TUGAS

PROSES EKSTRAKSI DNA

JELITA

2022010021

PRODI BUDIDAYA PERIKANAN

JURUSAN TEKNOLOGI BUDIDAYA PERIKANAN

POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PANGKAJENE

KEPULAUAN
 BAB 1

PENDAHULUAN

Ilmu genetika merupakan salah satu cabang ilmu dari biologi, sama halnya

yang berhubungan dengan materi genetik, mulai dari DNA dan RNA hingga

penjelasan teori evolusi yang pertama kali. Contohnya DNA dapat memanfaatkan

untuk mengidentifikasi kelainan genetik atau penyakit hingga penemuan obatnya

dengan cara memanipulasi dan bereksprerimen dengan DNA tersebut. Asam nukleat

adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika unit-unit

pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut EKSTRAKSI DNA

Adi Bagus Siswoyo (C14170028)1 Kelompok 6 1Departemen Budidaya Perairan,

FPIK, IPB 2 dioksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida

disebut asam ribonukleat (RNA) (Faatih 2009).

DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam

bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan

perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel. DNA seringkali dirujuk

sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk penurunan sifat

genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini misalnya

dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama pembelahan sel,

DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama reproduksi (Campbell

2000). RNA merupakan polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap

nukleotida memiliki satu gugus fosfat, satu gugus gula ribosa, dan satu gugus basa

nitrogen (basa N). Polimer tersusun dari ikatan berselang-seling antara gugus fosfat

dari satu nukleotida dengan gugus gula ribosa dari nukleotida yang lain (Faatih 2009).

Ekstraksi DNA merupakan teknik prmisahan DNA yang pertama kali

dilakukan untuk mendapatkan DNA murni. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan

berbagai metode konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara

umum memiliki tahapantahapan yang meliputi isolasi dari jaringan, pelisisan dinding

dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi serta presipitasi atau pemadatan.

Setelah itu DNA hasil ekstraksi divisualisasikan dengan gel agarose electrophoresis

dengan bantuan sinar UV.

a. Tujuan
1. Mengetahui penjelasan mengenai ekstraksi DNA

Mengetahui bagaimana cara mengekstraksi DNA, kuantfikasi DNA dan

memvisualisasikan hasil ekstraksi DNA

3. Mengetahui proses ekstraksi DNA sirip ikan nila

b. Manfaat

Manfaat pembuatan makalah ini untuk memenuhi tugas mata kuliah

Bioteknologi Akuakultur. Selain itu, bermanfaat untuk pembaca, maupun

pembuat mengetahui mengenai proses-proses ekstraksi DNA.

II.

METODOLOGI

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan yaitu thermo incubator, refrigerated centrifuge, vortex,

microtube, micropipette, microtips, micropestle, alat bedah, plastic glove, botol adar

80 ml, agar plate, sisir dan cetakan agar, microwave/kompor listrik, eletrophoresis

chamber dan power supply (BioRad USA), Gel-DOC Trans-UV illuminator, masker,

dan tisu. Sementara itu, bahan yang digunakan yaitu sirip ekor ikan lele, ikan gurame,

ikan betok, cell lysis solution, protein precipitation solution, RNAse A, Nuclease Free

Water (NFW), Isopropanol pro-analys grade, ethanol 70 % pro analys, larutan DNA

untuk analisa, 1X TBE-ETBR buffer, Agarose powder, Loading dye, DNA ladder,

Akuades.

Metode

a.Ekstraksi DNA

1. Lisis sel

Semua peralatan akan digunakan dalam pembuatan ekstraksi DNA

diautoclave (121 ° C selama 15-20 menit). Sampel ikan ditimbang 10 hingga 20 mg,

kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro (1,5 ml). Solusi Lisis Sel 200 μl dan

larutan Proteinase K 1,5 μl ditambahkan ke tabung mikro. Tabung yang mengandung

suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 55°C selama 3-24 jam (semalam).

2. Eliminasi RNA

Sebanyak 1,5 μl Rnase (4 mg/ml) dimasukkan ke dalam setiap tabung

(pipetting) dan kemudian diaduk dengan memutar tabung (pembalik) 25 kali.

Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Setelah inkubasi selesai, sampel dibiarkan
pada suhu kamar sampai mencapai kondisi suhu yang sama dengan

suhu kamar.

3. Pengendapan protein

Solusi Presipitasi Protein 200 μl dimasukkan ke dalam larutan sampel

kemudian divorteks dengan kecepatan tinggi (kecepatan 3-4) selama 30 detik.

Sampel diinkubasi di atas es selama 10-15 menit. Kemudian sampel disentrifugasi

pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit untuk membentuk endapan protein dan

larutan yang mengandung DNA.

4. Pengendapan DNA

Larutan supernatan yang terbentuk dituang dengan hati-hati ke dalam

tabung baru yang mengandung 600 μl 100% (absolut) larutan Isopropanol. Tabung

yang berisi larutan DNA kemudian diaduk dengan memutar tabung (pembalik) secara

perlahan sebanyak 50 kali hingga untaian putih pita DNA terlihat. Kemudian tabung

disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit untuk membentuk pelet DNA di

bagian bawah tabung. Solusi supernatan dihilangkan. 300 μl 70% larutan etanol

dingin dimasukkan ke dalam tabung yang berisi pelet DNA. Tabung disentrifugasi

pada 12.000 rpm selama 10 menit. Kemudian larutan etanol dihilangkan dengan hatihati,
kemudian tabung dikeringkan di atas kertas tisu dan dibiarkan mengeringkan

udara selama 30 menit. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan dengan menambahkan

30-50 μl NFW ke tabung. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer (20°C)

atau langsung digunakan untuk diproses lebih lanjut.

b. Elektroforesis

1. Pembuatan agar

Ambil piring dan masukan ke dalam GelDoc. Pertama-tama, buang buffer

yang masih ada di piring dengan memiringkan piring di kamar. Tutup GelDoc dan

pengaturan kamera. Nyalakan UV dan kemudian dokumentasikan hasilnya. Buang

piring ke tempat sampah khusus. Cuci dan keringkan piring.

2. Memuat sampel

Setelah keras Letakkan pelat di atas bilik yang sudah berisi buffer

elektroforesis hingga sebagian terendam (ingat, posisi sumur berada di dekat kutub
negatif bilik!). Siapkan bahan pewarna pemuatan (LD) pada bahan pewarna pelatsebanyak 0,4 μL /
sampel. Campur dan pipetkan 1 μL sampel DNA dengan LD.

Ambil seluruh campuran lalu pipet ke dalam sumur. Lakukan hal yang sama pada

setiap sampel. Kosongkan sumur terbaik untuk DNA tangga. Ambil 0,4 μL DNA

tangga (marker) campur LD di piring seperti pada sampel. Tangga di ujung.

3. Pemisahan DNA

Tutup ruang dan hubungkan dengan catu daya. Atur catu daya dengan

pengaturan: 150 V; 400 mA; 35 menit. Jalankan catu daya (ON / RUN). Matikan catu

daya ketika DNA telah dimigrasi ke bagian agar.

4. Visualisasi DNA

Ambil piring dan masukan ke dalam GelDoc. Pertama-tama, buang

buffer yang masih ada di piring dengan memiringkan piring di kamar. Tutup GelDoc

dan pengaturan kamera. Nyalakan UV dan kemudian dokumentasikan hasilnya.

Buang piring ke tempat sampah khusus.

Pembahasan

Ekstrasi DNA merupakan suatu teknik untuk memisahkan DNA dari molekul

atau organel lain yang tidak diperlukan. Proses ini sangat menentukan kualitas DNA

yang akan dihasilkan. Prinsip dasar Ektraksi DNA adalah menghancurkan membran

dan dinding sel kemudian mengekuarkan DNA yang terdapat didalam nukleus dan

mitokondria tanpa menyebabkan kerukasan DNA. Ekstraksi DNA secara umum

memiliki tahapan-tahapan yang meliputi isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan

membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi serta presipitasi atau pemadatan

Dalam prosesnya terdapat tiga larutan penting dalam isolasi DNA, yaitu larutan

buffer untuk lisis, larutan buffer untuk digesti, dan protein kinase K. Proses

penghancuran sel (lisis) secara kimia dilakukan dengan mamanfaatkan senyawa

kimia seperti EDTA (Etil Ediamin Tetra Asetat) dan SDS (Sodium Dodesil Sulfat).

EDTA merusak atau menghancurkan sel dengan cara mengikat ion magnesium. Ion

magnesium berfungsi dalam mempertahankan integritas sel dan mengingkatkan

aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. SDS yang merupakan sejenis

deterjen digunakan untuk merusak membran sel (Pereira et al. 2011).

Kuantifikasi DNA adalah suatu proses yang dilakukan dengan tujuan untuk

memastikan kemurnian dan konsentrasi hasil ekstraski DNA. Selain itu, kuantifikasi

DNA dalam sampel sangat penting dalam pemeriksaan PCR. Dalam pemeriksaan

DNA tidak diharapkan jumlah DNA yang terlalu banyak dan terlalu kecil. DNA yang

terlalu banyak dapat menyebabkan kesulitan saat interpretasi dan memakan waktu

yang lama. Sedangkan DNA yang terlalu sedikit dapat menyebabkan hilangnya alelalel yang
diperlukan karena reaksi PCR gagal untuk mengamplifikasi DNA dengan

baik. Prinsip kuantifikasi DNA yaitu dengan mengukur absrobansi pada panjang

gelombang 260 nm setelah pewarnaa menggunakan ethidium bromide dengan

menggunakan spektofotometer. Namun, metode ini memilik kekurangan seperti tidak

begitu sensitif dan pengukuran absorbansi tidak spesifik untuk DNA sehingga dapat

memberi perhitungan yang salah (Prayitno dan Nuryandani 2011).

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel atau spesiesatau ion atau

partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif,

biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik. Secara

teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang

bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current).

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh

medan listrik. Buffer atau larutan penyangga yang digunakan pada proses

elektroforesis berfungsi untuk menjaga kesetimbangan pH dan memberikan ion

untuk konduktivitas saat proses elektroforesis. Dalam hal ini, molekul-molekul

tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam

matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul, konsentrasi

gel agarosa, ukuran fragmen DNA, voltase, konsentrasi dan pH buffer yang

digunakan, serta konsentrasi dan kemampuan pewarna interkalat seperti EtBr

(ethidium bromide) yang digunakan dalam pewarnaan (Mahasri 2010).

Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan

gel saat dilakukan pemanasan, mencampurkan DNA dengan loading buffer yang

memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor

berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung. Marker adalah segmen DNA
yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk

mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam

ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul

DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah

dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Gel doc merupakan alat

yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis.

Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV

berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret

hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat

bantuan software. Menurut Pereira (2011) elektroforesis digunakan untuk

menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan

asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan

sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari

protein atau asam nukleat setiap individu.

Metode elektroforesis gel dibagi menjadi 3 yaitu gel poliakrilamida denaturasi,

berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil

ekstensi primer, Gel agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang

berukuran besar dan Elektroforesis kapiler (Capillary electrophoresis). MenurutMahasri (2010) Gel
agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih

besar (lebih dari 50 bp) dan digunakan secara horizontal. Gel poliakrilamida

digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 50 bp) dan digunakan secara vertikal.

Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan

konsentrasi matriks agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih

cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang

lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif Dalam elektroforesis juga

digunakan bahanbahan seperti Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan

Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya

fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue

berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel. Jarak

perpindahan DNA dalam gel dapat diperkirakan melalui pemantauan visual dengan

menggunakan pewarna pelacak seperti pewarna bromofenol biru dan xilena cyanol
(Hipi et al. 2013)

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA

dari produk PCR memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran,

lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.

Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain

membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan

sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gengen penyebab
kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah

mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama

perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah

diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui

variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi

berat molekul fragmen DNA, RNA protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa

fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan

perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon

dalam rekombinan plasmid DNA elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu

pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan

kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapatdiperiksa.
Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak

berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga

hasilnya sulit diinterpretasikan

Berdasarkan pengamatan yang diperoleh terdapat beberapa sumur yang tidak

terlihat pita pada kedua gambar diatas. Hal tersebut dikarenakan perlunya

dilakukannya visualisasi berulang-ulang karena tidak selamanya DNA itu langsung

terlihat. Hal tersebut menunjukkan bahwa pita DNA yang dihasilkan belum terbebas

dari kontaminan seperti protein, polisakarida, lemak dan lain sebagainya. Adapun

alasan lain kenapa beberapa sumur tidak terlihat pita DNAnya yaitu karena mesin

yang dipakai sudah terlalu berumurtampak bahwa pada sumur gelelektroforesis

masih terdapat komponen RNA, tidak DNA saja yang teramati, hal ini dapat

diakibatkan karena kurangnya ketelitian saat memasukkan sampel kedalam sumur,

dan hasilnya juga tergantung dengan keberadaan DNA sendiri semakin besar molekul

DNA maka akan semakin lambat pergerakannya sehingga pada saat pembacaan hasil
elektroforesis DNAyang muatannya kecil lebih jelas dibandingkan dengan DNA

yang bermuatan besar. menurut Mahasri et al. (2010) hasil elektroforesis juga

tergantung pada tegangan listtrik yang digunakan semakin besar kuat arusmaka

kecepatan running pada DNA akan semakin cepat, selain itu proses elektroforesis

juga tergantung pada keberadaan pH buffer yang digunakan, semakin tinggi

konsenterasi buffer makaakan menghambat proses motilitas DNA dan konsentrasi

gel agarose juga berpengaruhterhadap hasil elektroforesis karena semakin tinggi

konsentrasi gel agarose maka poriporigel yang terbentuk akan semakin kecil

sehinnga sulit untuk ditembus DNA hal ini dapatberpengaruh pada motilitas DNA.

Ukuran DNA genom 1 kb sangat cocok digunakan untuk tahap PCR karena

ukuran DNA target yaitu sekitar ≥100 bp sedangkan pita dibawah dari 100 bp

merupakan RNA yang dianggap sebagai kontaminan yang mengganggu proses

amplifikasi. Menurut Hipi et al. (2013), uji elektroforesis akan menunjukkan berat

molekul dari yang besar (tinggi) ke rendah dari DNA genom. Jika DNA genom

terisolasi dengan baik maka menunjukkan berat molekul yang besar (tinggi).

Tingginya kualitas DNA yang dihasilkan tidak terlepas dari penggunaan bufer

ekstraksi yang didinginkan terlebih dahulu sebelum digunakan. Menurut Pereira etal. (2011)
semakin rendah suhu yang digunakan pada proses penghancuran jaringan

akan memperkecil peluang terjadinya degradasi DNA. tidak terlihat adanya pita,

disebabkan oleh konsentrasi yang terlalu rendah atau bahkan plasmid tidak terisolasi.

Ukuran sebenarnya dari plasmid ini belum dapat ditentukan melalui gel agarose

elektroforesis karena tidak adanya penanda berat molekul yang sesuai (Maulid dan

DAFTAR PUSTAKA

Faatih M. 2009. Isolasi dan digesti dna kromosom isolation and digestion of

chromosomal DNA. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi. 10(1):61-67.

Hipi A, Surahman, Ilyas MS, dan Giyanto, 2013. Seed Genetic Purity Assessment of

Maize Hybrid Using Microsatellite Markers (SSR). Internasional Journal of

Applied Science and Technology. 3(5):66-71.

Mahasri G, Fajriah U, Subekti S. 2010. Karakterisasi protein lernaea cyprinacea

dengan metode elektroforesis SDS-page. Jurnal Ilmiah Perikanan dan

Kelautan. 2(1):61-66.

Maulid DY, Nurlima M. 2015. DNA barcoding untuk autentikan produk ikan tenggiri

(Scomberomorus). Jurnal akuatik. 6 (2):154- 160.

Pereira JC, Chaves R, Bastos E, Leitão A, GuedesPinto. 2011. An Efficient Method

for Genomic DNA Extraction from Different Molluscs Species. International

Journal of Molecular Sciences. 12: 8086-8095.

Prayitno E, Nuryandani E. 2011. Optimization of DNA extraction of physic nut

(Jatropha curcas) by selecting the appropriate leaf. BIOSCIENS. 3(1): 1-6.

Siswoyo, A. B. EKSTRAKSI DNA.