A.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

1. Hasil Pengamatan

Menghaluskan sampel daun Memindahkan sampel yang

dengan mortal dan pastel telah halus ke dalam tabung
dengan menambahkan buffer steril

+
500µl

Menambahkan 500µl CIA ke

Menginkubasi pada suhu 65oC
dalam sampel dan dicampur
selama 60 menit
hingga homogen

Kemudian sampel disentrifugasi Memindahkan supernatant ke

pada kecepatan 12000 RPM tabung baru dan menambahkan
selama 10 menit 500µl CIA
 Memindahkan supernatant ke
tabung baru dan menambahkan
Lalu disentrifugasi pada 500 µlCIA
kecepatan 12000 RPM selama
5 menit

Lalu disentrifugasi pada Mengambil cairan lapisan atas

kecepatan 12000 RPM selama lalu memindahkannya ke
5 menit tabung baru

Menambahkan 560µl
isopropanol dingin, dan 2,5 M
sodium asetat (1/10 dari Sentrifugasi dengankecepatan
volume), campur hingga 13000 RPM selama 5 menit
homogen
 Membuang supernatant dan
mencuci pellet dengan ethanol
Melarutatkan DNA 50µl TE
70%, kemudian mengeringkan
pellet dengan
DNA aquades

Menghitung konsentrasi DNA Menyimpan DNA dalam suhu

dengan spektrofotometer -20oC guna tahap amplifikasi

Gambar 1 TahapIsolasi DNA

2. Pembahasan
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah molekul utama yang mengode
semuai nformasi yang dibutuhkan untuk proses metabolism dalam setiap
organisme. DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribusa,
basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Menurut
Panji (2015), pada eukariota, DNA dapat ditemukan dalam nukleus,
mitokondria, dan kloroplas. DNA yang terdapat di nucleus disebut dengan
DNA inti sedangkan yang berada di luar nucleus disebut DNA luar inti.
Dalam keadaan sel yang tidak membelah, DNA Nampak sebagai benang-
benang yang melilit protein sehingga Nampak sepertironce-ronce. Proses
isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus
dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada
dinding sel.
Beberapa tahapan dalam isolasi DNA antara lain ekstraksi, purifikasi,
dan presipitasi. Menurut Farabee et al, (2007) ekstraksi dapat diartikan
sebagai proses penghancuran atau pelumatan sel. Pada tahapan ekstraksi
DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNAse yang
dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim
nuclease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan
sebagai kofaktor enzim DNAse. Purifikasi atau disebut juga pemurnian adalah
pemisahan, purifikasi ini dilakukan untuk memudahkan dalam
pengidentifikasian. Pemurnian DNA bertujuan
untukmembersihkanseltanamandarizat-zatlainnya,
menghilangkanbeberapakontaminansepertisenyawasekunder (fenol),
polisakarida, RNA danjuga protein.Pemurniandarikontaminan protein dan
RNA dilakukanmenggunakansenyawakloroformisoamilalkohol, asamasetat,
danenzimRNAse.Senyawakloroformisoamilalkoholdanasamasetatberfungsime
ndenaturasi protein sedangkanenzimRNAseberfungsimelisiskan RNA
dariekstrak DNA
tersebut.TahapterakhirberupapresipitasidimanamenurutPromega (2012)
presipitasiadalah proses mengendapkan protein histon, sehinggauntai-untai
DNA tidaklagimenggulung (coiling) danberikatan.
Presipitasiataupengendapanbertujuanuntukmemisahkan supernatant dengan
pellet.
 Permasalahanutama yang seringmunculdalam proses isolasi DNA
tanamanmenurutNugroho
(2015)adalahkehadiransenyawakontaminanpadasampel yang
diisolasisepertisenyawapolisakarida, polifenol, protein, RNA,
dansenyawametabolitsekunder yang
terdapatpadatumbuhanobatkehadiransenyawakontaminantersebutdapatmengha
mbatberbagai proses mulaidaripemotongan DNA, amplifikasi, hingga cloning.
Berdasarkanpraktikum yang telahdilakukan, metode yang
digunakandalampraktikumBioteknologiPertanianAcara II Isolasi DNA
Tanamaniniyaitumetode 1 yaitumetode Doyle and doyle. Alat yang
digunakanmeliputi mortar and pestle, tabungsteril, centrifugasi, vortex,
spektrofotometer OD dankulkas.Bahan yang
digunakandalammetodeiniyaitudaunsalakvarietasgulapasir, larutanekstraksi,
chloroform, isopropanol dingin, sodium asetat, ethanol 70% dan TE.
Hal Pertamadalammelakukanisolasi DNA adalah buffer
ekstrasisebelumdigunakandipanaskansebanyak 900 µl padasuhu 65oC selama
15-30 menit.Tahapselanjutnyaadalah proses
perusakanataupenghancuranmembrandandindingseldengancaramenghaluskan
daunsalaktersebut. Daun yang
sudahhalusselanjutnyadipindahkankedalamtabungsteril/mikrotubedanmengink
ubasipadasuhu 65oC selama 60
menit.Penginkubasiselesaikemudianditambahkan 500 µl
klorofom.Kemudiantabungdibolak-
balikselamasatumenitdandisentrifugasipada 12.00 rpm selama 10
menitdandiulanglaginamunsentrifugasi yang keduadilakukanselama 5 menit.
Faatih (2009)
menyebutkanbahwaprinsiputamasentrifugasiadalahmemisahkansubstansiberda
sarkanberatjenismolekuldengancaramemberikangayasentrifugalsehinggasubst
ansi yang lebihberatakanberada di dasar, sedangkansubstansi yang
lebihringanakanterletak di atas.
Sentrifugasiyang
telahselesaiakanmembentuksupernatanpadamikrotubebagianatas.
Selanjutnyadilakukanpengambilansupernatantersebutdenganmikropipetlalume
masukkannyaketabungbaru yang sterildanditambahkandengan 1/10 kali
volume larutannatriumasetatdan 1 ml etanol 95% dingin, kemudaindiolak-
baliktabungsecaraperlahan. Selanjutnyadisentrifugasipada 12.000 rpm selama
5 menit.Setelahitu, membuangsupernatant dan pellet dicucidengan 500 µl
etanol 70 % dandisentrifugasi 12.000 rpm selama 5
menitdanetanoldibuangsecarahati-hati.
Menurut Karp (2008) DNA yang
telahdiekstraksidaridalamselselanjutnyaperludipisahkandarikontaminankompo
nenpenyusunsellainnyasepertipolisakaridadan protein agar DNA yang
didapatkanmemilikikemurnian yang
tinggi.Fenolseringkalidigunakansebagaipendenaturasi protein,
ekstraksidenganmenggunakanfenolmenyebabkan protein
kehilangankelarutannyadanmengalamipresipitasi yang
selanjutnyadapatdipisahkandari DNA
melaluisentrifugasi.Berdasarkanhasilisolasi DNA kelompok 12
dapatdiketahuibahwahasilisolasitermasukhasil yang baik.Hal
iniditunjukkandenganterdapatnya supernatant danendapanpadahasilisolasi.
MenurutYulianti (2006) Secaraumum, prosedurekstraksi yang
baikuntukisolasi DNA mencakuptigahalpenting, harusbisamenghasilkan DNA
yang murni, untukpenggunaanselanjutnya.Misalnyauntukanalisa RFLP,
harusdigunakan DNA yang cukupmurniuntukbisadipotongolehrestriction
endonuclease danditransferke membrane untukanalisisSouthern, DNA
harusutuhuntukmemberikanpolamigrasi yang akuratpadagel electrophoresis,
DNA yang dihasilkanharusmencukupi.
 DAFTAR PUSTAKA

Farabee, M J Cells 2007. II: Cellular Organization. Wikibook.

Faatih M 2009. IsolasidanDigesti DNA
Kromosom.JurnalPenelitianSains&Teknologi10(1) : 61 – 67
Karp G2008. Cell and molecular biologi. John wiley. Universitas Michigan.
Nugroho K, Rerenstradika T. Terryana, Dan Puji L 2015. OptimasiMetodeIsolasi
DNA padaJatropha Spp. JurnalAgroteknologi 5 (2) : 15-22
Panji2015.DNA, RNA, danMateri genetic Makhlukhidup.
http://www.edubio.info/.htmldiaksespada 26 April 2017 pukul 21.54 WIB.
Promega2012. Wizard genomic DNA purification kit. Promega Corp, USA:
Yulianti E 2006.PengembanganTeknikIsolasi DNA
TumbuhanMenggunakanDetergenKomersial.Dipresentaskandalam Seminar
NasionalMipa 2006 DenganTema” Penelitian, Pendidikan, pan
PenerapanMipa Serta
PeranannyadalamPeningkatanKeprofesionalanPendidik Dan Tenaga
Kependidikan” Yang diselenggarakanolehFakultasmatematika Dan
IlmuPengetahuanAlam UNY, Yogyakarta