skala/
kuadran. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang
dapat di-reset.

1.f. Biological Safety Cabinet
Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow (LAF)
adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC mempunyai pola
pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasi sinar UV
beberapa jam sebelum digunakan.
Prosedur penggunaan BSC pada laboratorium mikrobiologi adalah sebagai

berikut:
1. Hidupkan lampu UV selama 2 jam, selanjutnya matikan segera sebelum mulai
bekerja.
2. Pastikan kaca penutup terkunci dan pada posisi terendah
3. Nyalakan lampu neon dan blower
4. Biarkan selama 5 menit
5. Cuci tangan dan lengan dengan sabun gemisidal / alkohol 70 %.
6. Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70% atau desinfektan yang cocok
dan biarkan menguap.
7. Masukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, jangan terlalu penuh (overload)
karena memperbesar resiko kontaminan
8. Atur alat dan bahan yang telah dimasukan ke BSC sedemikian rupa sehingga
efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang steril.
9. Jangan menggunakan pembakar Bunsen dengan bahan bakar alkohol tapi
gunakan yang berbahan bakar gas.
10.Kerja secara aseptis dan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas
kerja.
11.Setelah selesai bekerja, biarkan 2-3 menit supaya kontaminan tidak keluar dari
BSC.
12.Usap permukaan interior BSC dengan alkohol 70 % dan biarkan menguap
lalu tangan dibasuh dengan desinfektan.
13. Matikan lampu neon dan blower

1.g. Mikropipet (Micropippete) dan Tip
Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup
kecil, biasanya kurang dari 1000 µL. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet,
misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable volume
pipette) antara 1 µL sampai 20 µL, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya,
hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya mikropipet 5 µL.
Dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.
Cara Penggunaan :
1.Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk
memastikan lancarnya mikropipet.
2. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet.
3.Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama/first stop, jangan ditekan lebih ke
dalam lagi.
4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm.
5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb Knob
maka cairan akan masuk ke tip.
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.
7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan
semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan maka tip
akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat tambahan
yang berfungsi mendorong tip keluar.

2.a. Cawan Petri (Petri Dish)
Cawan petri berfungsi untuk membiakkan
(kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat
dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagian
atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam
berbagai macam ukuran, diameter cawan yang
biasa berdiameter 15 cm dapat menampung
media sebanyak 15-20 mL, sedangkan cawan
berdiameter 9 cm diisi media sebanyak 10 mL.
2.b. Pipet Ukur (Measuring Pippete)

Pipet ukur merupakan alat untuk
memindahkan larutan dengan volume yang
diketahui. Tersedia berbagai macam ukuran
kapasitas pipet ukur, diantaranya pipet
berukuran 1 mL, 5 mL dan 10 mL.
Cara penggunaanya adalah cairan disedot

dengan pipet ukur dengan bantuan filler sampai
dengan volume yang diinginkan.
Volume yang dipindahkan dikeluarkan mengikuti
skala yang tersedia (dilihat bahwa skala harus tepat sejajar dengan mensikus cekung
cairan) dengan cara menyamakan tekanan filler dengan udara sekitar.
2.c. Pipet tetes (Pasteur Pippete)

Fungsinya sama dengan pipet ukur, namun volume
yang dipindahkan tidak diketahui. Salah satu
penerapannya adalah dalam menambahkan HCl / NaOH
saat mengatur pH media, penambahan reagen ada uji
biokimia, dll.
2.d. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)

Di dalam mikrobiologi, tabung reaksi digunakan untuk
uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi
dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reaksi dapat
berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau aluminium foil.
Media padat yang dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur
menjadi 2 bentuk menurut fungsinya, yaitu media agar tegak
(deep tube agar) dan agar miring (slants agar).

Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media
yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu sempit atau tidak
terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena
memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alasan efisiensi, media yang ditambahkan
berkisar 10-12 mL tiap tabung.
2.e. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

Berfungsi untuk menampung larutan, bahan atau cairan.
Labu Erlenmeyer dapat digunakan untuk meracik dan
menghomogenkan bahan-bahan komposisi media, menampung
akuades, kultivasi mikroba dalam kultur cair, dll. Terdapat
beberapa pilihan berdasarkan volume cairan yang dapat
ditampungnya yaitu 25 mL, 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL,
1000 mL, dsb.
2.f. Gelas ukur (Graduated Cylinder)

Berguna untuk mengukur volume suatu cairan, seperti labu erlenmeyer, gelas
ukur memiliki beberapa pilihan berdasarkan skala volumenya. Pada saat mengukur
volume larutan, sebaiknya volume tersebut ditentukan berdasarkan garis cekung
larutan.
2.g. Batang L (L Rod)

Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya
bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini juga disebut
spreader.

2.h. Mortar dan Pestle
Mortar dan penumbuk (pastle) digunakan
untuk menumbuk atau menghancurkan materi
cuplikan, misal daging, roti atau tanah sebelum
diproses lebih lanjut.
2.i. Beaker Glass

Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak fungsi. Di
dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi media
media, menampung akuades dll..
2.j. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)

Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah
pembakar bunsen. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen
dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran
udara tersebut.
Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api
yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api
yang berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat
menggunakan bahan bakar gas atau metanol.
2.k. Tabung Durham

Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya
lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat
metabolisme pada bakteri yang diujikan. Penempatannya terbalik dalam tabung
reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).
3.a. Jarum Inokulum
Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk
ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya
terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga dapat berpijar
jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran
(loop) dan disebut ose atau inoculating loop/transfer loop, dan yang
berbentuk lurus disebut inoculating needle/Transfer needle.

Inoculating loop cocok untuk melakukan streak dipermukaan agar, sedangkan
inoculating needle cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak
(stab inoculating). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat membelah agar
untuk preprasi Heinrich’s Slide Culture.
3.b. Pinset
Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk
mengambil benda dengan menjepit misalnya saat
memindahkan cakram antibiotik.
3.c. Indikator Universal

berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini
sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media berpengaruh
terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH indikator dicelupkan sampai tidak
ada perubahan warna kemudian strip warna dicocokkan dengan skala warna
acuan.

HASIL
Tabel 1. Pengenalan dan fungsi bagian-bagian Mikroskop
NO BAGIAN MIKROSKOP FUNGSI

1

Tabel 2. Fungsi Alat-alat Dasar dalam Mikrobiologi
NO NAMA ALAT FUNGSI

1

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 2
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

A. STERILISASI
TUJUAN : Mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi, dan tyndalisasi

serta mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis
LANDASAN TEORI
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda
dari semua bentuk kehidupan. Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3
cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.
a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori
sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada
saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas,
misal nya larutan enzim dan antibiotik.
b. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
 Pemanasan
 Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung,
contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.
 Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas
kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung
reaksi dll.
 Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung
air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
 Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf
 Penyinaran dengan UV
Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya
untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet
dengan disinari lampu UV.
c. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain
alkohol.
Saran-saran kerja aseptis :
1.Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian
mulut (bagian yang memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih dahulu.
2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin dahulu atau dapat ditempelkan
tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke bagian api.
5. Jika kerja di Safety Cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi jika di luar Safety Cabinet
maka semakin banyak sumber api maka semakin terjamin kondisi aseptisnya

Berbagai prosedur umum kerja dalam mikrobiologi yang Membutuhkan
teknik Aseptis
a. Mendesinfeksi meja kerja

Prinsip cara kerja autoklaf
Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf
adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan
tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah
disampaikan di depan.
Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang
disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding
dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan
tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 1210C
atau 249,8 F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan
15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih
pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama,
menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat
kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada
ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya
autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi
20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan
akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan
mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah
semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup
sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu
yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu
mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan
dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum
tekanan mencapai 0 psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan
sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki
endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara
komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf
dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media
tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah:
 Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim
 Pelarut organik, seperti fenol
 Buffer dengan kandungan detergen, seperti SDS. Untuk mencegah terjadinya
presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat
dapat dilakukan pencegahan sbb :

 Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa
fosfat.
 Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau
senyawa garam mineral lain.
 Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar
 Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf
 Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum ¾ dari total volumenya, sisa
ruang dibiarkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada erlenmeyer
2L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.
Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi)
Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah
rusak jika terkena panas atau mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi
dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang
berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan
tersaring dengan metode ini.
Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara :
a. Non-disposable filtration apparatus
- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 mL
b. Disposable filter cup unit
- Volume 15-1000 mL
c. Disposable filtration unit dengan botol penyimpan

- Volume 15-1000 mL
d. Syringe filters
- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 mL
e. Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 mL
Cara kerja menggunakan Non-disposable filtration apparatus

a. Sterilkan saringan (dapat menggunakan saringan Bekerfeld, Chamberland Zeitz),

membran penyaring (kertas saring) dan erlenmeyer penampung.
b. Pasang atau rakit alat-alat tersebut secara aseptis (sesuai gambar), lalu isi corong
dengan larutan yang akan disterilkan.
c. Hubungkan katup erlenmeyer dengan pompa vakum kemudian hidupkan pompa.
d. Setelah semua larutan melewati membran filter dan tertampung dierlenmeyer,
maka larutan dapat dipindahkan kedalam gelas penampung lain yang sudah steril
dan tutup dengan kapas atau aluminium foil yang steril.
Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air
dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini.
Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan
bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan
terhidrolisis.
Cara kerja :
a. Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat dengan
sumbat atau aluminium foil.
b. Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisas (alat standar
menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).
c. Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu
1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang
terbentuk akan mematikan mikroba).
d. Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
e. Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama, sedang
waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel vegetatif yang
belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
Sterilisasi dengan udara panas (Dry heat sterilization)
Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk peralatan gelas seperti
cawan petri, pipet ukur dan labu erlenmyer. Alat gelas yang disterilisasi dengan udara
panas tidak akan timbul kondensasi sehingga tidak ada tetes air (embun) didalam alat
gelas.
Cara kerja :
a. Bungkus alat-alat gelas dengan kertas payung atau aluminium foil
b. Atur pengatur suhu oven menjadi 1800C dan alat disterilkan selama 2-3 jam.
Prinsip kerja Biological Saferty Cabinet (BSC)

Biological Safety Cabinet merupakan kabinet kerja yang sterilkan untuk kerja
mikrobiologi. BSC memiliki suatu pengatur aliran udara yang menciptakan aliran

udara kotor (dimungkinkan ada kontaminan) untuk disaring dan diresirkulasi melalui
filter. BSC juga disebut biosafety hood, dan juga dikenal dengan Laminar flowhood
atau Class II vertical flow cabinet yang menyediakan alat filtrasi dan aliran udara yang
bersirkulasi didalam ruang kerja. Aliran udara diatur untuk menghambat udara luar
masuk dan udara di dalam keluar, untuk mencegah kontaminasi dari luar dan
pencemaran bakteri dari ruang BSC. Udara yang keluar disaring melewati penyaring
sehingga sel-sel yang berbahaya tidak lepas keluar ke ruangan lain. Berbagai kelas
Biological Safety Cabinet.
PERCOBAAN :
1. Melakukan sterilisasi alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum
a. Alat gelas
b. Jarum ose, pinset
2. Melakukan sterilisasi bahan yang akan digunakan dalam praktikum
a. Sterilisasi Media
B. PEMBUATAN MEDIA
TUJUAN : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar untuk

pertumbuhan bakteri dan Potato Dextrose Agar untuk pertumbuhan
fungi.
LANDASAN TEORI
Pengertian dan Fungsi
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran
zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit
untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat
mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media
pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
Bahan dasar
 air (H2O) sebagai pelarut
 agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit
didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu
45oC.
 Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer

asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih
banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
 Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga
sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan
media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
Nutrisi atau zat makanan

 Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme
sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg
dan unsur pelikan/trace element.
 Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau
anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan
sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam
organik.
 Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen
lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
 Vitamin-vitamin.
Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan
tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk
indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik
ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
4. Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media

 Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan
terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai
pemadat (gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse
untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut.
Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan
berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar,
terutama pada pH yang asam.
 Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti
otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya
tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
 Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak, limpa,
plasenta dan daging sapi.

 Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat
alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (B
complex).
 Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan
asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya
digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dll.
Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%.
Macam-Macam Media Pertumbuhan

1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah
dingin media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4%
sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi
solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke
seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang.
Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol
Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan
media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur.
Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya
pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan
metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata
diseluruh media
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB
(Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan
takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui
secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar,
dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat
mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak
dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan
dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic
Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan

Media untuk isolasi, media ini mengandung semua senyawa esensial untuk
pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat, media yang selain mengandung nutrisi juga
ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan
pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang
diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin
untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang
peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh
Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment), media diperkaya adalah media yang
mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah
komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga
bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam
media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang
biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar,
Bile Agar, Serum Agar, dll.
Media untuk peremajaan kultur, media umum atau spesifik yang digunakan
untuk peremajaan kultur
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan
unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba.
Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji
kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri. Media yang digunakan untuk mengetahui
kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan
untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate
Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.
Media diferensial, media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari
campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih
Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan
warna media di sekeliling koloni.
PERCOBAAN
Pembuatan media Nutrient Agar dan Nutrient Broth
1. Tulis resep masing-masing medium.
2. Timbang semua bahan dengan tepat, letakkan pada tempat terpisah.
3. Siapkan akuades sesuai yang dibutuhkan.

4. Campurkan bubuk medium agar dan akuades dalam gelas beaker, aduk hingga
homogen, kemudian panaskan di atas hot plate dengan magnetic stirrer sampai
homogen dan mendidih (jaga jangan sampai meluber).
5. Ukur dan atur pH yang dikehendaki (pH medium instant telah tertera).
6. Masukkan medium ke dalam tabung-tabung reaksi sebanyak 10 ml dan 5 ml, dan
ke dalam labu Erlenmeyer dengan tidak melebihi 2/3 volume.
7. Sumbatlah mulut tabung dan labu Erlenmeyer dengan kapas. Sumbat ini harus
dapat menutup cukup kuat dan rapat, tetapi masih dapat dibuka dengan mudah.
Untuk memperkecil terjadinya kontaminasi pada saat penyimpanan medium, maka
pada waktu membuat sumbat, tangan harus bersih dan tidak terkena medium.
8. Lakukan sterilisasi medium menggunakan autoklaf temperature 121°C, tekanan 2
atm selama 15 menit.
9. Medium yang telah steril dapat dibuat
berbagai bentuk seperti agar tegak
atau agar miring (volume 5 mL), atau
dituang sebagai agar cawan (volume
10 mL). untuk pembuatan medium
agar miring, segera setelah dikeluarkan
dari autoklaf, tabung-tabung yang
berisi medium agar 5 mL diletakkan
pada posisi miring dengan sudut
kemiringan yang diinginkan
menggunakan papan miring atau alat
pengganjal, lalu biarkan agar
membeku. Untuk pembuatan medium
agar tegak, medium dibiarkan
membeku pada posisi tegak pada rak
tabung. Untuk pembuatan agar cawan,
tuanglah medium agar 10 ml ke dalam
cawan petri steril secara aseptis, lalu
biarkan agar membeku. Simpan
medium ini di dalam incubator paling
sedikit 24 jam sebelum digunakan
supaya dapat diketahui apakah betul-
betul steril.

Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA)
a. Timbang komponen media dengan menggunakan timbangan analitis untuk volume
yang diinginkan sesuai dengan komposisi berikut:
o Potato/kentang 3 g
o Peptone 5 g
o Agar 15 g
o Akuades s.d 1000 Ml
b. Sebelum ditimbang, sebaiknya kentang dikupas dan diiris kecil-kecil
c. Rebus kentang dalam sebagian akuades tadi selama 1-3 jam sampai lunak,
kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring dan memerasnya menggunakan
kertas saring lalu ditampung di Beaker glass baru.
d. Agar dilarutkan dengan Hot Plate Stirrer dalam 50 mL akuades lalu setelah larut
dapat ditambahkan dekstrosa dan dihomogenkan lagi.
e. Setelah semua larut, ekstrak kentang dan agar-dekstrosa dicampur dan
dihomogenkan. Atur pH media menjadi 5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.
f. Media dituang ke dalam Erlenmeyer atau ke tabung reaksi kemudian siap untuk
disterilisasi.
Menuang Media

BAGAN KERJA

HASIL

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 3
TEKNIK PEMINDAHAN KULTUR BIAKAN MIKROORGANISME
TUJUAN
Mahasiswa dapat mengetahui teknik pemindahan kultur mikroorganisme
secara aseptis.
LANDASAN TEORI
Memindahkan atau mentransfer mikroorganisme dari satu media ke media
lain disebut dengan subculturing atau peremajaan. Teknik ini sangat penting dan
secara rutin digunakan untuk membuat atau menyiapkan kultur stok yang diperlukan
dalam uji mikrobiologi. Mikroorganisme dijumpai dimana-mana karena itu mereka
menjadi sumber kontaminan eksternal yang akan mengganggu hasil eksperimen.
BAHAN
Kultur nutrient broth, agar NA miring, PDA miring, isolat bakteri dan fungi.
Alat
Pembakar spirtus, laminar air flow, lup inokulasi (ose), spidol (label).
CARA KERJA
Prosedur pemindahan pada media agar miring (NA dan PDA)
1. Beri label semua tabung media yang akan diinokulasi
2. Pindahkan isolate bakteri dan fungi dari media lama ke media baru agar miring
dengan mengambil satu sengkelit koloni menggunakan lup inokulasi kemudian
lakukan penggoresan pada media agar miring baru
3. Inkubasi pada suhu 37®C untuk isolate bakteri dan suhu ruang untuk isolate
fungi.
4. Amati pertumbuhan dan amati pula adanya kontaminan dan catat hasil pada
tabel berikut :
Prosedur pemindahan pada media agar cawan (NA dan PDA)

1. Beri label semua cawan petri berisi media yang akan diinokulasi, sebelumnya
cawan petri dibagi 4 sektor untuk metode gores secara zig-zag.
2. Pindahkan isolate bakteri dan fungi dari media agar miring ke media baru agar
cawan dengan mengambil satu sengkelit koloni menggunakan lup inokulasi
kemudian lakukan penggoresan pada media cawan dengan metode gores dan

lakukan bentuk zig-zag.
3. Inkubasi pada suhu 37®C untuk isolate bakteri dan suhu ruang untuk isolate
fung
4. Amati pertumbuhan dan amati pula adanya kontaminan dan catat hasil pada
tabel berikut :

a. Memindahkan biakkan secara Aseptis pada media agar miring

b. Memindahkan biakkan dari cawan

c.Memindahkan cairan dengan pipet

HASIL
TABEL 1. Hasil pemindah biakkan/peremajaan mikroorganisme
No. Jenis Isolat Pertumbuhan (+) atau (-) Kontaminan (+) atau (-)
TABEL 2. Hasil pengamatan koloni mikroorganisme
Pengamatan koloni pertumbuhan

Isolat Ukuran Bentuk Elevasi Tepi Pigmentasi Hasil Gambar
(warna)

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 4
PEMBUATAN PREPARAT KERING DAN PEWARNAAN

SEL MIKROORGANISME
TUJUAN :
1. Mempelajari cara menyiapkan apusan bakteri (preparat kering) dengan baik
sebagai prasyarat untuk mempelajari teknik pewarnaan;
2. Mempelajari prosedur dan memahami tahapan prosedur pewarnaan Gram,
sederhana, endospore, negative serta reaksi kimiawi yang terlibat dalam prosedur.
LANDASAN TEORI
Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur
tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri
secara lebih jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri
adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel.
Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu :

(1) Bersifat Asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam natrium.
Zat warna asam tidak mewarnai sel kuman dan dipergunakan untuk mewarnai
latar belakangnya. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene
Blue, Safranin, Base Fuchsin, MalachiteGreen dll.
(2) Bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk klorida. Contoh
zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk
mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat
tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang akan melekatkan zat warna pada
plasma sel.
Jenis-jenis Pewarnaan :
Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat
warna seperti : Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.
Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.

PERCOBAAN
1. Pembuatan preparat kering
a. Bersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas dari lemak. Kemudian
panaskan diatas lampu spirtus.
b. Buat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Jika sampel berbentuk padat
gunakan NaCl fisiologis untuk membuat suspensi.
c. Pijarkan ose lalu dinginkan. Celupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan
goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat pada
medium padat(media agar), maka teteskan NaCl Fisiologis terlebih dahulu pada
kaca preparat kemudian goreskan bakteri tersebut dengan ose.
d. Keringkan preparat dengan mengangin-anginkan pada suhu ruang atau dekat
hawa hangat api, kemudian lalukan preparat diatas api bunsen sebanyak 3 x.
Preparat kering siapkan digunakan untuk pewarnaan.
2. Pewarnaan Sederhana
a. Dinginkan preparat kering kemudian beri 5 tetes zat warna diatas suspensi yang
telah mengering dan diamkan selama 1-2 menit.
b. Zat warna yang berlebih dituang dari preparat dan dicuci dengan air yang telah
disediakan dalam botol semprot.
c. Preparat dikeringkan dengan kertas saring atau dekat nyala api
d. Preparat kemudian ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada bagian yang akan
diamati
e. Hasil yang diamati dicatat dan digambar

Hasil pewarnaan:
 Dengan air fucshin sel bakteri berwarna merah
 Dengan kristal violet sel bakteri berwarna violet
 Dengan biru metilen sel bakteri berwarna biru
Tugas pengamatan:
1. Gambarkan bentuk sel bakteri yang saudara lihat
2. Apa tujuan pemanasan diatas nyala api
2. Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan digunakan untuk mengetahui morfologi dan identifikasi jenis
bakteri. Pewarna yang digunakan dua atau lebih. Contoh pewarnaan diferensial
adalah pewarnaan Gram, pewarnaan Spora, pewarnaan kapsul, dll.
Cara kerja
a. Preparat kering dari biakan isolate bakteri (genus Bacillus) yang berumur 48-72
jam.
b. Beri tetesan malachite green pada permukaan preparat, biarkan selama 2-3
menit di atas penangas air, angkat dan biarkan dingin, lalu bilas dengan air
aquades. Perhatian : penangas air harus terus diawasi temperaturnya untuk
tidak terlalu panas dan air tidak mendidih agar zat warna tidak mongering atau
mendidih.
c. Beri tetesan zat warna tandingan, yaitu safranin, biarkan selama 30 detik lalu
bilas dengan air mengalir.
d. Keringkan preparat dengan membiarkannya di dekat nyala apai atau menekan-
nekan preparat secara perlahan dengan kertas tissue (jangan diusap).
e. Beri setetes minyak imersi pada permukaan preparat yang telah diwarnai, amati
dengan mikroskop berlensa objektif 100X.
3. Pewarnaan Gram
a. Siapkan preparat sampel dalam bentuk suspensi diatas kaca objek dan keringkan
dengan mengangin-anginkan atau meletakkannya dekat api. Setelah itu lalukan
fiksasi sebanyak 5-10x, dinginkan.
b. Tetesi preparat tersebut dengan zat warna Karbol Gentian Violet. Diamkan
selama 2 menit.
c. Cuci dengan air mengalir, Tambahkan zat pematek Lugol (Iodium : Kalium Iodium
: Aquades = 1 : 2 : 300), selama 1 menit. Kemudian bilas dengan air mengalir.
d. Bilas preparat dengan alkohol 96% selama 30 detik hingga zat warna larut
kemudian cuci dengan air mengalir.

e. Tetesi preparat dengan pewarna kedua, yaitu safranin. Diamkan selama 60 detik.
Bilas dengan akuades.
f. Keringkan preparat dengan tisu atau kertas saring tanpa digosok, kemudian
diatasnya diberi satu tetes minyak imersi untuk menghindarkan perbedaan
indek bias. Amati di bawah mikroskop.
g. Catat hasil pengamatan.
Hasil :
Bakteri gram positif berwarna ungu dan bakteri negatif berwarna merah
Beberapa perbedaan bakteri gram positif dan negatif

Bakteri gram positif
 Mangandung Mg Ribonukleat
 Sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan
 Sensitif terhadap penisilin
 Tahan basa, tidak larut dalam KOH 1%
 Kisaran isoelelektrik pH 2,5 – 4
 Biasanya berbentuk kokus atau batang pembentuk spora kecuali Lactobacillus
dan Cyanobacterium
 Dapat bersifat tahan asam
 Contoh : Staphylococcus albus dan Bacillus subtilis
Bakteri gram negatif
 Tidak mengandung Mg ribonukleat
 Kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan
 Sensitif terhadap streptomisin
 Sensitive basa, larut dalam KOH 1%
 Kisaran isoelektrik pH 4,5 – 5,5
 Biasanya berbentuk batang non spora kecuali neisseria
 Tidak tahan asam
 Contoh : Salmonella thypii dan Escericia coli
4. Pewarnaan Negatif
Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui morfologi bakteri yang tidak
dapat diwarnai dengan teknik sederhana. Sesuai namanya, yang diwarnai pada teknik
ini adalah latar belakang suspensi preparat menggunakan tinta cina, sehingga
mikroorganisme terlihat transparan diantara medan yang gelap. Tujuannya adalah
melihat morfologi bakteri.

Cara kerja :
 Sediakan dua buah kaca objek yang bersih dan bebas dari lemak
 Teteskan setetes tinta cina pada salah satu ujung kaca objek
 Letakkan suspensi bakteri di samping tinta cina dengan menggunakan kawat ose
steril.
 Dengan kaca objek yang kedua, kedua tetesan tersebut dicampurkan dan diratakan
dengan posisi 45o terhadap kaca objek dibawahnya. Selanjutnya kaca objek
tersebut didorong menuju ujung sebelahnya (diapus) sehingga membentuk sebuah
lapisan film yang tipis
 Keringkan kaca objek tersebut dengan nyala api, setelah dingin, amati
dibawah mikroskop 100x
HASIL PENGAMATAN
a. Pewarnaan sederhana
Jenis bakteri Zat warna Gambar Keterangan

Bentuk :
Susunan :
Bentuk :
Susunan :
Bentuk :
Susunan :

b. Pewarnaan endospora
Jenis bakteri Gambar Keterangan
Warna sel vegetatif :
Warna endospore :
Lokasi endospore :
Warna sel vegetatif :
Warna endospore :
Lokasi endospore :
c. Pewarnaan gram
Jenis bakteri Warna dan jenis Gambar Keterangan
reaksi Gram
Bentuk :
Susunan :
Bentuk :
Susunan :
Bentuk :
Susunan :
Bentuk :
Susunan :

d. Pewarnaan negatif
Jenis bakteri Gambar Keterangan
Warna bakteri :
Warna latar :
Bentuk sel :
Susunan :
Warna bakteri :
Warna latar :
Bentuk sel :
Susunan :

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 5
KURVA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
TUJUAN
Mengamati fase-fase pertumbuhan populasi mikroorganisme (kultur bakteri

sebagai contoh) di dalam Kultur Batch melalui pengamatan perubahan jumlah sel/ml
dan Optical Density (OD) terhadap waktu inkubasi.
LANDASAN TEORI
Mikroorganisme tumbuh dalam spektrum yang luas dalam lingkungan fisik

maupun kimia. Pertumbuhan dan aktivitas fisiologis lainnya ternyata merupakan
respon lingkungan fisiologis sekitarnya. Kinetika fermentasi akan menggambarkan
pertumbuhan dan pembentukan produk oleh mikroorganisme, bukan hanya
pertumbuhan sel aktif tetapi juga sel yang istirahat bahkan sel-sel yang mati, karena
banyak produk komersial yang dihasilkan setelah berhentinya pertumbuhan.
Kultur pertumbuhan mikroorganisme berdasarkan tipe pemberian medium,

dibagi menjadi 3, yaitu :
a. Kultur Batch, yaitu teknik untuk menumbuhkan mikroorganisme atau sel

dengan membatasi suplai nutrisi untuk pertumbuhan yang disediakan, ketika
nutrisi digunakan atau beberapa faktor menjadi terbatas, pertumbuhan kultur
mengalami penurunan. Sel-sel atau produk yang dihasilkan mikroorganisme
dapat dipanen dari kultur.
b. Kultur Feedbatch, yaitu teknik untuk menumbuhkan mikroorganisme atau sel
dengan mensuplai nutrisi untuk pertumbuhan setelah kandungan nutrisi
terbatas. Sel akan tumbuh kembali setelah nutrisi ditambahkan sehingga tidak
terjadi proses penurunan jumlah sel atau bahkan sel akan tumbuh terus. Sel-
sel yang dihasilkan mikroorganisme dapat dipanen setelah kapasitas volume
medium dalam wadah telah berlebih.

c. Kultur Kontinu, yaitu teknik untuk menumbuhkan mikroorganisme atau sel
secara kontinu dalam suatu fase pertumbuhan tertentu. Sebagai contoh, bila
suplai nutrisi diberikan secara konstan, kultur akan dipertahankan pada fase
log. Kondisi kultur harus secara kontinu dimonitor dan diatur sehingga sel
tidak mengalami fase stasioner. Pertumbuhan dapat dipertahankan di fase
pertumbuhan yang diinginkan bila enzim atau produk kimia lainnya diproduksi
selama fase tersebut. Di kultur ini terjadi pengeluaran produk dan
penambahan nutrisi sehingga fase pertumbuhan tetap terjaga.
Kinetika pertumbuhan mikroorganisme dikenal luas oleh ahli mikrobiologi. Menurut
Purwoko (2007) terdapat 4 fase pertumbuhan ketika ditumbuhkan pada kultur batch,
yaitu :
1. Fase adaptasi, yaitu proses dimana terjadi sintesis enzim baru yang sesuai dengan
medianya dan pemulihan terhadap metabolik yang bersifat toksik (misalnya asam,
alkohol dan basa) pada waktu di media lama. Pada fse ini tidak dijumpai
pertambahan jumlah sel. Akan tetapi terjadi pertambahan volume sel, karena pada
fase statis sebelumnya sel melakukan pengecilan ukuran sel.
2. Fase Perbanyakan, setelah kondisi ideal dalam pertumbuhan, sel melakuakn
pembelahan. Karena pembelahan sel merupakan persamaan eksponensial, maka
fase itu juga disebut fase eksponensial. Pada fase perbanyakan jumlah sel
meningkat sampai pada batas tertentu, sehingga memasuki fase statis.
3. Fase Statis, pada fase ini sel melakukan adaptasi terhadap kondisi yang kurang
menguntungkan. alasan mikroba tidak melakukan pembelahan sel pada fase statis
bermacam-macam. Beberapa alasan yang dapat dikemukakan adalah : Nutrient
habis, akumulasi metabolik toksik (seperti alcohol, asam dan basa), penurunan
kadar oksigen, dan ketersedaian air.
4. Fase Kematian, penyebab utama kematian adalah terjadi autolysis sel dan
penurunan energy seluler. Beberapa bakteri hanya mampu bertahan beberapa jam
selama fase statis dan akhirnya masuk ke fase kematian, sementara itu ada bakteri
yang mampu bertahan sampai harian bahkan mingguan pada fase statis dan
akhirnya masuk fase kematian.

METODE KERJA
Bahan dan Alat :
1. Biakan mikroorganisme berumur 12-24 jam

2. Medium Nutrient Broth (NB) di dalam labu Erlenmeyer
3. Larutan NaCl 0,9% 10 ml di dalam tabung reaksi
4. Medium Nutrient Agar (NA) dalam cawan petri
5. Mikropipet dan tip 0,1 ml dan 1 ml
6. Pembakar Spirtus atau Bunsen
7. Vortex
8. Spektrofotometer
9. Colony Counter
10. Inkubator Pengocok (Shaker incubator)
Cara Kerja
1. Pembuatan kultur inokulum dilakukan dengan cara mengambil 3 ose koloni bakteri
yang sudah dilakukan peremajan sel sebelumnya dan dimasukkan kedalam kultur
media baru (kultur broth) sebanyak 30 ml media NB. Kemudian dilakukan aerasi
dengan cara kultur goyang menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 120
rpm selama 24 jam.
2. Inokulasikan 5 ml biakan bakteri umur 24 jam kedalam labu Erlenmeyer 250 ml
berisi 50-100 ml media NB baru. Ukur OD awal biakan ini.
Cara mengukur OD dengan spectrophotometer adalah :
 Atur Spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm, biarkan selama 10-15
menit.
 Atur persentase transmisi (%T) menjadi 0% (OD = 2)
 Bersihkan bagian luar tabung (cuvette) berisi media NB steril (digunakan sebagai
control/blanko) sampai tampak benar-benar jernih
 Masukkan cuvette control tersebut ke dalam tube holder pada spektrofotometer,
tutup dan atur OD = 2 (%T = 100)

 Ambil beberapa ml biakan bakteri dari labu Erlenmeyer tadi, masukkan ke dalam
tabung cuvette yang telah dibersihkan bagian luarnya
 Angkat cuvette control dari tube holder, ganti dengan cuvette berisi biakan, tutup
dan baca OD pada layar alat. Perkiraan OD awal atau t0 –dalah 0,08 – 1 pada 600
nm
3. Setelah OD awal atau t0 ditentukan, kocok biakan tersebut dengan vortex dan buat
pengenceran dan penanaman pada media NA dalam cawan petri untuk
memperoleh penghitungan jumlah sel/ml dengan metode plate count menurut
cara kerja praktikum sebelumnya
4. Selanjutnya biakan diinkubasi dengan pengocokan 120 rpm pada temperatur 37°C,
dan setiap interval 30 menit dilakukan penentuan OD dan pengerjaan prosedur
plate count
5. Pengamatan jumlah koloni yang tumbuh pada media NA dapat diamati setelah
biakan agar itu diinkubasi pada temperature 37°C selama 24 jam.

BAGAN KERJA

HASIL PENGAMATAN
1. Data dari hasil pengamatan dengan menggunakan spektrofotometer dan

enumerasi jumlah sel pada setiap interval waktu 30 menit adalah :
Waktu Optical Density Plate Count Log (jumlah sel/ml)
inkubasi (OD) pada 600 nm
(Jumlah sel/ml)
(menit)
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360

2. Lampirkan gambar kurva pertumbuhan yang terbentuk berdasarkan data
tersebut (sumbu X = waktu inkubasi dan sumbu Y = log jumlah sel/ml) dan
tentukan perkiraan fase-fase pertumbuhannya !
PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 6
ENUMERASI MIKROORGANISME
TUJUAN
Mengetahui bagaimana cara menentukan jumlah mikroorganisme dengan
mengukur jumlah sel atau massa sel
LANDASAN TEORI
Penentuan jumlah (enumerasi) mikroorganisme dapat diketahui dengan
mengukur jumlah sel atau massa sel. Enumerasi dengan mengukur jumlah sel
diterapkan pada organimse uniseluler seperti bakteri dan ragi; sedangkan pengukuran
massa sel dapat diterapkan pada semua tipe mikroorganisme, termasuk yang
memiliki filament (benang-benang panjang), seperti jamur, yang tidak dapat dihitung
dengan mengukur jumlah sel.
Metode plate count merupakan metode enumerasi sel hidup (viable) yang
paling umum digunakan. Metode ini didasari oleh hubungan teoritis bahwa satu sel
bakteri menghasilkan satu koloni, sehingga timbul asumsi bahwa jumlah koloni yang
tumbuh pada plate agar bersesuaian dengan jumlah bakteri asalnya. Keterbatasan
luas bidang permukaan plate agar pada petri mengharuskan prosedur plate count
didahului dengan pengenceran sampel. Jumlah deret pengenceran dalam satu seri
tergantung pada kekeruhan sampel awal. Semakin keruh sampel, semakin banyak
pengenceran yang diperlukan.
Enumerasi dengan mengukur massa sel dapat memperkirakan total
protoplasma seluler per ml kultur. Metode yang umum digunakan adalah perkiraan
kimiawi (nitrogen seluler, protein, fosfor, DNA), berat kering sel atau miselia, volume
sel, dan metode turbidimetrik. Metode turbidimetrik didasari pada fakta bahwa suatu
populasi sel dalam medium cair yang memblokir cahaya bersesuaian dengan total
massanya dalam kultur itu.
METODE KERJA
Bahan dan Alat
- Sampel air atau makanan
- Larutan NaCl 0,85% (fisiologis) steril 9 ml dalam tabung-tabung reaksi
- Pipet 1 ml dan 10 ml
- Nutrien agar (NA) dalam petri
- Batang gelas L (bent glass rod) atau spreader atau batang drygalsky

- Vortex
- Colony counter
- Spidol
- Pembakar spirtus
- Inkubator
PERCOBAAN
PENENTUAN BATAS BAKTERI DENGAN METODE PLATE COUNT
1. Buatlah satu seri pengenceran pada sampel yang akan dihitung, dengan cara:
Masukkan 1 ml atau 1 gram sampel ke dalam larutan NaCl fisiologis 9 ml steril
dalam tabung reaksi, lalu kocok dengan vortex; suspensi ini disebut pengenceran
1:10 atau 10-1 . Ambil 1 ml suspense dari tabung pertama tersebut & masukkan ke
dalam larutan fisiologis 9 ml steril dalam tabung kedua, lalu kocok dengan vortex;
suspense ini disebut pengencerann 10-2. Selanjutnnya lakukan cara yyang serupa
untuk pengenceran 10-3, 10-4, 10-5 dan 10-6 (jumlah pengenceran dalam satu seri
tergantung pada kekeruhan sampel; konsultasikan dengan dosen atau asisten) .
2. Dari tiga pengenceran terakhir (10-4, 10-5, dan 10-6), ambil masing-masing 0,1 ml
dengan pipet steril yang berbeda (atau dengan satu pipet, tetapi dilakukan mulai
dari pengenceran terbesar) & inokulasika pada 3 plat agar yang berbeda>
Sebarkan inokulum suspense itu pada permukaan plat agar dengan menggunakan
batang gelas L sampai merata. Setiap akan memulai pada petri yang berbeda,
celupkan batang gelas L di dalam alcohol 70% lalu bakar pada nyala api &
dinginkan 10-15 detik.
3. Inkubasikan pada temperature 30⁰C selama 24 jam.
4. Hitung jumlah koloni yang tumbuh per 1 ml sampel. Jumlah yang dapat dihitung
adalah 30-300 koloni. Jika  30 berarti pengenceran terlalu besar (suspense terlalu
encer), jika  300 berarti pengenceran terlalu kecil (suspense kurang encer).
Jumlah mikroorganisme per ml sampel diperoleh dengan membagi jumlah
koloni yang tumbuh dengan volume sampel yang diinokulasi dan dibagi dengan
pengenceran yang digunakan, lalu dicari nilai rata-rata dari ketiga plat yang dihitung.
Contoh :
Dari plat agar pengenceran 10-4 tumbuh 205 koloni bakteri.
Maka jumlah bakteri dalam sampel awal adalah:
(205 x 104 x 101 + 121 x 105 x 10-1 + 56 x 106 x 10-1) : 3 = 2,34 x 108 sel/ml

Bagan Kerja

HASIL PENGAMATAN
Jenis sampel : …………………………………………………………………….
Dari plat agar pengenceran 10-4 tumbuh ……………….. koloni bakteri.
Dari plat agar pengenceran 10-5 tumbuh ………………. Koloni bakteri.
Dari plat agar pengenceran 10-6 tumbuh ……………….. koloni bakteri.
Maka jumlah bakteri dalam sampel awal adalah :
…………………………………………………………………………………………………………………………

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 7
ISOLASI MIKROORGANISME DARI LINGKUNGAN
TUJUAN
Mahasiswa dapat memisahkan mikroorganisme dari campurannya sehingg
didapat kultur biakkan murni.
LANDASAN TEORI
Indonesia mempunyai biodiversitas mikroorganisme yang mempunyai nilai
potensial dalam mengembangkan ilmu pengetahuan maupun nilai komersial.
Kemajuan ilmu bioteknologi sekarang ini memacu kreativitas para peneliti untuk
memanfaatkan keanekaragaman mikroorganisme dalam berbagai bidang, seperti
industri pangan, peternakan, bioenergi, lingkungan dan kesehatan. Pemanfaatan
mikroba meliputi produk hasil metabolisme ataupun bioenzim. Di alam populasi
mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran
berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat
dan kemampuan biokimiawinya.
Teknik Pengambilan Sampel

Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel.
1. Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah,
maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misal jika
yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran
dekat permukaan hingga ujung perakaran.
2. Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika
berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol
melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang,botol
dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran maka
sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.

Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril.
Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba
dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam
preparasi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki
permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda
tersebut. Contohnya adalah meja, batu, lipatan tangan dan kaki, batang kayu dll.
Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan
kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika
cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas), ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada
permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll.
Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades
dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g
kemudian dibilas dengan akuades 45 mL yang terdapat dalam beaker glass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan
mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat
terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antara lain bakso, biji,
buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9
(w/v). Untuk sampel dari tanah tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi
jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya
tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma
dari pengenceran sebelumnya.

a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama
(1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan
volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse
dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan
pengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping).
b. Diambil 1 mL dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2
secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai
homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama,
hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat
pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu
diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a. Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi
dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan
koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan
agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang dapat dilakukan adalah sebagai
berikut :
 Ambil suspensi cairan sebanyak 0,1 mL dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas
permukaan agar yang telah memadat.
 Batang L atau batang drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas

bunsen beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
 Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar supaya tetesan
suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.
 Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel
mikroorganisme dapat mati karena panas.
a.2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke
dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan
menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar
(di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang
tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur
kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut :
 Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih
cair (>45oC)
 Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong
 Tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan
suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.
 Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 mL untuk spread plate dan 1mL untuk pour plate
karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan dipermukaanya saja, sedangkan pour
plate membutuhkan ruang yang lebih luas untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih
banyak dari pada spread plate.

b. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke
dalam medium baru.
b.1 Goresan Sinambung
 Sentuhkan inokulum loop pada koloni dan gores secara kontinyu sampai setengah
permukaan agar.
 Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis.
 Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal,
melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
Goresan sinambung
b.2 Goresan T
 Bagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol marker
 Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag
 Panaskan jarum inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada
daerah 2 (streak pada gambar). Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna
 Lakukan hal yang sama pada daerah 3
Goresan T
b.3 Goresan Kuadran (Streak quadrant)

Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi
empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel
mikroorganisma.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama
sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

Goresan Kuadran (Streak Quadrant)
PERCOBAAN
A. Isolasi Mikroorganisme
A.1. Isolasi Mikroorganisme dari Sampel Tanah :
a. Tanah seberat 1 g dimasukan ke dalam tabung pengenceran 10-1 secara aseptis dan
selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-8.
b. Tiga pengenceran terakhir diambil 0,1 ml untuk ditanam secara spread plate atauy pour
plate pada medium NA untuk mengisolasi bakteri dan PDA untuk mengisolasi fungi, dan
setelah selesai diinkubasi pada 37oC selama 1x24 jam untuk media NA dan suhu ruang
selama 3-7 hari untuk media PDA.
A.2. Isolasi Mikroorganisme dari Udara
a. Letakkan cawan petri berisi media NA atau PDA dalam keadan terbuka (tanpa tutup)
diruanga yang menjadi sumber isolasi; biarkan ± 5 menit, kemudian tutup kembali dengan
penutup cawan petri.
b. Inkubasikan pada temperatur yang sesuai dengan temperature sumber isolasi selama 24-48
jam untuk media NA dan 3-7 hari untuk media PDA.
c. Amati morfologi koloni-koloni yang tumbuh dan lakukan isolasi dan pemurnian koloni.
A.3. Isolasi Mikroorganisme dari Bahan Padat
a. Gerus sedikit bahan sumber isolasi (secara aseptis) dengan menggunakan mortar yang
sudah disetrilisasi dengan menggunakan alkohol 70%.
b. Taburkan secara merata bahan yang telah digerus tadi diatas permukaan agar dalam cawan
petri, dengan menggunakan pinset yang ujungnya telah direndam dalam alkohol 96% dan
sudah difiksasi diatas pembakar spirtus.
c. Inkubasikan pada pada temperature yang sesuai dengan temperature sumber isolasi selama
24-48 jam untuk media NA dan 3-7 hari untuk media PDA.
d. Amati morfologi koloni-koloni yang tumbuh dan lakukan isolasi dan pemurnian koloni.
A.4. Isolasi Mikroorganisme dari Bahan Cair
a. Teteskan sebanyak 0,1 ml bahan cair diatas permukaan agar cawan petri (cara spread plate)

atau 1 ml bahan cair pada cawan petri steril dan tuangkan media (cara pour plate) baik
dengan media NA maupun media PDA.
b. Jika bahan terlalu pekat, encerkan terlebih dahulu dengan aquades steril atau larutan NaCl
fisiologis steril. Inkubasikan pada pada temperature yang sesuai dengan temperature
sumber isolasi selama 24-48 jam untuk media NA dan 3-7 hari untuk media PDA.
c. Inkubasikan pada pada temperature yang sesuai dengan temperature sumber isolasi selama
24-48 jam untuk media NA dan 3-7 hari untuk media PDA.
d. Amati morfologi koloni-koloni yang tumbuh dan lakukan isolasi dan pemurnian koloni.
A.5. Isolasi Mikrorganisme dari Flora Normal Tubuh
a. Bukalah satu sisi cawan petri secara perlahan (jangan dibuka sepenuhnya).
b. Sentuhlah media agar dengan tangan yang tidak disterilkan. Saat membuka penutup cawan
maupun saat menyentuh media lingkungan di sekitarnya harus dalam keadaan steril
dengan didekatkan ke pembakar spirtus atau Bunsen (kecuali tangan sebagai flora bakteri
yang diisolasi).
c. Setelah disentuh oleh kelima jari, tutuplah penutup cawan petri, kemudian bungkus
kembali dengan kertas.
d. Untuk media cair, gunakanlah batang pengaduk (spatula) yang sebelumnya telah
dibersihkan dengan alkohol lalu sentuhlah spatula pada kelima jari tangan. Saat melakukan
hal tersebut, selalu dekatkan dengan pembakar spirtus atau Bunsen agar tidak ada mikroba
lain selain kita tuju.
e. Batang spatula yang telah disentuh kemudian celupkanlah dan aduklah ke dalam tabung
reaksi yang berisi medium pertumbuhan bakteri, lalu berilah label kelompok dan mikroba
tersebut.
f. Setelah itu simpan untuk diinkubasikan cawan dan tabung reaksi pada suhu ruang selam 48
jam.
g. Bila ingin mengetahui jenis bakteri yang ada di rambut, sentuhlah rambut dengan tangan,
lalu lakukan tahap 1 sampai dengan 6.
B. Persiapan Inokulasi (Pemurnian mikroba)

B.1. Persiapan Inokulasi
1. Letakkan peralatan inokulasi (ose, pembakar spirtus, rak tabung, dan cawan petri)
didalam laminar. Nyalakan lampu UV laminar. Setelah 30 menit, matikan lampu UV,
nyalakan lampu penerang.
2. Cucilah tangan dengan bersih, kemudian semprotlah dengan alcohol 70% dan keringkan.
3. Masukkan medium dan biakan koloni hasil isolasi dari berbagai bahan dalam laminar air
flow cabinet (lakukan secepat mungkin namun tetap berhati-hati, minimalkan lama
waktu terbukanya pintu laminar).
4. Tuang agar dalam tabung yang telah dicairkan dengan penangas air di atas hot plate ke
dalam cawan petri steril yang telah disiapkan di dalam laminar. Biarkan agar membeku
(sebaiknya agar cawan yang akan digunakan diinkubasi terlebih dahulu selama 24 jam

untuk memastikan kesterilannya).
5. Tandai tabung agar miring dan cawan agar dengan spidol tahan air, tulis nama spesies
biakan/koloni yang akan dipindahkan.
6. Nyalakan pembakar spirtus. Bakar ose sampai pijar, kemudian pinggirkan dari api
beberapa saat supaya kembali dingin.
B.2. Inokulasi pada Agar Miring
1. Sambil tetap memegang ose (tangan kanan) di dekat api bunsen, ambil salah satu tabung
biakan (tangan kiri). Angkat sumbat kapas dari tabung dengan melengkungkan jari
kelingking kanan.
2. Ambil seujung ose koloni biakan dari dalam tabung, sambil terus berada di dekat nyala
api. Tutup segera tabung dengan sumbatnya, lalu sisihkan.
3. Sambil tetap memegang ose yang ditempeli koloni biakan (tangan kanan) di dekat api,
ambil sebuah tabung berisi agar miring (NA untuk biakan bakteri; PDA untuk biakan
jamur) dengan tangan kiri. Angkat sumbat kapas dari tabung seperti cara no. 1
4. Masukkan ose tersebut ke dalam agar miring steril. Buat goresan zig-zag mulai dari ujung
bawah ke arah atas sepanjang permukaan agar miring. Lalu tutup segera tabung dengan
sumbatnya.
5. Setelah selesai, celupkan ose ke dalam alcohol 70% dalam gelas beaker dan bakar kembali
sampai pijar.
6. Agar miring yang telah di inokulasi di inkubasi dalam incubator selama 24 jam, untuk
kemudian di amati pertumbuhan yang terjadi.
B.3. Inokulasi pada Agar Cawan
a. Lakukan pengambilan biakan seperti no. 1 dan no. 2 di atas.
b. Sambil tetap memegang ose yang ditempeli koloni biakan (tangan kanan) di dekat api,
ambil sebuah cawan petri berisi medium agar beku (NA untuk biakan bakteri; PDA untuk
biakan jamur) dengan tangan kiri. Pegang cawan dengan telapak tangan kiri, angkat
tutupnya dan ditahan dengan jari jempol dan telunjuk kiri. Masukan ose tadi ke dalam
cawan.
c. Buat beberapa goresan zig-zag yang rapat pada salah satu daerah tepi permukaan agar.
Kemudian tarik satu goresan menyilang dari daerah pertama dan buat beberapa goresan
zig-zag pada daerah kedua. Dan seterusnya sampai 3-4 daerah, diakhiri dengan goresan
zig-zag yang lebih renggang. Setiap perpindahan daerah dapat juga diselingi dengan
melewatkan ose pada nyala api.
d. Setelah selesai, atau bila akan menginokulasi jenis biakan yang lain, celupkan ose ke
dalam alcohol 70% dalam gelas beaker dan bakar kembali sampai pijar.
e. Agar miring yang telah diinokulasi diinkubasi dalam incubator selama 24 jam, untuk
kemudian diamati pertumbuhan yang terjadi.

BAGAN KERJA

HASIL PENGAMATAN

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 8
PENGARUH FAKTOR LINGKUNGAN TERHADAP

PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
TUJUAN
Mengenal berbagai factor lingkungan hidup jasad renik (mikroorganisme) dan
mengetahui pengaruh factor lingkungan hidup terhadap kehidupan mikroorganisme.
LANDASAN TEORI
Seperti halnya organisme lain, mikroorganisme di dalam melakukan
kegiatannya sangat dipengaruhi oleh factor lingkungan atau oleh unsur-unsur ekologi.
Perubahan dari factor lingkungan akan mengakibatkan perubahan sifat baik morfologi
maupun fisiologi.
Factor-faktor lingkungan hidup dapat dikelompokkan menjadi tiga macam
yaitu :
1. Factor abiotic yang meliputi factor kimiawi dan fisika, atau factor tidak hidup.
2. Factor kimiawi, misalnya zat atau senyawa tertentu dalam nutrientnya, dan
bahan kimia toksik serta keasaman. Factor fisika misalnya suhu dan tekanan
yang ekstrim.
3. Faktor biotik, yaitu jasad hidup atau bersifat hidup. Factor biotik misalnya
kehadiran spesies lain pada lingkungannya.
Perbedaan kelompok jasad renik menghendaki factor lingkungan optimal
yang berbeda untuk kehidupan terbaiknya. Akan tetapi pada kenyataannya factor
lingkungan optimum itu belum dapat dipenuhi, sedang kehidupan di pertahankan
terus. Sehubungan dengan hal itu mikroorganisme mempunyai kisaran nilai factor
lingkungan yaitu minimu, optimum dan maksimum.
METODE KERJA
A. Pengaruh sinar matahari atau sinar UV
Bahan dan alat
- kultur cair bakteri 24 jam
- medium NA
- Laminar Air Flow
- Kertas Aluminium (Aluminium foil)
- pinset
- pembakar spirtus

Cara kerja
1. untuk pengaruh UV, buat kultur agar tuang NA bakteri E. coli dan B. subtilis
2. letakkan potongan kertas alumunium steril berukuran 2 x 2 cm pada permukaan
biakan agar cawan
3. masukkan dan biarkan di dalam laminar dengan membuka tutup cawan petri untuk
disinari lampu UV
4. setelah 2-3 jam disinari UV, lampu dimatikan, cawan petri diambil, dan kertas
alumunium juga diambil, kemudian tutup cawan petri dipasang lagi
5. inkubasi kembali cawan petri yang sudah ditutup pada suhu 37®C selama 24 jam
6. amati pertumbuhan bakteri.
B. Bahan Tekanan Osmosa

Bahan dan alat
- Glukosa NaCl berbagai konsentrasi
- Glukosa sukrosa berbagai konsentrasi
- kultur cair bakteri (E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella thypii dan S. aureus)
- jarum ose
- cawan petri steril
- pembakar spirtus
- incubator
Cara kerja
1. Ambil glukosa agar mengandung NaCl : 1 tabung 0.5% NaCl, 1 tabung 5% NaCl, 1
tabung 15% NaCl, dan 1 tabung 25% NaCl.
2. buat agar cawan dari medium tersebut, setelah memadat bagi menjadi 4 bagian
bertanda dengan spidol
3. ambil glukosa agar mengandung sukrosa : 1 tabung 0,5% sukrosa, 1 tabung 15%
sukrosa, 1 tabung 30 sukrosa, dan 1 tabung 60% sukrosa.
4. buat agar cawan dari medium tersebut, setelah memadat bagi menjadi 4 bagian
bertanda dengan spidol
5. inokulasi setiap sektor agar medium dengan keempat bakteri diatas
6. inkubasi kultur pada suhu 37®C, selama 48 jam.
7. amati pertumbuhannya : (+++) = luar biasa, (++) = baik, (+) = sedikit, (-) = tidak
tumbuh.

Pengaruh suhu
Bahan dan alat
- medium glukosa cair
- biakan murni E. coli, Pseudomonas aerogenosa, S. aureus, dan Bacillus subtilis
- jarum ose
- pembakar spirtus
- Inkubator
Cara kerja
1. ambil medium cair glukosa, kelompokkan menjadi 4 (tiap kelompok 5 tabung).
2. inokulasi masing-masing tabung dalam setiap kelompok dengan bakteri diatas
3. Inkubasi biakan pada suhu 5°, 20°, 45°, dan 55°, selama 48 jam
4. Amati pertumbuhan dengan melihat kekeruhan
Pengaruh pH
Bahan dan alat
- Medium NA dengan pH berbeda
- Kultur cair E.coli dan S. aureus dalam NB
- Kultur cair Saccharomyces cereviceae dalam malt ekstrak
- Suspense spora Aspergillus niger
- Cawan petri steril
- Jarum ose
- Pembakar spirtus
- Inkubator
Cara kerja
1. Persiapkan 4 agar cawan untuk media NA dengan pH 3, 5, 7, dan 9, bagi 4 sektor
pada dasar tiap cawan
2. Inokulasi masing-masing sektor dengan bakteri E.coli dan S.aureus
3. Persiapkan 4 cawan MEA pH 3, 5, 7, dan 9.
4. Lakukan kerja seperti 2 dan 3
5. Inkubasi kultur pada suhu 37°C selama 2-3 hari
6. Amati pertumbuhan setiap jasad pada setiap sektor, pakailah kode (+++),(++),
dan (+) serta (-) untuk pertumbuhan luar biasa, baik,sedikit, dan tidak tumbuh.

HASIL PENGAMATAN
No Jenis Mikroorganisme Pengamatan pertumbuhan
Penggaruh yang diuji mikroorganisme
Lingkungan
1 Pengaruh
Suhu
2 Tekanan
osmosa
3 Sinar UV
4 pH

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 9
AKTIVITAS BIOKIMIA DARI MIKROORGANISME
TUJUAN
Mengetahui aktivitas biokimia pada mikroorganisme sehingga dapat diketahui

sifat-sifat yang khas dari mikroorganisme untuk keperluan identifikasi.
LANDASAN TEORI
Mikroorganisme seperti makhluk hidup lain, memerlukan energi untuk

kelangsungan hidupnya. Energi ini dapat diperoleh dari lingkungan sekitarnya dalam
bentuk senyawa kimia tertentu yang dapat diuraikan. Kemampuan mikroorganisme
untuk menguraikan senyawa tertentu dan mensintesis senyawa yang baru
merupakan sifat khas masing-masing mikroorganisme. Semua aktivitas metabolism
tersebut berlangsung dengan bantuan enzim tertentu. Hasil reaksi metabolism ini
hampir semuanya dapat diamati, biakan dapat diukur kekuatannya. Reaksi
metabolism ini berbeda untuk setiap mikroorganisme, sehingga hal ini merupakan
sifat yang sangat penting untuk mengidentifikasi (Pikoli dan Radiastuti, 2003).
Mikroorganisme harus dibedakan dan diidentifikasi karena ; diantaranya ada

yang bersifat patogen dan menyebabkan penyakit infeksi, mikroorganisme
fermentative yang mempunyai arti industry seperti penghasil alkohol, bahan pelarut,
vitamin, asam organik, antibiotic dan penghasil enzim senantiasa dieksplorasi
sehingga perlu diseleksim, beberapa galur mikroorganisme penting yang dapat
meningkatkan kualitas dan diversifikasi bahan pangan perlu diisolasi dan
dikembangkan, aktivitas biokimiawi mikroorganisme mempunyai arti penting dalam
taksonomi. Aktivitas enzimatik mereka berperan di dalam bioenergetika, biosintesis,
dan biodegradasi. Reaksi kimiawi di dalam sel disebut juga metabolism seluler
sementara transformasi biokimiawi dapat berlangsung di dalam dan di luar sel yang
dikendalikan oleh katalis yang dikenal dengan enzim (Sunatmo, 2009).
Menurut Sunatmo (2009) enzim ekstraseluler atau eksoenzim berkaitan

dengan substansi di luar sel. Substansi dengan bobot molekul yang tinggi tidak dapat
masuk ke dalam sel melalui membrane, karena itu bahan nutrisi seperti polisakarida,
lipid dan protein perlu didegradasi menjadi molekul yang lebih kecil sebelum dapat
ditranspor ke dalam sel. Eksoenzim biasanya adalah enzim hidrolitik yang mereduksi
molekul berbobot tinggi ke dalam substansi pembangun melalui reaksi dengan air
menjadi molekul berukuran kecil yang dapat ditranspor dan diasimilasi. Enzim
intraseluler atau endoenzim bekerja di dalam sel dan bertanggungjawab dalam
sintesis komponen protoplasma dan produksi energi seluler dari bahan yang
diasimilasi. Kemampuan enzim bekerja pada substrat nutrisi menjadikan membrane
sel sebagai tempat endoenzim yang melangsungkan transformasi kimiawi pada
substrat spesifik menjasi substansi esensial. Transformasi sangat penting untuk daya
tahan dan fungsi sel sebagai landasan metabolism seluler. Proses metabolism
menghasilkan pembentukan atau pengeluaran produk selk ke luar lingkungan. Esai
dari produk akhir tidak hanya menggambarkan peranan sistem enzim juga dapat
digunakan sebagai ciri pembeda mikrooraganisme.
METODE KERJA
Uji Hidrolisis ; pati, lemak dan protein
Alat dan bahan :
 Tiga tabung media agar tegak yang masing-masing berisi medium Starch Agar
10ml, Tributirin Agar 10ml, dan Media Milk Agar 10ml.
 Larutan Iodin/lugol
 Biakan bakteri uji : Escherichia coli dan Bacillus subtilis
 Tiga buah cawan petri steril
 Ose
 Penangas Air
Cara kerja
1. Cairkan ketiga tabung media agar dalam penangas air, biarkan suhunya turun
dan hingga 40-45°C, tuangkan setiap tabung tadi ke dalam cawan petri steril
dan biarkan memadat.

2. Bagilah setiap bagian bawah cawan petri menggunakan spidol menjadi 2
bagian
3. Inokulasikan setiap bagian cawan petri masing-masing dengan biakan B.
subtilisi dan E.coli
4. Inkubasikan biakan selama 48-72 jam, pada suhu 30-35°C
5. Tetesi cawan petri yang berisi media Starch Agar dengan larutan iodine dan
amati terjadi bagian yang tidak berwarna di sekitar biakan
6. Amati ada tidaknya daerah bening di sekeliling biakan pada cawan petri yang
berisi Tributirin Agar dan Milk Agar
Fermentasi Karbohidrat
Alat dan bahan :
 Lima tabung media cair (Glukosa Phenol Red)

 Lima tabung media cair (Laktosa Phenol Red)
 Lima tabung media cair (Sukrosa Phenol Red)
 Biakan murni B. subtilis, E. coli, dan Staphylococcus aureus
 Jarum ose
Cara kerja
1. Inokulasikan suatu seri media (Glukosam Laktosa, dan Sukrosa) dengan B.

subtilis
2. Ulangi hal yang sama untuk bakteri lain
3. Satu seri mediatidak diinokulasi dan digunakan sebagai control
4. Inkubasi tabung-tabung tersebut selama 48 jam, pada suhu 35°C
5. Amati terjadinya reaksi dan dibandingkan dengan control (A=Asam, G=Gas,
AG= Asam dan Gas).
Uji Katalase
Alat dan bahan :
 Larutan peroksida (H2O2) 3%

 Biakan E. coli dan B. subtilis yang berumur 24 jam
 Jarum Ose
 Gelas Objek

Cara kerja
1. Bersihkan kaca objek dengan alkohol 70%, teteskan beberapa tetes larutan
peroksida 3% diatas gelas objek tersebut
2. Ambil sedikit biakan B. subtilis dengan ose, letakkan di dalam tetesan larutan
peroksida 3%
3. Lakukan hal yang sama untuk bakteri E. coli
4. Amati terjadinya ada gelembung-gelembung O2 di dalam tetesan peroksida
Uji Produksi Indol
Alat dan bahan :
 3 tabung medium cair triptopan 1%

 Reagen Ehrlich atau Kovac
 Biakan E. coli dan S. aureus
 Jarum Ose
Cara kerja
1. Inokulasi biakan E. coli dan S. aureus ke dalam media. Beri label agar jangan
tertukar
2. Tabung ke 3 tidak diinokulasi, dan digunakan sebagai control
3. Inkubasi selama 48 jam pada suhu 30-35°C
4. Amati terjadinya indol dengan menambahkan 1 ml larutan kovac ke dalam
setiap tabung
5. Kocok perlahan-lahan dan biarkan tabung berada dalam posisi tegak supaya
larutan reagen dapat terkumpul di permukaan media
6. Adanya indol dapat diketahui dengan timbulnya warna merah tua pada lapisan
atas permukaan media. Bandingkan hasil ini dengan tabung control.
Uji Oksidase
Alat dan bahan :
 Larutan alfa-naftol 1%
 Larutan p-aminodimetil-oksalat 1%
 Jarum Ose

Cara kerja
1. Inokulasi biakan E. coli dan B. subitilis masing-masing ke dalam 1 tabung

media NB
2. Biarkan satu tabung sebagai kontrol
3. Inokulasikan selama 24 jam pada suhu 30°C
4. Teteskan 0,2 ml larutan alfa-naftol 1% dan 0,3 ml larutan p-aminodimetil-
oksalat 1% ke dalam tabung media
5. Kocok selama 5 menit, warna biru menunjukkan adanya reaksi enzim oksidase
6. Bandingkan dengan kontrol.
Uji Metil Red (MR)
Alat dan bahan :

 3 tabung Media Methyl Red Voges Proskauer (MRVP)
 Jarum Ose
Cara kerja
1. Inokulasi media MRVP dengan 1 ose biakan E. coli dan B. subitilis Biarkan satu
tabung sebagai control
2. Inkubasikan selama 5-7 hari pada suhu 30°C
3. Teteskan 1ml atau 5 tetes reagen MR
4. Amati perubahan warna yang terjadi dan bandingkan dengan kontrol.
Uji Voges Proskauer (VP)
Alat dan bahan :

 3 tabung Media Methyl Red Voges Proskauer (MRVP)
 Jarum Ose
Cara kerja
1. Inokulasi 2 tabung media MRVP dengan 1 ose biakan E. coli dan B. subitilis
Biarkan satu tabung sebagai kontrol
2. inkubasikan selama 5-7 hari pada suhu 30°C

3. Teteskan 15 tetes larutan Barit’s A dan 5 tetes larutan Barit’s B
4. Tunggu selama 20 menit dan amati perubahan warna
Uji Sitrat
Alat dan bahan :

 3 tabung Media sitrat agar miring
 Jarum Ose
Cara kerja
1. Inokulasi 2 tabung media sitrat dengan 1 ose biakan E. coli dan B. subitilis
dengan cara digores, Biarkan satu tabung sebagai control
2. inkubasikan selama 3-5 hari pada suhu 30°C
3. amati perubahan warna pada media tersebut
Uji Oksidase Fermentasi (OF)
Alat dan bahan :
 Biakan murni E. coli dan B. subtilis yang berumur 24 jam

 3 seri Media OF (Hugh & Leifson’s)
 Paraffin oil
 Jarum Ose lurus
Cara kerja
1. Inokulasi 2 tabung seri media OF dengan 1 ose biakan E. coli dan B. subitilis
dengan cara ditusukkan hingga ke dasar tabung, Biarkan satu tabung sebagai
control
2. Tutup seri tabung dengan paraffin oil setinggi 1 cm
3. inkubasikan selama 5-7 hari pada suhu ruang°C
4. Amati perubahan yang terjadi.

HASIL PENGAMATAN
No Uji biokimia Hasil pengujian Keterangan gambar

1 Uji Hidrolisis :
Pati
Lemak
Protein
2 Uji Karbohidrat

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 10
UJI STERILITAS SEDIAAN FARMASI
TUJUAN
Menguji sterilitas sediaan obat dan alat kesehatan
LANDASAN TEORI
Pertumbuhan mikroorganisme dapat dilihat dengan cara menginokulasikan
bahan uji ke dalam media tertentu dan diinkubasi pada suhu yang sesuai.
METODE KERJA
Bahan :
1. Media cair tioglikolat
2. Sabouraud dekstrose cair
3. Kaldu nutrisi
4. Sediaan obat : tetes mata, injeksi, infus, salep mata
5. Alat kesehatan : kasa steril, jarum suntik, dll
Pengujian Langsung
Sediaan Cair
1. Pipet sejumlah volume tertentu cairan dengan pipet atau jarum suntik steril secara
aseptis.
2. Inokulasikan ke dalam media tioglikolat cair dan atau Sabouraud dekstrose cair
dalam tabung reaksi, kocok hingga homogen.
3. Inkubasi pada suhu 37oC untuk media tioglikolat cair, dan pada suhu 25-28oC untuk
media Sabouraud dekstrose cair selama tidak kurang 7 hari.
Salep dan minyak/lemak yang tidak larut dalam isoprapil miristat
Sejumlah sediaan uji didispersikan dalam media pendispersi yang sesuai, sebaiknya
tidak bersifat antimikroba. Cara kerja selanjutnya seperti pada sediaan cair.
Zat padat
Sejumlah sediaan terlebih dahulu dibuat larutan atau suspensi. Kemudian dilakukan
sebagaimana yang tertera pada cara kerja untuk sediaan cair.
Alat Kesehatan
Contohnya : Kasa, perban, pembalut, benang bedah

Cara kerja :
1. Dengan cara aseptis diambil 100-500 mg bahan dari bagian yang paling dalam
dari sampel atau keseluruhan sampel jika ukurannya kecil.
2. Bila sampel dalam bentuk kemasan tunggal, diambil sejumlalh 250-500 mg atau
keseluruhannya jika ukurannya kecil.
3. Cara kerja selanjutnya dilakuakn seperti yang tertera pada sediaan cair.
Alat suntik steril atau siap pakai

1. masukkan cairan pembilas ke dalam wadah dan pasang jarumnya.
2. Bilas wadah melalui jarum suntik secara aseptis
3. Masukkan cairan pembilas ke dalam media tioglikolat cair dan atau Sabouraud
dekstrose cair.
4. Inkubasi pada suhu 37oC untuk media tioglikolat cair, dan suhu 25-28oC untuk
media Sabouraud dektrose cair selama tidak kurang 7 hari.
Cara Penyaringan
Pengujian sterilitas dengan cara penyaringan dilakuakn untuk cairan atau
serbuk yang dapat larut yang bersifat non-bakteriostatik atau fungistatik, bahan-
bahan uji yang berupa lemak/minyak, salep, krim yang dapat dijadikakn larutan dalam
cairan pengencer yang non-bakteriostatik atau fungistatik.
Cara penyaringan ini juga bisa dilakukan untuk pengujian sterilitas dari
cairan/serbuk yang dapat dilarutkakn dan mempunyai sifat bakteriostatik atau
fungistatik dan alat-alat tertentu lainnya. Membran yang sesuai adalah yang berpori
0,45 µm, dengan diameter 47 mm dan kecepatan penyaringan air 55-75 ml/menit
pada tekanan 70 cmHg.
Sediaan yang dimaksudkan untuk pemberian secara iv, setelah disaring
dengan penyaring bakteri, sejumlah volume tertentu seperti yang tertera ditabel
berikut, secara aseptis pindahkan membran dari alat penyaringnya, celupkan
membran atau setengah membran ke dalam 100 ml media tioglikolat cair, kemudian
inkubasi pada 30-35oC selama tidak kurang dari 7 hari.
Tabel 1. Jumlah sampel yang dipakai untuk uji sterilitas

Jumlah Wadah (batch) Jumlah sampel yang dipakai
< 100 10% atau 4, diambil yang besar
≥ 100 – 500 10
> 500 2 % atau 20, diambil yang kecil

Tabel 2. Volume sampel dan media yang digunakan pada uji sterilitas
Volume Wadah (mL) Volume yang diambil Volume media tioglikolat
dari tiap wadah
< 1 mL Seluruh isi 15 mL
1 – 10 mL 1 mL 15 mL
10 - < 50 mL 5 mL 40 mL
50 - < 100 mL 10 mL 80 mL
Tabel 3. Volume sampel yang dipakai untuk uji dengan cara penyarigan
Volume Wadah (mL) Volume yang diambil dari tiap wadah
untuk disaring
Untuk tujuan pemberian intravena :
50 - < 100 Ml Seluruh isi wadah
100 – 500 mL Seluruh isi wadah
> 500 Ml 500 mL

BAGAN KERJA

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 11
PENGENDALIAN MIKROORGANISME
TUJUAN :
Mengamati efektivitas penghambatan aktivitas dan pertumbuhan
mikroorganisme oleh bahan kimia (antiseptic, antibiotik dan desinfektan) untuk
tujuan mengontrol mikroorganisme.
LANDASAN TEORI
Pengendalian pertumbuhan dan kontaminasi mikroorganisme sangat diperlukan
untuk menghambat, membasmi, dan menyingkirkannya karena mikroorganisme
memiliki potensi untuk makhluk hidup lain. Mikroorganisme dapat dikendalikan
secara kimiawi dengan bahan-bahan seperti antiseptic, desinfektan dan antibiotik
Untuk menentukan kualitas desinfektan yaitu menentukan daya bunuh
desinfektan terhadap kuman adalah dengan menggunakan metode koefisien fenol.
Fenol adalah jenis desinfektan yang paling kuno dan karena kekuatannya telah
diketahui maka kualitas desinfektan selalu dibandingkan dengan fenol. Koefisien fenol
adalah bilangan pecahan yang menunjukkan perbandingan kekuatan daya bunuh
dari desinfektan dibandingkan dengan kekuatan daya bunuh dari fenol sebagai
pembanding dalam kondisi yang sama, yaitu jenis bakteri yang sama dan waktu
kontak yang sama. Waktu untuk menguji antibiotika adalah 18-24 jam, sedangkan
untuk mata tidak mungkin selama itu. Oleh karena itu, digunakan waktu tertentu
dengan metode kontak secara konvensional, waktu yang paling cepat adalah 2,5
menit, paling lama 15 menit. Kekuatan fenol untuk menguji desinfektan adalah tidak
lebih besar dari 5%.
Ciri-ciri suatu desinfektan yang ideal adalah memenuhi hal-hal sebagai berikut :
1. Aktivitas antimikrobial, pada konsentrasi rendah harus mempunyai aktivitas
antimikrobial dengan spektrum luas.
2. Kelarutan, harus dapat larut dalam air atau pelarut lain sampai taraf yang
diperlukan untuk dapat digunakan secara efektif.
3. Stabilitas, perubahan yang terjadi pada substansi bila dibiarkan beberapa hari
harus seminimal mungkin dan tidak boleh menghilangkan fsait antimikrobialnya
secara nyata.
4. Tidak bersifat racun
5. Homogen
6. Tidak bergabung dengan bahan organik

7. Aktivitas antimikrobial pada suhu kamar
8. Tidak menimbulkan karat dan warna
9. Kemampuan menghilangkan bau yang kurang sedap
10. Memiliki kemampuan sebagai deterjen/ pembersih
11. Tersedia dalam jumlah yang besar dengan harga yang pantas.
METODE KERJA
Bahan dan Alat
a. Berbagai merek produk antiseptic (sabun cair, pembersih tangan, dll) dengan
konsentrasi sesuai dengan petunjuk pemakaian masing-masing produk.
b. Larutan fenol 1:80, 1:90, 1:100
c. Larutan Lysol 1:400, 1:450, 1:50
d. Biakan murni E. coli
e. Biakan murni Staphylococcus aureus
f. Biakan murni Bacillus subtilis
g. Nutrien agar (NA) dalam tabung reaksi
h. Nutrien Broth (NB) dalam tabung reaksi
i. Tabung reaksi steril kosong
j. Kering saring Whatmann
k. Jarum inokulasi (ose)
l. Pinset
m. Penggaris
n. Pembakar Bunsen
o. Vortex
p. Inkubator
PERCOBAAN
UJI PENGHAMBATAN OLEH ANTISEPTIK
1. Cairkan 4 buah NA dalam tabung reaksi, lalu biarkan hingga temperaturnya menjadi
45oC
2. Inokulasikan 2 tabung NA dengan E.coli dan 2 tabung NA lain dengan B.subtilis.
campurkan dengan baik dan taungkan masing-masing ke petri steril, lalu biarkan
agar menjadi beku.
3. Celupkan kertas saring yang telah digunting menjadi bentuk lingkaran berdiameter
1 cm ke dalam larutan antiseptic yang diuji, lalu biarkan mengering.
4. Letakkan setiap satu potongan kertas saring pada bagian tengah plat E. coli dan B.
subtilis.

5. Lakukan prosedur 1-4 untuk menguji larutan produk antiseptic lain.
6. Inkubasikan pada temperature 37C selama 24-48 jam
7. Amati daerah hambat pertumbuahan bakteri di sekitar potongan kertas saring.
Ukur diameter lingkaran yang tidak terdapat pertumbuhan.
UJI PENGHAMBATAN OLEH DESINFEKTAN (KOEFISIEN FENOL)

1. Siapkan 6 buah tabung reaksi kosong steril dan 18 buah tabung berisi media NB
steril, beri label.
2. Pada tabung-tabung reaksi steril kosong, beri setetes larutan fenol atau Lysol yang
berbeda-beda konsentrasinya.
3. Inokulasi setiap tabung uji dengan setetes kultur S. aureus berumur 24 jam, lalu
4. Pada setiap interval 5, 10 dan 15 menit, ambil 1 loop ose penuh dari setiap tabung
uji berisi desinfektan dan bakteri, lalu inokulasi ke dalam media NB dalam tabung
reaksi.
5. Inkubasikan pada temperature 37C selama 48 jam.
6. Amati pertumbuhan yang terjadi :
Beri tanda + (terdapat pertumbuhan) pada medium NB yang keruh,
tanda – (tidak ada pertumbuhan) pada medium NB yang tetap jernih.
7. Tentukan angka koefisien fenol dari bahan kimia yang diuji (dalam hal ini Lysol
adalah bahan kimia yang diuji).
Perhitungan
Koefisien Fenol adalah : Hasil bagi dari faktor pengenceran tertinggi desinfektan
dengan faktor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat
membunuh bakteri uji dalam jangka waktu 10 menit, tetapi tidak membunuh dalam
jangka waktu 5 menit.
Contoh :
Desinfektan dan Pertumbuhan setelah interval waktu (menit)

konsentrasi
5 10 15
Fenol 1 : 80 - - -
1 : 90 + - -
1 : 100 + + -
Lysol 1 : 400 - - -
1 : 450 + - -
1 : 500 + + -

Keterangan :
Larutan Lysol 1:450 menunjukkan tidak ada pertumbuhan pada waktu 10 menit,
tetapi ada pertumbuhan pada waktu 5 menit.
Larutan fenol 1: 90 menunjukkan tidak ada pertumbuhan pada waktu 10 menit, tetapi
ada pertumbuhan pada waktu 5 menit.
Maka koefisien fenol dari Lysol adalah : 450/ 90 = 5
BAGAN KERJA

HASIL PENGAMATAN
UJI PENGHAMBATAN OLEH ANTISEPTIK
Produk Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri (mm)
Antiseptik E. coli B. subtilis
UJI PENGHAMBATAN OLEH DESINFEKTAN (KOEFISIEN FENOL)

Pertumbuhan setelah interval waktu (menit)
Desinfektan dan konsentrasi
5 10 15
1 : 80
1 : 90
Fenol
1 : 100
1 : 400
1 : 450
Lysol
1 : 500
UJI PENGHAMBATAN OLEH ANTIBIOTIK

Produk Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri (mm)
Antibiotik E. coli B. subtilis

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 12
UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA METODE DILUSI
TUJUAN
Menentukan besarnya potensi sampel antibiotika di pasaran terhadap
antibiotika standar.
LANDASAN TEORI
Penetapan Potensi Antibiotika menurut FI III
Perbandingan dosis sediaan uji dengan dosis larutan standar atau larutan
pembanding yang menghasilkan derajat hambatan pertumbuhan yang sama pada
biakan jasad renik yang peka dan sesuai. Aktivitas (potensi) antibiotik dapat
ditunjukkan pada kondisi yang sesuai dengan efek daya hambatannya pada mikroba.
Suatu penurunan aktivitas antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan
kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara
mikrobiologi atau biologi biasanya merupakan suatu standar untuk mengatasi
keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas.
Farmakope Indonesia menentukan bahwa potensi antibiotika standar berkisar
antara 95-105%. Namun potensi tersebut dapat menurun karena kadaluwarsa,
penyimpanan yang tidak benar dan terjadinya penguraian obat yang menghasilkan
zat lain yang tidak memiliki efek lagi.
METODE KERJA
Alat :
1. Cawan Petri
2. Ose
3. Penyaring bakteri
4. Kertas cakram/silinder stainless
5. Pipet mikro
6. Jangka sorong
7. Inkubator
Bahan :
1. Antibiotika uji (kapsul amoksisilin trihidrat)
2. Antibiotika standar
3. Kuman standar (Micrococcus luteus ATCC 9341)

4. Medium cair ; kaldu tioglikolat, kaldu BHI
5. Medium Padat : base layer (lapisan dasar)=medium 2
Seed layer (lapisan perenihan) = medium 11 Agar miring
6. Bahan pembantu : dapar fosfat (pH 8), larutan NaCl fisiologis
PERCOBAAN
1. Pembuatan Inokulum
a. Tanam kuman standar pada agar miring, eramkan 18-24 jam pada suhu 37oC.
b. Kuman dari pertumbuhan diatas diencerkank dalam 5 mL lar NaCl fisiologis,
sehingga kekeruhan sesuai dengan Mc Farland III.
c. Siapkan 4 tabung steril, isi masing-masing tabung dengan 9 mL NaCl fisiologis.
d. Suspensi kuman diencerkan 10x, 100x, 1000x, dan 10.000x dengan cara :
ambil suspensi kuman (2) sebanyak 1 mL masukkan dalam tabung 1, kocok hingga
homogen. Ambil 1 mL dari tabung 1, masukkan dalam tabung 2, kocok hingga
homogen. Dengan cara ini diperoleh pengenceran 10x, 100x, 1000x dan 10.000x
pada masing2 tabung 1,2,3 dan 4.
e. Dari hasil pengenceran diatas yang digunakan sebagai inokulum adalah
pengenceran 10.000x (setara dengan 106 kuman/mL)
2.. Pembuatan Lapisan dasar (base layer)

a. Siapkan 6 cawan petri steril
b. Tiap cawan petri diisi 10 mL lapisan dasar/ medium 2
c. Usahakan merata menutupi seluruh permukaan alas cawan petri.
d. Biarkan memadat
3. Pembuatan lapisan Perbenihan

a. Siapkan 6 tabung reaksi steril
b. Isi masing-masing tabung dengan 4 mL lapisan perbenihan (medium 11) yang
telah dicairkan. Setelah suhu mencapai 45-60oC masukkan 1 mL suspensi kuman
yang setara dengan 106 kuman/mL.
c. Kocok hingga homogen, setelah itu tuangkan pada setiap cawan petri yang sudah
berisi lapisan dasar.
d. Ratakan pada seluruh permukaan lapisan dasar, dengan menggoyangkan cawan
petri ke kanan dan kiri. Biarkan hingga memadat.

4. Pembuatan Larutan Stok Amoksisilin trihidrat/Obat Yang Diuji Potensinya.
a. Timbang seksama sampel setara dengan 57,4 mg amoksisilin trihidrat atau
setara dengan 50 mg amoksisilin anhidrat.
b. Larutkan dengan air suling secukupnya dan encerkan dengan dapar fosfat pH 8
hingga 50 mL.
c. Ambil 2,5 mL larutan tersebut lalu encerkan dengan larutan dapar fosfat pH 8
hingga 25 mL
d. Maka diperoleh larutan stok dengan kadar 100 µg/mL
e. Saring dengan penyaring bakteri.
5. Pengenceran Larutan Stok Amoksisilin
a. Pipet 9 mL larutan stok (100 µg/mL), encerkan hingga 100 mL, maka diperoleh
larutan dengan konsentrasi 9 µg/mL.
b. Juga dibuat pengenceran hingga diperoleh kadar 12 µg/mL dan 16 µg/mL.
c. Selanjutnya larutan tersebut disebut dengan U1 = 9 µg/mL; U2 = 12 µg/mL, dan
U3 = 16 µg/mL.
U1 : U2 = 3 : 4
U2 : U3 = 3 : 4
6. Cara Pembuatan Larutan Standar Amoksisilin (S)
Prosedurnya sama dengan prosedur pembuatan larutan uji
S1 : S2 = 3 : 4
S2 : S3 = 3 : 4
7. Pemasangan silinder/cakram kertas pada lapisan agar didalam cawan petri
Letakkan silinder/cakram kertas dengan jarak satu sama lain ± 20-35 mm,
seperti gambar berikut :
S1
S3 U2
S2 U3
U1
Cara Meneteskan Larutan Uji (U) dan standar (S)

a. Urutkan penetesan seperti gambar diatas
b. Teteskan setiap pengenceran 20 µL pada silinder atau kertas cakram (diameter 6
mm).

c. Pada waktu meneteskan pada silinder besi tahan karat/cakram jangan kena
dinding silinder
d. Inkubasi selama 18-24 jam suhu 37oC
Perhitungan
Standar (U) Uji (U)
Jumlah zona kadar rendah ∑ S1 ∑ U1
Jumlah zona kadar tengah ∑ S2 ∑ U2
Jumlah zona kadar tinggi ∑ S3 ∑ U3
Jumlah sediaan ∑ (S1 + S2 + S3) = S ∑ (U1 + U2 + U3) = U
Kontras Linier S3 – S1 = Ls U3 – U1 = Lu
Ls + Lu S U Yu - Ys
b = Ys = Yu = Mu =
(d – 1) i n h nd nd b
Rasio Potensi Ru = Antilog Mu Potensi = Ru x 100%
Keterangan :
b = slope regresi zona log konsentrasi semua sediaan
d = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3
h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2
n = banyaknya penggandaan tiap perlakuan = 6
i = Interval log konsentrasi berdampingan
( log S1 – log S2 = log S2 - log S3)

BAGAN KERJA

HASIL PENGAMATAN

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 13
UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA EKSTRAK SAMPEL
TUJUAN
Mengetahui aktivitas antimikroba dari ektrak tanaman atau dari
mikroorganisme endofit tertentu.
LANDASAN TEORI
Zat antimikroba adalah senyawa biologis atau kimia yang dapat menghambat
pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Menurut Fardiaz (1989), zat antimikroba dapat
bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan
bakteri), fungisidal, fungistatik atau menghambat germinasi spora bakteri.
Kemampuan suatu zat antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroba
dipengaruhi oleh berbagai faktor, yaitu : (1) konsentrasi zat antimikroba, (2) suhu
lingkungan, (3) waktu penyimpanan, (4) sifat-sifat mikroba, meliputi jenis, jumlah,
umur, dan keadaan mikroba, (5) sifat-sifat fisik dan kimia makanan termasuk kadar air,
pH, jenis, dan jumlah senyawa di dalamnya (Frazier dan Westhoff, 1988).
Kriteria ideal suatu antimikroba antara lain harus memiliki sifat-sifat sebagai
berikut : aman, ekonomis, tidak menyebabkan perubahan flavor, citarasa dan aroma
makanan, tidak mengalami penurunan aktivitas karena adanya komponen makanan,
tidak menyebabkan timbulnya galur resisten, sebaiknya bersifat membunuh daripada
hanya menghambat pertumbuhan mikroba (Ray, 2001). Penghambatan aktivitas
antimikroba oleh komponen bioaktif tanaman dapat disebabakan oleh beberapa
faktor, antara lain : (1) gangguan pada senyawa penyusun dinding sel, (2) peningkatan
permeabilitas membran sel yang menyebabkan kehilangan komponen penyusun sel,
(3) menginaktifasi enzim metabolik, dan (4) destruksi atau kerusakan fungsi material
genetik (Branen dan davidson, 1993).

METODDE KERJA
1. Pengukuran Aktivitas Antimikroba
Metode yang digunakan metode difusi. Kertas cakram berisi ekstrak teh hijau
dan teh hitam ditempatkan pada permukaan medium padat yang sebelumnya telah
diinokulasi mikroba uji pada permukaannya. Setelah dilakukan inkubasi selama 24
jam, diukur diameter zona hambatan yang terbentuk di sekitar cakram untuk
mengukur kekuatan hambatan terhadap organisme uji.
2. Persiapan Perlakuan
a. Sterilisasi
Alat-alat yang akan digunakan disterilisasikan terlebih dahulu sebelum
penelitian. Alat-alat disterilkan menggunakan autoclave dengan suhu 1210C dan
tekanan 15 Psi selama 15-20 menit. Alat-alat yang sudah disterilkan kemudian
ditunggu dulu sehingga mencapai suhu kamar dan sudah kering.
b. Cara pembuatan konsentrasi ekstrak
1). Ekstrak sampel x sebanyak 0,25 gram ditambahkan 5 ml aquades kemudian
diaduk. Didapatkan ekstrak teh hijau dengan konsentrasi 5%.
2). Ekstrak sampel x sebanyak 0,5 gram ditambahkan 5 ml aquades kemudian
3). Ekstrak sampel x sebanyak 1 gram ditambahkan 5 ml aquades kemudian
Tabung A: Seduhan sampel x dengan konsentrasi 5%
Tabung B: Seduhan sampel x dengan konsentrasi 10%
Tabung C: Seduhan sampel x dengan konsentrasi 20%
Tabung D: Seduhan sampel x dengan konsentrasi 40%
Tabung E: Seduhan sampel x dengan konsentrasi 80%
c. Identifikasi dan Pembuatan Suspensi Mikroba Staphylococcus aureus
Identifikasi dan Pembuatan Suspensi Mikroba S. aures dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi
d. Penyiapan ekstrak teh hijau dan kontrol
1. Disiapkan 6 buah tabung reaksi (A,B,C,D,E dan kontrol)
2. Tabung A berisi seduhan teh hijau dengan konsentrasi 5%
3. Tabung B berisi seduhan teh hijau dengan konsentrasi 10%
4. Tabung C berisi seduhan teh hijau dengan konsentrasi 20%

5. Tabung D berisi seduhan teh hijau dengan konsentrasi 40%
6. Tabung E berisi seduhan teh hijau dengan konsentrasi 80%
7. Tabung kontrol diisi dengan aquades steril 10 ml
e. Penyiapan ekstrak teh hitam dan kontrol
1. Disiapkan 6 buah tabung reaksi (A,B,C,D,E dan kontrol)
2. Tabung A berisi seduhan teh hitam dengan konsentrasi 5%
3. Tabung B berisi seduhan teh hitam dengan konsentrasi 10%
4. Tabung C berisi seduhan teh hitam dengan konsentrasi 20%
5. Tabung D berisi seduhan teh hitam dengan konsentrasi 40%
6. Tabung E berisi seduhan teh hitam dengan konsentrasi 80%
7. Tabung kontrol diisi dengan aquades steril 10 ml
h. Uji aktivitas antibakteri ekstrak teh hijau dan ekstrak teh hitam terhadap
Staphylococcus aureus secara in vitro
1. Penyiapan alat yang telah disterilisasi serta penyiapan bahan yang telah
disesuaikan konsentrasinya yang akan digunakan.
2. Pembuatan larutan kontrol, ekstrak teh hijau dan ekstrak teh hitam.
3. Kertas cakram dengan diameter 6 mm yang telah disterilisasi dimasukan ke
dalam larutan kontrol, ekstrak hijau dan ekstrak teh hitam dengan
menggunakan pinset steril, kemudian direndam beberapa saat (± 10 menit)
hingga larutan tersebut tersebut terhisap sempurna oleh kertas
4. Pembuatan suspensi mikroba Staphylococcus aureus dengan larutan NaCl
fisiologis hingga mencapai standar 0,5 Mc Farland.
5. Sebarkan mikroba di permukaan MHA plate dengan menggunakan alat
penyebar mikroba kemudian diratakan.
6. Kertas cakram dalam larutan kontrol, ekstrak teh hijau dan ekstrak teh hitam
diambil dengan menggunakan pinset steril, kemudian disusun pada cawan petri
yang telah berisi MHA plate yang sebelumnya telah ditanami mikroba S. aureus.
7. Kemudian semua cawan petri dimasukan ke dalam inkubator untuk diinkubasi
pada suhu 370C selama 24 jam.
8. Cawan petri yang telah diinkubasi diamati apakah terbentuk zona hambatan
disekeliling kertas cakram.
9. Diameter zona hambatan yang terbentuk dilakukan pengukuran dengan
menggunakan jangka sorong. Zona hambatan diukur dari tepi ke tepi melewati
kertas cakram. Lakukan percobaan sebanyak 3 kali.

BAGAN KERJA

HASIL PENGAMATAN

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

Praktikum 14
MIKROBIOLOGI PRODUK PANGAN
TUJUAN
Mengamati perubahan senyawa menjadi senyawa lain dalam proses

fermentasi, baik fermentasi alkoholik maupun non-alkoholik.
LANDASAN TEORI
Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energy melalui serangkaian

reaksi enzimatis yang bekerja sesuai urutan dan terintegrasi untuk melangsungkan
biooksidasi substrat terutama karbohidrat. Lintasan utama dalam reaksi biooksidasi
menurut Sunatmo (2009) adalah :
- Respirasi sel secara aerob, yaitu biooksidasi dengan oksigen molekuler sebagai
akseptor electron terakhir.
- Respirasi sel secara anaerob, yaitu biooksidasi dengan ion anorganik NO3- dan
SO42-sebagai akseptor electron terakhir.
- Fermentasi yaitu proses biooksidasi yang tidak memerlukan oksigen dengan
subtrat organik sebagai akseptor electron terakhir.
Mikroorganisme dapat menggunakan berbagai karbohidrat tergantung sistem
enzim yang dimiliki. Beberapa organisme dapat memfermentasi gula seperti glukosa
secara anaerobic atau aerobic. Sedangkan yang bersifat anaerobic fakultatif dapat
menggunakan lintasan aerobik dan anaerobik. Pada fermentasi, subtstrat seperti
karbohidrat dan alkohol akan mengalami disimilasi anaerobic dengan menghasilkan
asam organic (asam laktat, format, asetat dan lain-lain) yang diikuti gas hydrogen atau
CO2. Mikroorganisme anaerob fakultatif biasanya pelaku fermentasi karbohidrat.
Fermentasi dikaitkan dengan degradasi glukosa melalui lintasan Embden-Meyerhoff
atau lintasan glikolisis (Sunatmo, 2009).
Fermentasi merupakan kerja enzim mikroorganisme yang mengubah suatu

senyawa menjadi senyawa lain dalam proses oksidasi reduksi yang menghasilkan
energi. Donor dan akseptor electron dalam proses ini adalah senyawa organic.
Berdasarkan substrat yang digunakan, fermentasi dikelompokkan menjadi fermentasi
substrat padat dan fermentasi substrat cair. Berdasarkan produk akhir yang
dihasilkan, fermentasi dikelompokkan menjadi fermentasi yang menghasilkan alkohol
(fermentasi alkoholik) dan fermentasi yang menghasilkan produk akhir bukan alkohol
(fermentasi non-alkoholik). Contoh produk fermentasi alkoholik adalah tape, wine,
whisky dan lain-lain. Sedangkan contoh produk fermentasi non-alkoholik adalah
tempe, nata de coco, yoghurt, asam-asam organik, dan lain-lain (Pikoli dan Radiastuti,
2003).
METODE KERJA
Pembuatan Yoghurt (Sugoro, 2005)

Peralatan yang dibutuhkan :
 Wadah fermentasi / botol sirup

 Penangas air
 Thermometer
 Gelas ukur
 Inkubator
Bahan yang digunakan :
 Susu segar baik yang sudah dipasteurisasi maupun yang belum

 Kultur starter bakteri laktat : Lactobacillus sp., Streptococcus thermophillus, dan
Bifidobacterium sp.
Cara kerja
1. Bahan atau sampel susu dipasteurisasi pada suhu 80-85°C, selama 15 menit
2. Susu didinginkan sampai suhu mencapai suhu 45°C, lalu tambahkan kultur starter
sebanyak 5-10% sedikit demi sedikit sambil diaduk supaya bercampur dan larut
3. Kemudian tutup dengan plastik atau aluminium foil dan diinkubasi pada suhu 40-
45°C selama 4 jam atau pada suhu kamar selama 1-3 hari

4. Setelah inkubasi selesai, yoghurt yang dihasilkan segera simpan dalam lemari
pendingin dan atau langsung bisa dilakukan pengamatan
5. Pengamatan dilakukan dengan melihat nilai pH, kandungan asam laktat, rasa,
jumlah mikroba, protein dan kandungan laktosanya.
Pembuatan Nata de Coco (Pikoli dan Radiastuti, 2003)
Peralatan :
 Keller, gelas atau Loyang plastik tempat media fermentasi

 Panci pemasak dari aluminium atau stain less
 Ember atau gentong plsatik untuk perendaman produk
 Jerigen untuk air kelapa
 Pengaduk kayu atau plastik
 Gelas ukur
 Timbangan
 Pisau potong manual atau mesin potong nata
 Botol sirup untuk bibit
 Kompor gas atau minyak tanah
 Kain saring/kain kassa
Untuk setiap liter air kelapa diperlukan:
 Gula pasir 50 gr/L

 Asam cuka glacial (99%)sebanyak 10 ml/L
 Nutrisi (ZA atau urea) sebanyak 3 gr/L atau DAP (Di Amonium Phospat) 0,1-3%
(1-3 gr/L air kelapa)
 Cairan bibit / kultur starter Acetobacter xylinum untuk pengembangan dan
penurunan 12,5 ml.
Cara kerja
1. Saring air kelapa dengan kain saring

2. Ukur volum sesuai yang dikehendaki
3. Panaskan air kelapa sampai mendidih
4. Tambahkan bahan-bahan (gula,ZA) aduk sampai dengan merata
5. Tambahkan asam cuka, aduk dan angkat

6. Untuk membiakkan bibit masukkan kedalam botol sebanyak dua pertiga bagian
isi botol, tutup kertas dan biarkan dingin
7. Untuk membentuk nata bentuk lembaran masukkan air kelapa masak dalam
keadaan panas kedalamkedalam keller atau Loyang dengan ketinggian 1-1.5 cm,
tutup kertas Koran dan biarkan dingin.
8. Setelah dingin (suhu kamar) tambahkan cairan bibit kedalam botol yang akan
digunakan untuk menurunkan bibit sebanyak 10% (1 botol bibit untuk 10 botol
bakal bibit)
9. Untuk pembuatan bata lembar, masukkan cairan bibit kedalam Loyang atau
keller sebanyak 1 botol bibit untuk 5 sampai 6 loyang.
10. Peram botol atau Loyang yang telah diisi bibit selama 7-14 hari sampai terlihat
padatan memutih (untuk bibit botol) atau sampai cairan memadat semua
(dalam Loyang atau keller)
11. Bibit yang telah terbentuk lapisan nata dapat diturunkan ke dalam botol atau
loyang.
12. Panen lapisan nata (dalam Loyang) buang lapisan lender bagian bawah
dengancara mengerok
13. Potong membentuk dadu atau sesuai keinginan yang dikehendaki
14. Cuci potongan nata dan masak, lalu rendam semalam atau sampai bebas asam
15. Nata potong siap untuk dibuat manisan dalam kemasan gelas atau plastik
Pembuatan Cuka Apel
Peralatan yang digunakan :
 Wadah fermentasi : botol erlenmeyer atau botol sirup

 Kain kasa
 Ekstrak sari buah apel atau jus apel
Cara kerja

1. Masukkan ekstrak sari buah apel atau jus apel ke dalam botol atau erlenmeyer
untuk dilakukan inkubasi
2. Berikutnya botol ditutup menggunakan kain kasa atau kain berbahan katun
3. Simpan dan Inkubasi pada tempat yang terlindung dengan suhu kamar selama
7-14 hari dalam keadaan anaerobic untuk proses fermentasi secara sempurna
4. Setelah masa inkubasi selesai, cairan ekstrak tadi akan berubah menjadi cairan
dengan bau tajam dan memiliki rasa yang keras menyengat
5. Kemudian cairan tersebut disaring
6. Panaskan hasil saringan tadi pada suhu 80-85°C selama 30 menit
7. Kemudian dinginkan dan simpan dalam suhu ruang dan cuka siap digunakan
dan diamati kadar asam asetat dan pengukuran pH.
Pembuatan Bioetanol (sugoro, 2005)

Peralatan yang digunakan :
 Wadah fermentasi : botol sirup

 Aluminium foil atau plastik penutup
 Substrat organik seperti ; Ubi kayu, ubi jalar, sari buah, limbah sayuran, dan lain-
lain
 Molase
 Asam laktat
 Air mineral
 Kultur starter khamir Saccharomyces cereviceae atau ragi tape
Cara kerja
Fermentasi etanol menggunakan Khamir
1. Inokulasi 30 ml malt ekxtract broth dengan khamir dalam medium Potato

dextrose agar (PDA) berumur 1 hari. Tandai Erlenmeyer dengan A. jangan
dididihkan
2. Tambahkan 3 tetes molase ke dalam 2 tabung yang berisi air steril. Label dengan
A dan B. tabung B jangan dididihkan atau diinokulasi.

3. Didihkan tabung C selama 10 menit. Biarkan dingin hingga sama dengan suhu
kamar dan inokulasi dengan khamir
4. Inkubasi ketiga tabung pada suhu kamar
Produksi Etanol
1. Kultur cair inokulum khamir dalam medium malt extract broth berumur 1 hari
disiapkan
2. Siapkan medium perlakuan (seperti contoh substrat diatas) @ 30 ml medium
perlakuan misalkan (perlakuan A : larutan molasses 1%, B: ekstrak sari buah +
molasses 1%, C : ekstrak limbah sorgum + molasses 1%, D : ekstrak sari buah dan
E : ekstrak limbah sorgum) yang telah disterilisasi dengan autoklaf 121°C selama
15 menit
3. Tambahkan 0,33 ml asam laktat 10% ke dalam medium
4. Inokulasikan 10% (v/v) kultur cair inokulum khamir ke dalam medium perlakuan
5. Amati perubahan medium setelah inkubasi (warna, kekeruhan, aroma, adanya
gas dan lain-lain). Ukur kadar etanol dengan cara pemanasan pada suhu 80°C
selama 30 menit . Penentuan % etanol = volume akhir/volume awal * 100%
Pengamatan
1. Amati aroma dari malt extract broth sebagai tanda terjadinya fermentasi (aroma
etanol)
2. buka pelan-pelan tutup tabung dan cek untuk produksi gas dan alkohol
3. ukur pH
HASIL PENGAMATAN

PEMBAHASAN

KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA

DAFTAR PUSTAKA
Aryantha, N.I. 2000. Pedoman Praktikum Mikrobiologi. Jurusan Biologi
FMIPA ITB, Bandung
Cappuccino, J.G. and N. Sherman. 1996. Microbiology : A Laboratory Manual.

Fourth edition. The Benjamin/Cummings Publishing Company. Inc.,
California
Gandjar, I., dkk. 1998. Pedoman Praktikum Mikrobiologi. UI. Jakarta
Hadietomo, S.R. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Penerbit PT.

Gramedia, Jakarta
Pelczar, M.J. and E.S.C. Chan. 1977. Laboratory Exercise in Microbiology.

Fourth edition. McGraw-Hill, New york
Pikoli, M.R. and N. Radiastuti. 2003. Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Dasar. Laboratorium Mikrobiologi. Program Studi Biologi FST-UIN.
Jakarta
Purwoko, Tj. 2007. Fisiologi Mikroba. Editor, Junwinanto- ed.1, Cet. 1. Jakarta
: Bumi Aksara
Ratnawati dan R. Safitri. 1992. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar.

Jurusan Biologi FMIPA UNPAD, Jatinangor
Seeley, H.W., Jr. and P.J. VanDemark. 1962. Microbse in Action : A Laboratory
Manual of Microbiology. Second edition. W.H. Freeman and Company,
San Fransisco
Sugoro, I. dan M.R. Pikoli. 2004. Uji Viabilitas Isolat Khamir Bahan Probiotik
Dalam Cairan Rumen Kerbau Steril. Jurnal Saintika. UIN Syarif
Hidayatullah. Jakarta.
Sugoro, I. 2005. Panduan Praktikum Teknologi Bioproses. Fakultas Sains dan

Teknologi. Jakarta.
Sunatmo, T. I. 2009b. Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium.

Departeman Biologi-Fakultas MIPA. Institut Pertanian Bogor. Ardy
Agency, Jakarta.
Waluyo, L. 2009. Teknik Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UMM Press.

Malang. Hlm 230.

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2015 Edit

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi 2015 Edit

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN)

SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Program Studi Farmasii

Puteri Amelia, M.Farm., Apt

Program Studi Farmasi

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 2

Alhamdulillaahirobbil’aalamiiin, Puji syukur kehadirat Allah SWT sehingga buku

Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi diadakan untuk membantu

Jakarta, Februari 2016

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 3

Demi kelancaran pelaksanaan praktikum mikrobiologi, praktikan diwajibkan

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 4

KATA PENGANTAR .............................................................................................. 3

TATA TERTIB PRAKTIKUM ................................................................................... 4

DAFTAR ISI ........................................................................................................... 5

1. Pengenalan Alat-alat Dasar dalam Mikrobiologi ............................................. 6

2. Sterilisasi dan Pembuatan Media ..................................................................... 23

3. Teknik Pemindahan Kultur Biakan Mikroorganisme .......................................... 40

4. Pembuatan Preparat Kering dan Pewarnaan Sel Bakteri …................................ 48

5. Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme ……………………………………………………………… 58

6. Enumerasi Mikroorganisme ............................................................................... 67

7. Isolasi Mikroorganisme dari Lingkungan ......................................................... 73

8. Pengaruh Faktor Lingkungan Terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme ............ 86

9. Aktivitas Biokimia dari Mikroorganisme …...................................................... 92

10. Uji Sterilitas Sediaan Farmasi ....................................................................... 102

11. Pengendalian Mikroorganisme ....................................................................... 108

12. Uji Aktivitas Antimikroba Metode Dilusi …………............................................. 115

13. Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak Sampel ….................................................. 123

14. Mikrobiologi Produk Pangan ………………………………………………………………………… 130

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………….………………………………… 141

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 5

PENGENALAN ALAT – ALAT DASAR

1.a. Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope)

Berikut merupakan pejelasan tentang cara bagian-bagian dan spesifikasi mikroskop

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 6

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 7

Cara Menggunakan Mikroskop :

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 8

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 9

1.c. Inkubator (Incubator)

1.d. Hot plate stirrer dan Stirre bar

Pengadukan dengan bantuan batang magnet

1.e. Colony counter

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 10

Prosedur penggunaan BSC pada laboratorium mikrobiologi adalah sebagai

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 11

Dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 12

2.b. Pipet Ukur (Measuring Pippete)

Cara penggunaanya adalah cairan disedot

2.c. Pipet tetes (Pasteur Pippete)

2.d. Tabung reaksi (Reaction Tube / Test Tube)

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 13

2.e. Labu Erlenmeyer (Erlenmeyer Flask)

2.f. Gelas ukur (Graduated Cylinder)

2.g. Batang L (L Rod)

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 14

2.i. Beaker Glass

2.j. Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)

2.k. Tabung Durham

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 15

3.c. Indikator Universal

Praktikum Mikrobiologi Farmasi Page 16

Tabel 1. Pengenalan dan fungsi bagian-bagian Mikroskop