Eletroforese

Capilar

• Eletroforese capilar em zona

• Eletroforese
capilar em gel
• Isotacoforese capilar
• Focalização isoelétrica
capilar
• Cromatografia eletrocinética
capilar micelar
 - - - -- - -
- - - -- - -
- - - -
- -
- - - -
-- - -- - - -
-- -- ---
-

Dados:

A: 500 cargas e raio hidratado 500 UA

B: 1000 cargas e raio hidratado 1000 UA

Importante: neste exemplo, as cargas

das moléculas não dependem do pH.
Qual a ordem de migração dos íons Li+, Na+,
K+, Rb+?

Massa atômica: Li: 7; Na: 23; K: 39; Rb:85

H Li 600 pm

Li
Na Na 500 pm

K
Rb
K 300 pm

Cs
Fr
Rb 250 pm

Rb K Na Li

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Tempo, min
 Injeção Detecção

- -- - --
- -- - - --
- - --
- - -- - -- +
- -- - --
- -
- - - -- - --
- - - - --
Sinal do detector

tm(1) tm(2) tm(3) tm(4)

Tempo
Sabendo que as massas moleculares são:

tm(1) = 10 minutos; MM = 500

tm(2) = 11,56 minutos; MM = 1000
tm(3) = 15,1 minutos; MM = 5000

tm(4) = 18 minutos; MM = 15000

Qual a massa molecular de um composto

que apresenta tempo de migração de 13,5
minutos ?
 5
y = 0,1861x + 0,8505
2
4 R = 0,9983
log MM

0
2 7 12 17 22
Tempo, min

Sendo o y = log MM, e o x = tempo

log MM = 0,1861 x 13,5 + 0,8505

log MM = 3,36885

MM = 103,36885 = 2338
Mecanismo de Ogston Mecanismo de
reptation

Campo elétrico Campo elétrico Campo elétrico

baixo médio alto
 Alta tensão Detector

Detecção
Computador
Capilar

Eletrodo Eletrodo

Eletroferograma

Recipiente de Recipiente de
eletrólito eletrólito
 amostras

eletrólitos de corrida

+
 varia entre um líquido
viscoso e um “sólido”

Gel
Géis Géis
Substituíveis Fixos
(Físicos) (Químicos)
 Gel Químico Gel Físico

• Possui ligações • Não apresenta ligações

cruzadas e com a cruzadas ou com a
parede do capilar; parede do capilar;
• Estrutura de póros • Redes poliméricas
bem definida; enoveladas;
• O tamanho dos póros • Estrutura de póros
não varia após a dinâmica;
polimerização; • O tamanho dos póros
• Partículas danificam o pode variar;
gel; • Partículas podem ser
• Apresenta alta removidas facilmente;
resolução dos analitos; • Pode ser substituído.
• Não substituível.
 [ CH2 CH ]n
C O
NH2
Agente crosslinking:
N, N’-metilenobisacrilamida

%T: concentração total de polímero

%C quantidade de ligações cruzadas

%T diminui o tamanho dos póros

%T aumenta o tamanho dos póros

• usualmente de 3 a 6 % de T com 5 % de C;

• resolução dependente do comprimento do capilar (20

a 150 cm).

30 milhões de pratos/ m
 Problemas associados aos géis fixos de
poliacrilamida:

• Instabilidade dos géis, que podem ser

“arrastados” para fora do capilar devido ao
fluxo eletrosmótico

• Formação de bolhas durante o preparo do

gel

Minimização destes efeitos:

•Utilização de capilares revestidos, a fim de

minimizar ou eliminar o fluxo eletrosmótico;

•As soluções de preparo do gel devem

apresentar alta pureza e passarem por
degaseificação.

Em géis fixos a injeção deve ser

eletrocinética.

Por quê?

Qual problema pode ocorrer quando a

injeção eletrocinética é utilizada?
• Utilizado acima da temperatura de
geleificação, por exemplo 40 °C

• O gel de agarose é caracterizado por possuir

póros grandes

• É o meio de escolha para a separação de

moléculas de DNA de tamanho relativamente
grande

• Apresenta baixa absortividade em 260 nm

• Alquilcelulose
• Dextran
• Polioxietileno
• Galactomanan
• Outros
• UV/Vis;

• Espectroscopia de Massas;

• Fluorescência: detecção indireta ou

através de intercaladores fluoróforos.
DNA

Proteínas

Polissacarídeos

Polímeros sintéticos
Condição desnaturante:
uréia (7 a 9 mol L-1)
A ordem de migração é dada pelo número
de bases
Exemplo: sequenciamento de DNA

Condição não desnaturante:

A ordem de migração é dada pela relação
carga/ área superficial
Exemplo: separação de fragmentos de
restrição, produtos de PCR
Gel de poliacrilamida de ligação
cruzada, 260 nm
 31 43 58

69 85 97

Gel de poliacrilamida de ligação cruzada, CE-LIF

 Antes da desnaturação

ME

Após a desnaturação
 Massa Molecular

30000

14400

97000
45000 66000
20100

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 min

Condições de análise:capilar 32 cm; tensão

-15kV; injeção 900 mbar durante 0,1 min;
detecção 210 nm; eletrólito 12% dextran, 0,4
mol L-1 Tris/Borato, pH 8,5, 0,1% SDS, (Proteínas
desnaturadas segundo protocolo Pharmacia®).
 Nome MM origem
1 α-Lactolbumina 14 400 Leite bovino
2 Tripsina 20 100 Soja
C arbonato 30 000 Eritrócito
3 Anidrase bovino
4 Ovalbumina 45 000 Ovo
5 Albumina 66 000 Soro bovina
Fosforilase b 97 000 Músculo de
6 coelho

6
y = 0,0631x + 3,3248
lo g M M

2
5 R = 0,9943

4
3
8 12 16 20 24 28
Tempo, min
9 Tipos de analitos usualmente
analisados por eletroforese capilar em
gel;

9 Mecanismos de separação e a
influência do campo elétrico;

9 Instrumentação (tipos de injeção,

tratamento da amostra, tipos de
detectores);

9 Tipos de gel e suas principais

diferenças;

9 Determinação de massa molecular.