UJI TOKSISITAS EKSTRAK ETANOL HERBA PUGUNTANOH

(PICRIA FEL TERRAE LOUR ) TERHADAP LARVA ARTEMIA

SALINA LEACH DENGAN METODE BRINE SHRIMP
LETHALITY TEST (BSLT)

PROPOSAL

OLEH :

NOVIKA SARI SIREGAR

1601011152

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI DAN KESEHATAN
INSTITUT KESEHATAN HELVETIA
MEDAN
2020
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami ucapkan ke Hadirat Allah SWT yang melimpahkan
Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Proposal ini.
Adapun judul Proposal adalah : “Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Herba
Puguntanoh (Picria Fel TerraeLour) Terhadap Larva Artemia Salina Leach
Dengan Metode Brine Shrimp LethalityTest (BSLT)”.
Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih
kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan dan bimbingan serta fasilitas
sehingga Proposal ini dapat disusun, antara lain penulis sampaikan kepada :
1. Dr. dr. Hj. Razia Begum Suroyo, M.Sc., M.Kes., selaku Pembina Yayasan
Helvetia Medan.
2. Dr. dr. Arifah Devi Fitriani, M.Kes., selaku ketua Yayasan Helvetia Medan.
3. Dr. H. Ismail Efendy, M.Si.,selaku Rektor Institut Kesehatan Helvetia
Medan.
4. H. Darwin Syamsul, S.Si., M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi dan
Kesehatan Institut Kesehatan Helvetia.
5. Adek Chan, S.Si., M.Si., Apt., selaku Ketua Program Studi S1 Farmasi
Institut Kesehatan Helvetia.
6. Tetty Noverita Khairani S, S.Si., M.Si. selaku Pembimbing I yang senantiasa
menyediakan waktudan tenaga dalam memberikan pengarahan, bimbingan
serta memberikan masukan dan saran kepada penulis dalam menyelesaikan
Proposal ini.
7. Chemayanti Surbakti,S.Farm., M.Si., Apt., selaku Pembimbing II yang telah
meluangkan waktu dan memberikan pemikiran dalam membimbing penulis
selama penyusunan Proposal ini.
8. Ruth Mayana Rumannti, S.Farm., M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji III.
9. Teristimewa penulis ucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada
Ayahanda dan Ibunda serta abang serta keluarga besar yang tak pernah henti-
hentinya mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis baik secara
moral maupun materil.
10. Rekan-rekan mahasiswa program Studi S1 Farmasi.
Penulis menyadari bahwa Proposal ini masih jauh dari kata sempurna.Oleh
karena itu, penulis menerima kritik dan saran demi kesempurnaan Proposal ini.
Akhir kata penulis mengharapkan semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi kita
semua.
Medan, Februari 2020
Penulis

Novika Sari Siregar

i
 DAFTAR ISI

Halaman
HALAMAN PENGESAHAN
KATA PENGANTAR............................................................................. i
DAFTAR ISI............................................................................................ ii
DAFTAR GAMBAR............................................................................... iv

BAB I PENDAHULUAN........................................................................ 1
1.1. Latar Belakang.......................................................................... 1
1.2. Perumusan Masalah.................................................................. 4
1.3. Hipotesis.................................................................................... 4
1.4. Tujuan Penelitian...................................................................... 4
1.5. Manfaat Penelitian.................................................................... 4
1.6. Kerangka Pikir Penelitian......................................................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................. 6

2.1. Uraian Tumbuhan ..................................................................... 6
2.1.1. Sistematika Tumbuhan ................................................. 6
2.1.2. Morfologi Tumbuhan ................................................... 7
2.1.3. Nama Daerah dan Nama Asing Tumbuhan .................. 7
2.1.4. Sinonim ........................................................................ 7
2.1.5. Khasiat Tumbuhan Pungun Tanoh................................ 8
2.1.6. Kandungan Kimia ........................................................ 8
2.1.6.1............................................................................ Flavonoi
d ........................................................................ 8
2.1.6.2............................................................................ Tanin
...........................................................................9
2.1.6.3............................................................................ Saponin
...........................................................................9
2.1.6.4............................................................................ Steroid
...........................................................................10
2.2. Simplisia ................................................................................... 10
2.3. Ekstraksi ................................................................................... 11
2.3.1. Metode Ekstraksi .......................................................... 11
2.3.1.1............................................................................ Ekstraksi
Cara Dingin ...................................................... 11
2.3.1.2............................................................................ Ekstraksi
Cara Panas ........................................................ 12
2.4. Uji Toksisitas ........................................................................... 13
2.4.1. Uji Toksisitas Akut Oral .............................................. 13
2.4.2. Uji Toksisitas Subkronik Oral ...................................... 14
2.4.3. Uji Toksisitas Kronik Oral ........................................... 14
2.5. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)......................................... 15
2.6. Artemia Salina Leach ............................................................... 15

ii
2.6.1. Toksonomi Artemia Salina Leach ................................ 16
2.6.2. Ekologi Spesies ............................................................ 17
2.6.3. Deskripsi ...................................................................... 18
2.6.4. Siklus Hidup ................................................................. 19

iii
BAB III METODE PENELITIAN......................................................... 21
3.1. Jenis Penelitian.......................................................................... 21
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian................................................... 21
3.3. Populasi dan Sampel................................................................. 21
3.3.1. Populasi ........................................................................ 21
3.3.2. Sampel .......................................................................... 21
3.3.3. Pengambilan Sampel .................................................... 21
3.4. Determinasi Tanaman .............................................................. 22
3.5. Alat dan Bahan ......................................................................... 22
3.5.1. Alat ............................................................................... 22
3.5.2. Bahan ............................................................................ 22
3.6. Prosedur Kerja .......................................................................... 22
3.6.1. Persiapan dan Pembuatan Simplisia ............................. 22
3.6.2. Pembuatan Ekstrak Herbal Puguntanoh........................ 23
3.6.3. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) ............................. 24
3.6.4. Penetasan Larva Udang ................................................ 24
3.6.5. Persiapan Larutan Sampel Yang Akan Diuji ............... 25
3.6.6. Prosedur Uji Toksisitas Dengan Metode BSLT ........... 26
3.7. Pengolahan dan Analisis Data .................................................. 26

DAFTAR PUSTAKA.............................................................................. 27

iv
 DAFTAR GAMBAR
Halaman

Gambar 1.1. Kerangka Pikir Penelitian

..............................................................................................
..............................................................................................
6
Gambar 2.1. Puguntanoh (Picriafel-terrae Lour)
..............................................................................................
..............................................................................................
8
Gambar 2.2. Artemia Salina Leach
..............................................................................................
..............................................................................................
18
Gambar 2.3. Siklus Hidup Artemia
..............................................................................................
..............................................................................................
20

v
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia memiliki sekitar 30.000 spesies tanaman, 940 di antaranya

digunakan sebagai tanaman obat. Penggunaan tanaman obat sebagai pengobatan

tradisional merupakan pilihan pengobatan yang kini makin diminati, terlebih lagi

dengan kesadaran untuk kembali ke alam dan juga karena relatif aman dan murah,

bahkan dengan perkembangan yang kini ada makin mendapat perhatian bagi

alternatif pelayanan kesehatan. Dari berbagai penelitian, obat tradisional telah

diakui keberadaannya oleh masyarakat, dengan demikian meningkatkan manfaat

tanaman bagi kesehatan dan menciptakan kondisi yang mendorong

pengembangan obat tradisional (1).

Indonesia kaya akan pengetahuan mengenai pengobatan tradisional.

Hampir setiap suku bangsa di Indonesia memiliki khasanah pengetahuan dan cara

tersendiri mengenai pengobatan tradisional. Sebelum dituliskan ke dalam naskah

kuno, pengetahuan tersebut diturunkan secara turun-temurun melalui tradisi lisan

(2).

Obat Tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan

tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dan

bahan-bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk

pengobatan.Saat ini semangkin banyak masyarakat yang menggunakan bahan

alam sebagai obat, sehingga diperlukan penelitan lebih lanjut mengenai uji

keamanan obat tradisional (2).

1
 2

Penggunaan obat tradisional sebagai upaya kesehatan promotif, preventif,

kuratif, dan rehabilitatif cenderung meningkat. Hal ini dikarenakan adanya back

to nature dan kepercayaan masyarakat terhadap kelebihan obat tradisional

dibandingkan dengan obat modern, antara lain: efek sampingnya relatif kecil bila

digunakan secara benar dan tepat adanya efek komplementer dan atau sinergisme

dalam ramuan obat tradisional/komponen bioaktif tanaman obat pada satu

tanaman bisa memiliki lebih dari satu efek farmakologi serta obat tradisional lebih

sesuai untuk penyakit-penyakit metabolik dan degeneratif (3).

Salah satu tanaman yang berkhasiat sebagai obat itu puguntanoh ( picria

fel terrae Lour ). Puguntanoh ( picria fel terrae Lour ) merupakan jenis tanaman

yang termasuk dalam famili Scrophulariceae dan banyak dimanfaatkan sebagai

obat untuk mengobati berbagai macam penyakit seperti rematik, asam urat.

Tumbuhan ini digunakan secara tradisional sebagai hepatoprtektor dan agen

antiinflamasi. Berdasarkan penelitian sebelumnya, puguntanoh diketahui memiliki

efek farmakologis sebagai antielmintik, antidiabetes, antikanker, efek diuretik,

antinflamasi dan efek kardioprotektif (4),(5).

Menurut penelitian Surbakti Chemayanti (2018), skrining fitokimia

menunjukan bahwa herba puguntanoh (picria fel terrae Lour) mengandung

flavonoid,glikosida,saponin,tanin dan steroid (6).

Menurut penelitian sebelumnya, puguntanoh (piria fel terrae Lour) telah

digunakan secara tradisional sebagai stimulan, diuretik, antimalaria, demam,

infeksi herpes, kanker dan peradangan (7), hiperglikemia (8), antihiperurisemia

(9).
 3

Metode skrining tumbuhan untuk membuktikan bahwa suatu tanaman bisa

digunakan sebagai antikanker apabila tumbuhan tersebut mengandung senyawa

yang bersifat sitotoksik. Uji toksisitas dilakukan dengan mengamati kematian

hewan percobaan dan respon kematian ini dianggap sebagai pengaruh senyawa

yang diuji. Menurut penelitian Alfiah Syari W (2007) uji toksisitas subkronik

ekstrak etanol daun puguntanoh (piria fel terrae Lour) pada jantung tikus dengan

dosis 500 mg/kg bb dan 1000 mg/kg bb sudah memberikan efek toksik. Uji

toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan untuk meneliti

batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan senyawa yang ada dalam

tumbuhan tersebut (10),(11).

Penelitian dengan menggunakan tumbuhan herba puguntanoh (piria fel

terrae Lour) bertujuan untuk skrining awal senyawa aktif dengan menggunakan

metode Brine Shrimp Lethality Test yang pernah dilakukan oleh Meyer dkk pada

tahun 1982 untuk mengetahui senyawa yang bersifat toksik terhadap Artemia

salina Leach. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) sering digunakan untuk

praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak tumbuhan

karena murah, cepat, mudah dan dapat dipercaya (12).

OlehKarenaitu, peneliti tertarik untuk mengetahui lebih lanjut khasiat pada

tanaman puguntanoh sebagai uji toksisitas dengan menggunakan ekstrak etanol

herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) terhadap Artemia Salina Leach dengan

metode Brine Shrimp Lethality Test ( BSLT).

 4

1.2. Rumusan Masalah

a. Apakah ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) memiliki

toksisitas terhadap Artemia Salina Leach dengan metode Brine Shrimp

Lethality Test ( BSLT)?

b. Berapakah nilai LC50 ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae

Lour) terhadap Artemia Salina Leach dengan metode Brine Shrimp

Lethality Test ( BSLT)?

1.3. Hipotesis

a. Ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) mempunyai

toksisitas terhadap larva udang (Artemia salina Leach)

b. Ekstrak etanol bersifat toksik menurut metode BSLT karena memiliki

LC50 kurang dari 1000 μg/ml.

1.4 Tujuan Penelitian

a. Menentukan data presentase kematian larva udang setelah pemberian

ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour)

b. Menentukan nilai LC50 ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae

Lour) terhadap Artemia Salina Leach dengan metode Brine Shrimp

Lethality Test ( BSLT)?

1.5. Manfaat penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah sumber informasi bagi

masyarakat mengenai aktivitas toksisitas herba puguntanoh (Picria fel terrae

 5

Lour) sebagai salah satu tanaman yang dapat digunakan secara luas oleh

masyarakat.

1.6. Kerangka pikir penelitian

Variabel bebas Variabel terikat Parameter

Herba
puguntanoh
(Picria fel
terrae Lour)

Ekstrak etanol
Herba Sitotoksik % Kematian Larva
puguntanoh terhadap Arthemia Arthemia Salina
(Picria fel salina Leach Leach
terrae dengan metode
Lour)1000 BSLT
Nilai LC50
ppm, 750ppm ,
500 ppm

Gambar 1.1. Kerangka pikir penelitian

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Uraian Tumbuhan

Uraian tumbuhan meliputi morfologi tumbuhan, habitat, sistematika, nama

asing, nama daerah, manfaat, dan kandungan kimia.

2.1.1. Sistematika tumbuhan

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Subkelas : Asteridae

Ordo : Scrophulariales

Famili : Linderniaceae

Genus : Picria

Spesies : Picria fel-terrae Lour.

2.1.2. Morfologi tumbuhan

Herba puguntano merupakan herba tahunan yang tumbuh hingga setinggi

1 meter, meskipun kebanyakan tumbuh kurang dari 1 meter. Tumbuhan ini

memiliki batang dengan cabang yang jarang, tegak atau melata, segiempat,

berakar di buku-buku, berbulu halus yang padat. Daunnya tunggal berhadapan,

bundar telur, pangkal daun membaji sampai membundar, ujung daun agak

melancip, tepi daun beringgitan, berbulu halus. Pembungaan berupa tandan di

ujung atau di batang, jumlah bunga 2-16, daun gagang kecil, melanset, mahkota

6
 7

bunga menabung, berbibir rangkap, gundul bagian lur, bagian dalam ada kelenjar

bulu, bibir atas berwarna coklat kemerah-merahan, bibir bagian bawah berwarna

putih. Buah kapsul lonjong, padat, berkatup dua dengan beberapa biji. Biji

membulat dengan diameter sekitar 0,6 mm (13).

Gambar2.1.PugunTanoh(Picriafel-terrae Lour.)

2.1.3 Nama Daerah dan Nama Asing Tumbuhan

Nama lain tumbuhan ini yaitu Tamah Raheut (Sunda), daun Kukurang

(Maluku), Papaita (Ternate). Nama asing tumbuhan ini yaitu Kong Saden (Laos),

Hempedu Tanah, Gelumak Susu, Rumput Kerak Nasi (Malaysia), Thanh, M[aaj]t

d[aas]t (Vietnam) (13).

2.1.4 Sinonim

Curanga amara Juss., Curanga torenioides Steud., Gratiola

amara (Juss.) Roxb., Curanga fel-terrae (Lour.) Merr., Curanga

melissiafolia A. Juss (14).

 8

2.1.5 Khasiat Tumbuhan Puguntanoh

Masyarakat menggunakan tanaman puguntanoh sebagai obat cacing, obat

sakit perut, serta mengatasi kudis, memar, bengkak, batuk rejan. Beberapa

penelitian juga menyatakan bahwa daun puguntanoh dapat digunakan sebagai obat

antiasma, antiinflamasi, diuretik, antelmentik, kardioprotektif, antikanker

payudara (15), antibakteri (16) dan antidiabetes (17).

2.1.6. Kandungan Kimia (18)

2.1.6.1. Flavonoid

Flavonoid adalah senyawa metabolit sekunder yg memiliki struktur inti

C6-C3-C6 yaitu dua cincin aromatik yang dihibungkan dengan 3 atom C, biasanya

dengan ikatan atam O yang berupa ikatan oksigen heterosiklik. Senyawa ini dapat

dimasukkan sebagai senyawa polofenol karena mengandung dua atau lebih gugus

hidroksil, bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Umumnya

flavonoid ditemukan berkaitan dengan gula membentuk glikosida yang

menyebabkan senyawa ini lebih mudah larut dalam pelarut polar, seperti metanol,

etanol, butanol, etil asetat. Bentuk glikosida memiliki warna yang lebih pucat

dibandinkan bentuk aglikon. Dalam bentuk aglikon, sifatnya kurang polar,

cenderung lebih mudah larut dalam pelarut klorofom dan eter.

Flavonoid khususnya dalam bentuk glikosida akan mengalami

dekomposisi oleh enzim jika dalam bentuk masih segar atau tidak dikeringkan.

Untuk mengekstraksi flavonoid, harus diperhatikan polaritas dan tujuan yang

dikehendaki. Beberapa flavonoid yang bersifat kurang polar (isoflavon, flavanon,

flavon termetilasi, dan flavonol) dapat diekstraksi menggunakan pelarut dengan

 9

polaritas rendah, seperti klorofom dan eter. Dalam tumbuhan biasanya flavonoid

terdapat dalam bentk glikosida baik sebagai flavonoid O-glokosida atau flavonoid

C-glikosida.

2.1.6.2 Tanin

Tanin merupakan suatu senyawa polifenol yang tersebar luas dalam

tumbuhan, dan pada beberapa tanaman terdapat terutama dalam jaringan kayu

seperti kulit batang , dan jaringan lainnya, yaitu daun dan buah. Beberapa pustaka

mengelompoka tanin dalam senyawa golongan fenol. Tanin berbentuk amorf yang

mengakibatkan terjadinya koloid dalam air, memikiki rasa sepat, dengan protein

memiliki endapan yang menghambat kerja enzim proteolitik, dan dapat digunakan

dalam industri sebagai penyamak kulit hewan.

Sifat tanin sebagai astrigen dapat dimanfaatkan sebagai antidiare,

menghilangkan pendarahan, dan mencegah peradangan terutama pada mukosa

mulut serta digunakan sebagai antidotum pada keracunan logam berat dan

alkaloid. Tanin juga digunakan sebagai antiseptik karena adanya gugus fenol.

2.1.6.3. Saponin

Saponin adalah suatu senyawa yang memiliki bobot molekul tinggi atau

besar, tersebar dalam beberapa tumbuhan, merupakan bentuk glikosida dengan

molukul gula yang terikat dengan aglikon triterpen atau steroid. Molekul gula

biasanya terikat pada gugus OH terutama pada posisi C-3 atau pada 2 gugus OH

atau pada satu gugus OH dan satu gugus COOH. Beberapa triterpen memiliki rasa

pahit seperti limonin yang terdapat pada buah jeruk, terutama pada bagian kulit
 10

kukurbitasin yang terdapat pada biji labu merah, sedangkan glisirizin yang

terdapat dalam akar manis memiliki rasa manis.

2.1.6.4. Stroid

Steroid merupakan senyawa metabolit sekunder dengan berbagai fungsi

biologis yang penting dan tersebar luas baik dalam jaringan tumbuhan maupun

hewan. Steroid yang terdapat pada hewan pada umumnya bertindak sebagai

hormon, sedangkan steroid sintetik digunakan secara luas sebagai bahan obat

Digitoksin merupakan senyawa steroid yang dapat memacu kerja jantung,

contoh lain seperti kortison, kortisol dan prenidsone digunakan untuk mengobati

peradangan karena alergi atau encok ( Rheumatoid arthilis) dan noretinodrel

digunakan untuk menekan ovolasi sebagai metoda pembatasan kelahiran. Steroid

merupakan senyawa yang terdapat pada tumbuh-tumbuhan, yang terdiri dari

bermacam jenis.

2.2 Simplisia

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dikatakan lain, berupa

bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi tiga yaitu, simplisia

nabati, simplisia hewani dan simplisia pelikan (mineral).Simplisia nabati adalah

simplisia yang berupa tumbuhan utuh, bagian tumbuhan atau eksudat tumbuhan.

Eksudat tumbuhan ialah isi sel yang secara spontan keluar dari tumbuhan atau isi

sel yang dengan cara tertentu dikeluarkan dari selnya, atau senyawa nabati lainnya

yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tumbuhannya dan belum berupa

senyawa kimia murni .Proses pemanenan dan preparasi simplisia merupakan

 11

proses yang dapat menentukan mutu simplisia dalam artian, yaitu komposisi

kandungan senyawa, kontaminasi dan stabilitas bahan (19).

2.3. Ekstraksi

Menurut Farmakope Indonesia Edisi IV, ekstrak merupakan sediaan kental

yang diperoleh dengan cara mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati

ataupun simplisia hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Kemudian

semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa

diperlakukan sedemikian, sehingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan .Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan senyawa kimia yang

dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan

menggunakan pelarut cair. Metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat

dibagi menjadi dua cara, yaitu ekstraksi cara panas dan ekstraksi cara dingin (19),

(20).

2.3.1 MetodeEkstraksi (19)

2.3.1.1 Ekstraksi Cara Dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrasian simplisia dengan menggunakan

pelarut beberapa kali pengocokan atau pengadukan, pada temperatur ruangan

(kamar). Pelarut yang biasa digunakan adalah etanol.Secara teknologi termasuk

ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada saat

keseimbangan.Remaserasi merupakan pengulangan penambahan pelarut setelah

dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya.

 12

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai menjadi

sempurna yang umumya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses ini terdiri

dari tahapan pengembangan bahan, tahapan maserasi antara, tahap perkolasi

sebenarnya (penetesan/penampung ekstrak) secara terus-menerus sampai

diperoleh ekstrak perkolat.

2.3.1.2 Ekstraksi Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi menggunakan pelarut pada temperatur titik

didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan

dengan adanya pendingin balik umumnya dilakukan pengulangan peroses pada

residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk peroses ekstraksi

sempurna.

b. Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, pada

umumnya dilakukan dengan alat yang khusus sehingga terjadi ekstraksi secara

kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

c. Infundasi

Infundasi adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur terukur

selama waktu tertentu (15-20 menit).

d. Digesti
 13

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur kamar (40-50°C).

e. Dekoktasi

Dekoktasi adalah infundasi dengan waktu yang lebih lama (30 menit) dan

temperatur sampai titik didih air.

2.4. Uji Toksisitas (21)

Uji toksisitas adalah suatu uji untuk mendeteksi efek toksik suatu zat pada

sistem biologi dan untuk memperoleh data dosis-respon yang khas dari sediaan

uji. Data yang diperoleh dapat digunakan untuk memberi informasi mengenai

derajat bahaya sediaan uji tersebut bila terjadi pemaparan pada manusia, sehingga

dapat ditentukan dosis penggunaannya demi keamanan manusia.

Uji toksisitas menggunakan hewan uji sebagai model berguna untuk

melihat adanya reaksi biokimia, fisiologik dan patologik pada manusia terhadap

suatu sediaan uji. Hasil uji toksisitas tidak dapat digunakan secara mutlak untuk

membuktikan keamanan suatu bahan/ sediaan pada manusia, namun dapat

memberikan petunjuk adanya toksisitas relatif dan membantu identifikasi efek

toksik bila terjadi pemaparan pada manusia.

2.4.1 Uji toksisitas akut oral

Uji toksisitas akut oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek

toksik yang muncul dalam waktu singkat setelah pemberian sediaan uji yang

diberikan secara oral dalam dosis tunggal, atau dosis berulang yang diberikan

dalam waktu 24 jam.

 14

Prinsip uji toksisitas akut oral yaitu, sediaan uji dalam beberapa tingkat

dosis diberikan pada beberapa kelompok hewan uji dengan satu dosis per

kelompok, kemudian dilakukan pengamatan terhadap adanya efek toksik dan

kematian. Hewan yang mati selama percobaan dan yang hidup sampai akhir

percobaan diotopsi untuk dievaluasi adanya gejala-gejala toksisitas.

2.4.2. Uji toksisitas subkronik oral

Uji toksisitas subkronis oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek

toksik yang muncul setelah pemberian sediaan uji dengan dosis berulang yang

diberikan secara oral pada hewan uji.

Prinsip dari uji toksisitas subkronis oral adalah sediaan uji dalam beberapa

tingkat dosis diberikan setiap hari pada beberapa kelompok hewan uji dengan satu

dosis per kelompok selama 28 atau 90 hari, bila diperlukan ditambahkan

kelompok satelit untuk melihat adanya efek tertunda atau efek yang bersifat

reversibel. Selama waktu pemberian sediaan uji, hewan harus diamati setiap hari

untuk menentukan adanya toksisitas.

2.4.3 Uji toksisitas kronik oral

Uji toksisitas kronis oral adalah suatu pengujian untuk mendeteksi efek

toksik yang muncul setelah pemberian sediaan uji secara berulang sampai seluruh

umur hewan. Uji toksisitas kronis pada prinsipnya sama dengan uji toksisitas

subkronis, tetapi sediaan uji diberikan selama tidak kurang dari 5- 12 bulan.

Tujuan dari uji toksisitas kronis oral adalah untuk mengetahui profil efek toksik

setelah pemberian sediaan uji secara berulang selama waktu yang panjang, untuk

menetapkan tingkat dosis yang tidak menimbulkan efek toksik.

 15

2.5. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (12)

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode untuk

menguji bahan-bahan yang bersifat toksik dan digunakan sebagai suatu bioassay

yang pertama untuk penelitian bahan alam dan sebagai antitumor, pestisida, dan

skrining ekstrak tumbuhan untuk aktivitas farmakologi. Metode ini menggunakan

larva Artemia salina Leach sebagai hewan coba. Uji toksisitas dengan metode

BSLT ini merupakan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa

ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah

pemberian dosis uji. Prosedurnya dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas

komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salina Leach. Suatu ekstrak

dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC < 1000 μg/ ml.

Teknik ini cepat, sederhana (tindakan aseptic tidak diperlukan), mudah,

tidak mahal, dan menggunakan sejumlah material uji (2-20 mg atau kurang).

BSLT digunakan untuk memprediksi aktivitas toksisitas dan peptisidal. Metode

ini telah terbukti memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker.

BSLT menggunakan larva (nauplia) Artemia salina Leach digunakan

sebagai hewan coba .Jumlah kematian larva dihitung setelah 24 jam perlakuan dan

hasilnya dinilai sebagai LC50 atau LD50, dosis yang dibutuhkan untuk membunuh

50% larva. Tolak ukur atau parameter yang digunakan untuk menunjukkan

adanya aktivitas biologi suatu senyawa pada Artemia salina Leach yaitu dengan

menghitung jumlah kematian larva udang akibat pemberian senyawa dengan

konsentrasi yang telah ditetapkan. Hasil uji dikatakan efektif terhadap larva

Artemia salina Leach apabila ekstrak yang diujikan menyebabkan 50% kematian
 16

pada kurang dari 1000 ppm. Apabila suatu ekstrak tanaman bersifat toksik

menurut harga LC50 dengan metode BSLT, maka tanaman tersebut dapat

dikembangkan sebagai obat antikanker. Hal ini disebabkan karena terdapat

hubungan antara sitotoksis dan BSLT pada ekstrak tanaman yang diteliti.

2.6. Artemia Salina Leach

Artemia merupakan salah satu krustase yang banyak dimanfaatkan untuk

pakan alami hidup dalam pembenihan udang dan ikan, termasuk ikan hias.

Krustase yang juga disebut Brine shrimp ini sangat populer dikalangan

pembenihan udang karena dapat memacu pertumbuhan benih, mudah di cerna,

dan kandungan nutrisinya yang tinggi, terutama karena kandungan proteinnya

(40-60% berat total) dan kaya akan asam lemak ensesial. Bahkan, hingga saat ini

artemia sebagai pakan alami untuk larva udang belum dapat digantikan dengan

pakan lain tanpa harus mempengaruhi petumbuhan dan kelulusan hidupnya.

Apalagi karena larva tersebut belum dapat memanfaatkan pakan buatan sebagai

makanan. Biasanya, artemia yang digunakan untuk pakan larva udang dalam

bentuk larva (terutama dalam tahap Nauplii) yang ditetaskan dari kista (telur)

artemia. Sementara itu biomassanya banyak dimanfaatkan untuk pakan ikan, ikan

hias, atau bahkan dapat dimanfaatkan untuk pangan (22).

2.6.1. ToksonomiArtemia Salina Leach

Artemia adalah jenis Crustacea tingkat rendah dari phyilum Arthropoda

yang banyak mengandung nutrisi terutama protein dan asam- asam amino. Dalam

dunia hewan Artemia atau Brine shrimp adalah merupakan makrozoo plankton

yang diklasifikasikandalam:
 17

Kingdom : Animalia

Philum : Arthopoda

Kelas : Crustacea

Sub kelas : Branchiopoda

Ordo : Anostraca

Famili : Artemiidae

Genus : Artemia

Species : Artemia salina (23).

Gambar 2.2Artemia salina Leach

Sumber : Dumitrascu M, 2011

2.6.2. Ekologi Spesies (23)

Artemia salina hanya hidup di danau dan kolam dengan salinitas tinggi

(antara 60-300 ppt). Spesies ini endemik di Mediterranean, tapi dapat ditemukan

di seluruh benua. Dapat mentolerir garam dalam jumlah besar (300g/L air) dan

dapat hidup dalam lautan yang berbeda dari air laut, seperti kalium permanganat

dan perak nitrat, sedangkan yodium berbahaya bagi spesies ini. Hewan ini mampu

mengurangi tekanan osmotik hemolimf hiptonik dengan eksresi NaCl melawan

 18

gradien konsentrasi. Keadaan ini bertujuan untuk menjaga hemolimf hipotonik

ekstrim dalam konsentrasi garam yang ekstrim. Pertahanan lain dilakukan

Artemia salina dalam air dengan defisiensi oksigen yang tinggi. Konsentrasi

minimum oksigen untuk Artemia salina dewasa sangat rendah (0,5 mg/L) dan

untuk nauplia kurang dari 0,3 mg/L.

2.6.3. Deskripsi (23)

Tubuhnya dibagi menjadi 3 segmen : kepala, thorax, dan abdomen. Hewan

jantan dewasa mempunyai panjang 8-10 mm, sedangkan pada betina 10-12 mm.

Aretmia salina dewasa mempunyai 3 mata dan 11 pasang kaki. Dalam kondisi

alami, pangan Artemia salina berupa algae, protozoa, dan detrius. Partikel yang

kurang dari 40-60 mm akan dilepaskan oleh filter aktif non-selektif yang dimiliki

oleh Artemia salina.

Artemia salina jantan memiliki 2 organ reproduksi. Uterus dari Artemia

salina betina berisi hingga 200 telur, baik pada spesies ovipar maupun ovovivar.

Mereka memproduksi telur, yang mengapung dalam air dan dapat berkembang

menjadi nauplia (larva) atau kista jika lingkungan tidak menguntungkan

(kekeringan air). Kista adalah bentuk dorman dari hewan ini, yang akan bertahan

lama dalam keadaan kering. Kista akan menetas menjai nauplia jika kondisi

lingkungan memungkinkan.

2.6.4. Siklus hidup (24)

Berdasarkan cara perkembang biakannya artemia dikenal dengan

duagolongan, yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenetik. Perkembangbiakan

 19

padajenis biseksual harus melalui proses perkawinan antara induk betina dengan

induk jantan, sedangkan pada jenis partenogenetik tidak ada perkawinan.

Reproduksi pada artemia dapat terjadi secara ovovivipar maupun ovipar.

Pada ovovivipar, yang keluar dari induknya itu sudah langsung hidup sebagai

artemia muda, sedangkan pada cara ovipar, yang keluar dari induknya berupa telur

yang bercangkang tebal, yang dinamakan kista. Ovoviviparitas biasanya terjadi

apabila keadaan lingkungannya cukup baik, dengan kadar garam (salinitas)

kurang dari 150 permil dan kandungan oksigennya cukup, sedangkan oviparitas

akan terjadi apabila keadaan lingkungannya memburuk, dengan kadar garam lebih

dari 150 permil dan kandungan oksigennya rendah. Telur yang bercangkang tebal

itu memang disiapkan untuk menghadapi keadaan lingkungan yang buruk, bahkan

juga kekeringan. Sementara itu embrio yang berada di dalam cangkang telurnya

beristirahat (diapauze).

Gambar 2.3. Siklus hidup artemia

 20

Apabila kista direndam di dalam air laut dengan tingkat salinitas 30-35 ppt

maka akan terjadi hidrasi, setelah 24 jam, membran luar akan pecah dan kista

menetas menjadi embrio, beberapa jam kemudian, embrio berkembang menjadi

nauplius dan mampu berenang bebas di dalam air. Individu yang baru ditetaskan

ini dikenal dengan instar I. Instar I ini akan berganti kulit menjadi instar II,

demikian seterusnya sampai 15 kali. Setiap tahap pergantian kulit dinamai nomor

instar pada tahap tersebut hingga pergantian kulit yang terakhir disebut instar XV,

selanjutnya artemia berkembang menjadi individu dewasa dengan ukuran 10-20

mm. Perkembangan artemia dari proses penetasan sampai menjadi individu

dewasa membutuhkan waktu sekitar 7-10 hari. Pada saat telah menjadi dewasa,

artemia siap untuk melakukan proses perkawinan. Proses perkawinan pada

artemia ditandai dengan penempelan individu jantan pada tubuh individu betina

(riding position). Keadaan seperti ini berlangsung hingga telur masak.

 BAB III

METODELOGI PENELITIAN

3.1. Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan

pendekatan post test-only control group design untuk menguji toksisitas akut

ekstrak etanol herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) terhadap larva udang

Artemia salina Leach menggunakan metode BSLT.

3.2. Tempat dan waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Farmakologi

Fakultas Farmasi Institut Kesehatan Helvetia Medan. Penelitian dimulai pada

bulan Januari s/d April 2020.

3.3. Populasi dan Sampel

3.3.1. Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah tumbuhan herba puguntanoh(Picria fel

terrae Lour) yang berasal dari Kota Pancur Batu, Provinsi Sumatera Utara.

3.3.2. Sampel

Sampel yang digunakan yaitu dari tumbuhan herba puguntanoh ( Picria fel

terrae Lour)

3.3.3. Pengambilan Sampel

Cara pengambilan sampel pada penelitian ini adalah dengan purposive

random sampling yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan serupa dari

21
 22

daerah lain.Sampel yang digunakan diambil dari Kota Pancur Batu, provinsi

Sumatera Utara.

3.4. Determinasi Tanaman

Identifikasi terhadap herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) untuk

mengetahui identitas taksonominya dilakukan di Herbarium Medanese (MEDA)

Universitas Sumatera Utara.

3.5. Alat dan Bahan

3.5.1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas ukur, beaker

gelas, tabung reaksi, erlenmeyer, blender, timbangan analitik, rotary evaporator,

pipet tetes, bejana kaca maserasi, batang pengaduk, spatula, kertas saring, lampu

pijar, ayakan 65 mesh, desikator, oven, seperangkat alat penetasan larva (wadah

plastik, lakban hitam, sterofom, aluminium foil, lampu)

3.5.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah ekstrak herba puguntanoh (Picria fel

terrae Lour) etanol, aquadest, air laut buatan, telur larva Artemia salina Leach,

DMSO.

3.6. Prosedur Kerja

3.6.1. Persiapan dan Pembuatan Simplisia

Herba puguntanoh (Picria fel terrae Lour) diambil pada pagi hari

sebanyak 3kg, kemudian dilakukan sortasi basah untuk memisahkan kotoran –

kotoran atau bahan asing lainya dan ditimbang. Selanjutnya dilakukan pencucian
 23

untuk menghilangkan tanah dan pengotoran lainya yang melekat pada bahan

simplisia dan dirajang. Setelah itu proses pengeringan dilemari pengering untuk

mendapatkan simplisia yang tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam

waktu yang lebih lama, kemudian diblender untuk mendapatkan serbuk simplisia

(25).

3.6.2. Pembuatan Ekstrak Herba Puguntanoh

Metode yang digunakan adalah maserasi. Dengan perbandingan 1 : 10

serbuk simplisia dimaserasi selama 5 hari, sebanyak 500 gr simplisia dimasukan

kedalam bejana kaca kemudia direndam dengan 3.700 ml pelarut etanol 96%

ditutup dengan alumunium foil selama 3 hari (sesekali diaduk) lalu disaring

menggunakan kertas saring dan diperoleh fitrat I dan residu. Residu direndam

ulang dengan menggunakan 1.250 ml pelarut etanol 96% selama 2 hari (sesekali

diaduk ) kemudian disaring menggunakan kertas saring dan diperoleh fitrat II dan

residu. Dimasukan fitrat I dan II lalu dievaporasi dengan menggunakan rotary

evaporator dengan suhu 400C sampai diperoleh ekstrak kental (26).

3.6.3. Pembuatan Air Laut Buatan ( ALB)

Air Laut Buatan (ALB) disiapkan dengan cara melakukan 15 gr NaCl

kedalam 1 liter aquadest. Kemudian air Laut tersebut terlebih dahulu diukur pH

nya menggunakan pH meter, diperoleh pH nya 8-9 (27).

3.6.4. Penetasan Larva Udang

Penetasan larva udang dilakukan didalam wadah

plastik.Sebelumnya wadah plastik dibagi menjadi bagian terang dan gelap, lalu

diberi pembantas berupa sterofoam yang tepi bawahnya telah dilubangi agar telur
 24

yang menetas bisa keluar dari lubang tersebut.Wadah kemudian diisi dengan air

laut hingga kedua lubang pada sterofoam tersebut terendam.Pada ruang gelap diisi

1 sendok telur, kemudian ditutup dengan menggunakan lakban hitam dan

aluminium foil. Pada ruang terang diberi penerangan menggunakan cahaya lampu

neon untuk merangsang penetasan. Kemudian pada ruang terang dipasang aerator

untuk memberikan oksigen pada telur yang menetas menjadi larva dan berpindah

keruang terang. Setelah telur menrtas menjadi larva yang berusia 24 jam, lalu

dipindahkan kewadah lain hingga berusia 48 jam. Larva yang berusia 48 jam

dapat dijadikan hewan uji pada percobaan metode BSLT (12).

3.6.5. Persiapan Larutan Sampel yang Akan Diuji

Untuk menentukan konsentrasi ektrak yang

efektif untuk membunuh Artemia salina Leach. Uji ini bertujuan untuk

menentukan presentase kematian hewan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 750

ppm, 500 ppm. Larutan induk dibuat dari 200 mg ekstrak yang telah ditimbang

lalu dilarutkan dengan DMSO 2 mL dan ditambah aquadest hingga volumenya

mencapai 100 mL sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk 2000 ppm (28).

Setelah didapatkan larutan induk 2000 ppm,

dilakukan pengenceran untuk mendapatkan larutan uji dengan konsentrasi 1000

ppm, 750 ppm, 500 ppm. Rumus pengenceran sebagai berikut:

V1M1 = V2M2

Keterangan :

V1 = volume awal

V2 = volume akhir
 25

M1 = konsentrasi awal

M2 = konsentrasi akhir

3.6.6. Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT

Larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 750

ppm, 500 ppm. Masing-masing dipipet sebanyak 10 mL dimasukkan kedalam

tabung reaksi dan ditambahkan 10 ekor larva udang Artemia Salina Leach yang

telah berumur 48 jam. Setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan dan

dibandingkan dengan kontrol negatif. Dihitung jumlah larva yang mati setelah 24

jam pada masing – masing tabung reaksi. Perhitungan dilakukan dengan

menggunakan lup, digital colony counter, atau dibawah penerangan lampu. Larva

yang mati diketahui dari tidak adanya pergerakan selama pengamatan (29).

Tabel 3.1 Jumlah Masing-Masing Konsentrasi Ekstrak Pada Tabung Uji

Tabung Uji I Tabung Uji II Tabung Uji III Tabung Uji IV

10 larva Artemia 10 larva Artemia 10 larva Artemia 10 larva

Salina + Larutan Salina + Larutan Salina + Larutan Artemia Salina+
konsentrasi 1000 konsentrasi 750 konsentrasi 500 Air laut
ppm + air laut ppm + air laut ppm + air laut

3.7. Pengolahan dan Analisis Data

Untuk menentukan presentase kematian larva

untuk setiap konsentrasi dengan cara sebagai berikut:

Jumlahlarva yang mati

% Mortalitas= ×100 %
Jumlah larvauji

Pada metode analisis probit manual, nilai probit

diketahui dengan mengkonversi nilai persen kematian larva tiap konsentrasi ke

 26

nilai probit dalam tabel. Dilanjutkan dengan menentukan log konsentrasi dan

membuat persamaan garis lurus y = mx+b, dengan y adalah nilai probit dan x

adalah log konsentrasi.

Metode analisis dapat juga menggunakan

Microsoft Office Excel dengan membuat grafik persamaan garis lurus hubungan

antara nilai probit dengan log konsentrasi. Nilai LC50 dapat dihitung dari

persamaan garis lurus dengan memasukkan nilai 5 sebagai y. Nilai 5 didapatkan

berdasarkan nilai probit 50 % kematian hewan uji. Sehingga dihasilkan nilai x

sebagai log konsentrasi. Nilai LC50 merupakan antilog nilai x tersebut (28).
 DAFTAR PUSTAKA

1. Hendrawati A. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Kemangi

(OCimum sanctum Linn) Terhadap Artemia Salina Leach dengan Metode
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 2009;
2. Parwita A. Jurusan Kimia Laboratorium Kimia Organik FMIPA
Universitas Udayana. 2016;
3. Sari. Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaat dan
Keamanannya. Maj Ilmu Kefarmasian. 2009;III.
4. Juwita N. Karakteristik Simplisia dan Uji Efek Antiinflamasi Ekstrak
Etanol Daun Puguntanoh (Curanga Fel-Terrae Merr) Terhadap Mencit
Jantan. 2009;
5. Huang Y. Biological Activities of Picriafel-terrae Lour. Pharmceutical
World Sci. 1994;16.
6. Surbakti C. Pengaruh Kombinasi Ekstrak Daun Pirdot (Saurauiavulcani
Korth) dan Herba Puguntanoh (Picria fel terrae Lour) Terhadap Kadar
SOD, HbA1c, Ekspresi Insulin Pada Tikus Hiperglikemia. 2018;
7. Lestari P. Combinational Effects of nhexana extract of puguntanoh leaves
(picriafel terrae lour) with doxorubicin on MCF-7 breast cancer cells. 2015;
8. Pakpahan YK. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Herba Puguntano
(Picria fel0terrae Lour) Terhadap Proliferasi Sel Pada Aorta Tikus
Hiperglikemia Melalui Ekspresi Ki-67. 2018;
9. Ardiyanti R. Efek Antihiperurisemia Ekstrak Etanol Herba Puguntanoh
(Picria fel-terrae Lour) Terhadap Tikus Jantan. 2018;
10. Cassaret, Doull. Toxikology the Basic Science of Poison. New York:
Macmilan Publishing CO Inc; 1975.
11. Alfiah. Uji Toksisitas Subkronik Ekstrak Etanol Daun Puguntanoh
(Picriafel terrae Lour) pada Jantung Tikus. 2017;
12. Meyer B. Brine Shrimp: a Convenient General Biossay for Active Plant
Constituents. Planta Med. 1982;
13. Anonim. Sagai-Uak. 2015.
14. Anonin. Picriafel-terrae Lour. 2012.
15. Harahap U. Hepatoprtective Activity Fromethanol Extract of Pugun Tanoh
Leave (Curangafel-terrae Lour) MERR. Asian J Pharm Clin Res. 2017;10.
16. Mustika N. Pembuatan Nanopartikel dari Ekstrak Etanol Daun Puguntanoh
(Picriafel-terrae Lour) dan Uji Aktivitas Antibakteri Terhadap
Staphylococcus aureus dan Escherichia Coli. 2018;
17. Harfina F. The Effect of Puguntano Leaf Powder (Curanga fel-terrae Merr)
on Patients with Diabetes Mellitus. 2012;
18. Hanani E. Buku Analisis Fitokimia. Jakarta: Buku Kedokteran EGC; 2014.
19. Departemen Kesehatan RI. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan
Obat. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan,
Direktorat Pengawasan Obat Tradisional; 2000. 3–11 p.
20. Ditjen POM. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta; 1995.
21. BPOM RI. Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik
Indonesia Nomor 7 Tahun 2014 Tentang Pedoman Uji Toksisitas Non

27
 28

Klinik Secara InVivo. Jakarta; 2014.

22. Wibowo S. Artemia. Jakarta: Penebar Swadaya; 2013.
23. Dumiratscu M. Artemia asalina. Balneo-Research Jorunal. 2011;4.
24. Harefa F. Pembudidayaan Artemia Untuk Pakan Udang dan Ikan. Jakarta:
Penebar Swadaya; 1997.
25. Depkes RI. Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta; 1985.
26. Ditjen POM. Farmakope Indonesia Edisi Ke-III. Jakarta; 1979.
27. Wulandari F. UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL DAUN
MAHKOTA DEWA ( Phaleria macrocarpa [ Scheff .] Boerl .)
TERHADAP LARVA Artemia salina Leach DENGAN METODE BRINE
SHRIMP LETHALITY TEST ( BSLT ). 2014.
28. Hanifah NZ. Uji Toksisitas Akut Metanol Daun Sirsak (Annona muricata
L) Terhadap Larva Artemia salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp
Lethality Test (BSLT). 2015;
29. Smith J, Runtuwene MRJ. Uji Toksisitas Ekstrak Daun Benalu Langsat
( Dendrophthoe petandra ( L ) Miq ) dengan Metode Brine Shrimp
Lethality Test ( BSLT ) LC 50. 2015;4(2):157–60.