Research article

Correlations of CD28 and PD-1 molecules on peripheral blood T cell with disease
progression in Indonesian patients with chronic HBV infection
(A cross sectional study)

1
Fatmawati, 2Ellyza Nasrul, 3Nasrul Zubir
1
Student of Biomedical Science Post graduate Program, Faculty of Medicine, Andalas
University, Indonesia
2
Department of Clinical Pathology, Faculty of Medicine, Andalas University, Indonesia
3
Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Andalas University, Indonesia
Abstract
Background and Aim: Hepatitis B merupakan salah satu masalah kesehatan utama di
seluruh dunia. Perjalanan klinis hepatitis B bervariasi dari hepatitis B akut, hepatitis B
kronik, sirosis hati, karsinoma hepatoseluler dan kematian. Progresifitas hepatitis B kronik
sangat dipengaruhi oleh respon imun pejamu yang ditentukan oleh aktifitas sel T. Pada
hepatitis B kronik terjadi penurunan respon imun, disfungsi sel T dan perubahan ekspresi
molekul CD28 dan PD-1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan ekspresi
molekul CD28 dan PD-1 pada sel T di darah tepi dengan progresifitas penyakit hepatitis B
kronik. Methods: Pemeriksaan jumlah sel T yang mengekspresikan molekul CD28 dan PD-
1 di darah tepi dilakukan dengan metode flowcytometry. Pemeriksaan HBeAg dilakukan
dengan metode ELFA dan pemeriksaan HBV DNA dilakukan dengan metode RT-PCR.
Hubungan ekspresi molekul CD28 dan PD-1 pada sel T dengan progresifitas penyakit
dianalisis dengan uji statistic oneway analyisis of variance. Hubungan ekspresi molekul
CD28 dan PD-1 dengan riwayat terapi, status HBeAg, dan HBV DNA dianalisis dengan
independent student t–test. Results: Tidak terdapat hubungan ekspresi molekul CD28 pada
penderita hepatitis B kronik dengan progresifitas penyakit hepatitis B kronik. Terdapat
hubungan bermakna antara ekspresi molekul CD28 pada sel T CD8 penderita hepatitis B
kronik dengan penyakit hati stadium akhir. Eksresi molekul PD-1 pada sel T
mempengaruhi progresifitas penyakit hepatitis B kronik. Conclusion: Progresifitas
penyakit pada penderita hepatitis B kronik tidak dipengaruhi oleh ekspresi molekul CD28,
tetapi dipengaruhi oleh ekspresi molekul PD-1 pada sel T terutama sel T CD8. Ekspresi
molekul PD-1 pada penderita hepatitis B kronik dapat dijadikan untuk memonitor respon
imun pada penderita hepatitis B kronik
Key words: Hepatitis B virus, CD28 molecule, programmed cell death 1 (PD-1), chronic
hepatitis B
Corresponding Author: Fatmawati, Biomedical Science Post Graduate Program,
Faculty of Medicine, Andalas University, Padang, Jl. Perintis Kemerdekaan no 94
Padang 25127 Sumatera Barat Indonesia. Tel: +62751891661 Fax: +62751891661.
Email : fatmawati_pk@yahoo.com
Competing Interest: The authors have declared that no competing interest exists.
Data Availability: All relevant data are within the paper and its supporting
information files
INTRODUCTION
Hepatitis B Virus (HBV) infection has become a global threat to human health. In
the world, 2 billions people were infected by HBV and 350-450 million of them become
chronic hepatitis B. Hepatitis B chronic is a high risk condition to be advanced liver disease,
approximately 15-40% become cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Each year, there are
approximately 200.000 death resulting from cirrhosis and 300.000 death resulting
hepatocellular carcinoma. Report from World Health Organization (WHO) in 2002, more
than 600.000 death resulting from acute and chronic hepatitis B virus associated liver
disease.1 (CDC, 2015). Indonesia termasuk daerah endemis VHB dan memiliki prevalensi
infeksi VHB tertinggi ke-tiga di dunia dengan prevalensi sedang, dimana ditemukan 7.1%
populasi terinfeksi oleh virus hepatitis B. Prevalensi HBsAg pada penderita 37-76% pada
penderita sirosis hati dan 37-68% pada penderita karsinoma hepatoseluler (KHS).2
(Muljono, 2017). Kondisi ini ini menyebabkan infeksi VHB memiliki kontribusi yang cukup
besar dalam sistem kesehatan.3 (WHO, 2013).
Pada penderita hepatitis B kronik terjadi gangguan respon imun seluler yaitu
gangguan pada fungsi sel T spesifik, berupa disfungsi sel T, yang ditandai dengan gangguan
proliferasi, diferensiasi, penurunan sekresi sitokin antivirus, gangguan aktifitas sel limfosit T
efektor yang menimbulkan viremia persisten.4-7 (Frebel et al., 2010; Tzeng et al., 2012; Ye
et al., 2015;Tang, 2016). Selama respon imun terhadap VHB berlangsung, sel yang paling
berperan adalah sel T, yang akan mengalami aktifasi jika terdapat sinyal primer, sinyal
sekunder dan sinyal tersier. Sinyal primer berasal dari perlekatan antigen HBV yang
dipresentasikan oleh molekul Human Leucocyte Antigen (HLA) kepada reseptor sel T
(TCR/CD3), membentuk suatu kompleks antigen-reseptor. Perlekatan ini menyebabkan sel
T mengeluarkan sinyal primer (sinyal pertama) yang akan mengawali aktifasi sel T.8,9
(Fletcher, 2011; Yano, 2013). Aktifasi sel T juga diatur oleh sinyal kedua yang ditentukan
oleh keseimbangan antara sinyal positif (stimulasi) dan sinyal negatif (inhibisi).
Keseimbangan ini dipertahankan oleh interaksi molekul kostimulator atau molekul
koinhibitor pada permukaan sel T dengan ligannya di permukaan Antigen Presenting Cells
(APCs). Sinyal stimulasi dan inhibisi ini diberikan oleh APC, diintegrasikan oleh sel T dan
hal ini menentukan hasil akhir aktifasi sel T.10,11 (Liu, 2011; Li et al., 2014). Molekul
CD28 dan molekul PD-1 adalah molekul kostimulator dan koinhibitor utama dipermukaan
sel T yang telah banyak dilaporkan mengalami perubahan ekspresi pada penderita hepatitis
B kronik. Penelitian yang dilakukan oleh Wang et al., (2013) terhadap ekspresi molekul
reseptor kostimulator CD28 pada penderita hepatitis B kronik untuk mengevaluasi fungsi
imun sel T mendapatkan, terjadi penurunan ekspresi reseptor molekul CD28 pada sel T CD4
dan sel T CD8 penderita hepatitis B kronik. Penurunan ekspresi molekul reseptor
kostimulator akan mengganggu aktifasi sel T yang memiliki peranan sentral dalam respon
imun seluler pejamu terhadap infeksi HBV.11,12 (Wang et al., 2013; Li, 2014).
Tang (2016) melaporkan pada penderita VHB kronik, sering ditemukan peningkatan
ekspresi molekul PD-1 di permukaan sel T dan ekspresi molekul PD-1 ini berhubungan
dengan infeksi VHB kronik. Tang juga melaporkan HBV DNA dan HBeAg merupakan
penyebab peningkatan ekspresi molekul PD-1. Ekspresi molekul PD-1 yang tinggi menjadi
indikator sel T yang mengalami disfungsi.7 (Tang, 2016). Perubahan ekspresi molekul
reseptor kostimulator dan perubahan ekspresi molekul reseptor koinhibitor, masing-masing
akan memberikan kontribusi dalam aktifitas fungsional dan proliferasi sel T, dan pada
akhirnya mempengaruhi persistensi virus dan progresifisitas hepatitis B kronik.13 (Crawford
and Wherry, 2009). Because prevalence rates of HBV infection in Indonesia are moderately
high dengan progresifitas penyakit yang sangat bervariasi, in the present study we aimed to
investigate the correlation between the expression molekul kostimulator dan koinhibitor
dengan progresifitas penyakit pada penderita hepatitis B kronik di Indonesia.

MATERIALS AND METHODS

Subjects.
Sampel penelitian adalah 45 penderita hepatitis B kronik yang terdiri dari 15 pasien yang
tidak menerima terapi antivirus dan 30 pasien yang menerima terapi antivirus di bagian
Penyakit Dalam Arifin Ahmad General Hospital Pekanbaru (Riau, Indonesia). Berdasarkan
status klinis pasien dibagi menjadi 3 kelompok: 15 pasien hepatitis B karier inaktif, , 15
pasien hepatitis B chronic active dan 15 pasien dengan End Stage Liver Disease (ESLD;
liver cirrhosis or hepatocelullar carcinoma). Berdasarkan jumlah HBV DNA, pasien
dikelompokkan menjadi 3 kategori: 15 pasien dengan HBV DNA tidak terdeteksi (<20
IU/ml), 27 pasien dengan HBV DNA rendah (<10 6 IU/ml) dan 3 pasien dengan HBV DNA
tinggi (>106 IU/ml). Semua pasien adalah HBsAg positif, anti HCV, anti HIV negatif.
Pasien dengan penyebab kelainan hati kronik lain tidak diikutsertakan dalam penelitian ini.

Preparation of samples
Sampel adalah darah utuh dengan antikoagualan EDTA dan serum yang diambil dari
penderita hepatitis B kronik dengan HBsAg positif yang diperiksa dengan metode Enzyme
Linked Fluorescence Assay (Vidas, Biomereux) di Laboratorium Patologi Klinik RSUD
Arifin Ahmad Pekanbaru. Pemeriksaan ekspresi molekul CD28, PD-1 dan HBV DNA
dilakukan dalam 24 jam pada sampel EDTA dan diperiksa di laboratorium klinik Prodia
Jakarta. Serum dipisahkan dan disimpan pada suhu 2-8 0C yang akan digunakan untuk
pemeriksaan HBeAg dan ALT. Semua subjek penelitian diminta informed consent sesuai
deklarasi Helsinky dan penelitian ini telah mendapat persetujuan dari Komite Etik Fakultas
Kedokteran Universitas Riau, Indonesia.

Flowcytometric analysis
Pemeriksaan ekspresi molekul CD28 and PD-1 dilakukan pada alat flowcytometry FACS
Canto II (BD BioSciences, USA). All the other antibodies were purchased from BD
Biosciences, USA. The cells were analyzed using FACS Canto II and FACS Diva software
versi 8.0.1 (BD Biosciences, USA). At least 10,000-50,000 events per run were acquired
for expression analyses.

Virological assessment and liver biochemical assays

HBeAg was determined by commercial enzyme immunoassay kits (Vidas, Biomereux).
The HBV-DNA load was determined by quantitative Real Time PCR on
COBASAmpliPrep Cobas Taqman HBV version 2.0 (Roche Molecular System, Germany)
with a detection sensitivity of 2,00 x 10^1 viral genome IU/ml (1 IU=5.82 copies). The
serum alanine aminotransferase (ALT) levels were measured by an Autoanalyzer Cobas
Integra 250 (Roche Diagnostic, Germany).
Statistical analysis
Analisis statistic dilakukan dengan SPSS.18.0 for Windosws PC (SPSS IncChicago,
Illinois). Hubungan ekspresi molekul CD28 dan PD-1 dengan progresifitas penyakit
hepatitis B kronik dianalisis menggunakan uji oneway Analysis of Variance (Anova). Data
yang dikumpulkan dilaporkan sebagai mean atau median. Hubungan ekpresi molekul CD28
dan PD-1 dengan riwayat terapi, status HBeAg, HBV DNA dan keberadaan PHSA uji
dengan independent student t-test. Nilai p<0.05 dianggap bermakna secara statistic.

Results
Pada penelitian ini didapatkan 45 pasien hepatitis B kronik dengan HBsAg positif, terdiri
dari 15 penderita hepatitis B karier inaktif, 15 pasien kronik aktif dan 15 pasien dengan
penyakit hati stadium akhir (PHSA) seperti terlihat pada table 1.

Tabel 1. Karakteristik subjek penelitian

n (jumlah) % p
Gender
Male 28 62,2
Female 17 37,8
Age (year) 44 (27-67)
18-40 18 40
41-60 23 51,1
>60 4 8,9
ALT (IU/ml) (Mean±SD) 0,12
Carrier inactive 23±4,10
Chronic active 40±4,22
ESLD 60±21,20
HBV DNA (IU/ml) (Mean±SD) 0,416
Carrier inactive <20 (tidak terdeteksi)
Chronic active 1,82X105 ± (1.45-5,10X105)
ESLD 1,45X106± (1,6-4,5X106)
Smoker 18 40
Alcohol 7 15.6
HBeAg positive 27 60
ALT, alanine aminotransferase; ESLD, End Stage Liver Disease; HBeAg, Hepatitis B e
Antigen
Jumlah imfosit total dan subset limfosit.
Seperti terlihat pada table 2 jumlah limfosit total, limfosit T CD4 dan limfosit T CD8 pada
pasien hepatitis B kronik berada dalam rentang normal. Tidak terdapat perbedaan bermakna
antara jumlah limfosit total, limfosit T, sel T CD4, limfosit T CD8 dan rasio sel T CD4/sel
T CD8 pada kelompok penderita hepatitis B karier inaktif, hepatitis kronik aktif dan
hepatitis dengan penderita penyakit hati stadium akhir (p > 0,05)

Tabel 2. Hubungan jumlah limfosit dan subset dengan progresifitas Hepatitis B kronik
Lymphocyte Carrier inactive Chronic active ESLD p
(cell/ul) (n=15) (n=15) (n=15)
Total` 2004 1913 1944 0.964
T absolut 1244 1058 1430 0,828
T (%) 59,4 63,4 67,9 0,085
CD4 absolut 659 724 602 0,617
CD4 (%) 33,8 37,5 30,8 0,100
CD8 absolut 476 488 686 0,191
CD8 (%) 27,3 29,6 35,4 0,343
CD4/CD8 1,4 1,5 1,1 0,330

ESLD: End Stage Liver Disease

Analisis ekspresi molekul kostimulator CD28

Pada table 3 terlihat ekspresi molekul CD 28 oleh sel T CD4 dan sel T CD8 pada penderita
hepatitis B kronik berada pada rentang normal. Tidak terdapat perbedaan bermakna
ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD4 dan sel T CD8 pada penderita kelompok hepatitis B
karier inaktif, kronik aktif dan penderita penyakit hati stadium akhir (p >0.05).
 Tabel 3. Hubungan ekspresi molekul CD28 dengan progresifitas hepatitis B kronik

CD 28 Carrier inactive Chronic active ESLD p

(n=15) (n=15) (n=15)
CD4 absolut 650 678 596 0,797
CD4 (%) 98,8 94,3 93,3 0,604
CD8 absolut 412 421 655 0,079
CD8 (%) 88,2 85,4 93,6 0,214
ESLD : End Stage Liver Disease

Selanjutnya dilakukan analisis hubungan ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD4 dan sel T
CD8 dengan riwayat terapi, status HBeAg, viral load dan kejadian ESLD. Hasil penelitian
menunjukkan tidak terdapat perbedaan ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD4 dan sel T
CD8 pada kelompok penderita HBeAg positif dengan kelompok penderita HBeAg negatif
(p>0,05). Tidak terdapat perbedaan ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD4 dan sel T CD8
pada kelompok penderita dengan HBV DNA tidak terdeteksi, rendah maupun tinggi
(p>0,05). Tidak terdapat perbedaan ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD4 pada kelompok
dengan ESLD dan kelompok tanpa ESLD (P>0,05), namun sel T CD8 kelompok penderita
dengan ESLD mengekspresikan molekul CD28 yang lebih rendah dibandingkan kelompok
penderita tanpa ESLD (p<0,05).

Analisis ekspresi molekul kostimulator PD-1

Tidak terdapat perbedaan bermakna pada ekspresi molekul PD-1 oleh limfosit CD4 pada
kelompok karier ronik, kronik aktif dan kelompok ESLD. Terdapat perbedaan bermakna
(p<0.05) ekspresi molekul PD-1 oleh limfosit T CD8 baik jumlah absolut maupun
persentase, pada penderita kelompok hepatitis B carrier inaktif, kronik aktif dan penderita
penyakit hati stadium akhir (table 4).
 Tabel 8. Hubungan ekspresi molekul PD-1 dengan progresifitas hepatitis B kronik

Carrier inactive Chronic active ESLD p

PD-1 (n=15) (n=15) (n=15)

CD4+ absolute 209 334 342 0,142

CD4+ (%) 34,9 46,6 70,9 0,059
CD8+ absolute 99 145 309 0,001
CD8+ (%) 22,9 32,7 42,4 0,006
ESLD : End Stage Liver Disease

Anaisis hubungan ekspresi molekul PD-1 dengan terapi, status HBeAg, viral load (HBV

DNA ) dan penyakit hati stadium akhir didapatkkan ekspresi molekul PD-1 oleh sel CD8

dan CD4 pada kelompok dengan terapi lebih rendah secara bermakna dibandingkan dengan

kelompok tanpa terapi (p<0,05). Ekspresi molekul PD-1 oleh sel CD4 dan CD8 lebih tinggi

pada kelompok HBeAg positif, namun perbedaan ini secara statistik tidak bermakna

(p>0,05). Tidak terdapat perbedaan ekspresi molekul PD-1 oleh CD4 pada kelompok HBV

DNA tidak terdeteksi, rendah maupun tinggi, namun terdapat perbedaan bermakna ekspresi

molekul PD-1 oleh CD8 antara kelompok HBV DNA terdeteksi, rendah maupun tinggi

(p<0,05). Tidak terdapat perbedaan ekspresi molekul PD-1 oleh CD4 pada kelompok

dengan PHSA dan kelompok tanpa PHSA (P>0,05), namun terdapat perbedaan bermakna

ekspresi molekul PD-1 oleh CD8 pada kelompok dengan PHSA dengan kelompok tanpa

PHSA (p<0,05).

Discussion
 Pada table 1 terlihat distribusi frekuensi jenis kelamin penderita hepatitis B kronik
lebih banyak pada pria (62,2%) dibanding wanita (37,8%). Rerata umur penderita adalah 44
tahun, dengan umur termuda 27 tahun dan umur tertua 67 tahun. Kelompok umur penderita
terbesar adalah pada kelompok 41-60 tahun. Terdapat perbedaan bermakna kadar ALT
pada kelompok penderita karier inaktif, kelompok kronik aktif dan penderita ESLD (p <
0.05). Tidak terdapat perbedaan bermakna antara viral load pada ke-tiga kelompok (p =
0,416). Empat puluh persen penderita adalah perokok dan 15% adalah peminum alcohol,
dan sebagian besar penderita (60%) adalah HBeAg positif.
Pada penelitian ini didapatkan 45 subjek penelitian dengan dominasi penderita
adalah pria (62,2%). Hasil penelitian ini tidak jauh berbeda dengan penelitian lain yang
juga melaporkan prevalensi infeksi hepatitis B yang lebih tinggi pada pria dibanding
wanita. Penelitian yang melaporkan prevalensi hepatitis B yang lebih tinggi pada pria
seperti penelitian Guclu et al 2016 yang mendapatkan prevalensi hepatitis B yang lebih
besar pada pria dibanding wanita.14 (Guclu et al, 2016) melaporkan prevalensi hepatitis B
yang tinggi pada pria 59.1%, wanita 58.3%. Pria memiliki risiko lebih tinggi terpapar HBV
dibanding wanita, kemungkinan akibat kewaspadaan terhadap beberapa risiko infeksi yang
lebih rendah pada pria dibanding wanita. Penyebab lain karena pria memiliki lebih banyak
risiko tertular HBV melalui aktifitas bercukur atau sirkum sisi.14 (Guclu, 2016). Beberapa
penelitian menyebutkan bahwa umur, jenis kelamin dan jumlah virus yang bersirkulasi di
dalam darah mempengaruhi progresifitas hepatitis B kronik sehingga terjadi peningkatan
insiden sirosis hati dan KHS.15 (Fattovich, 2003).
Pada penelitian ini kelompok umur terbanyak adalah pada kelompok umur 41-60
tahun dengan median umur 44 tahun (rentang:27-67). Hasil penelitian ini sama dengan
penelitian lain yang mendapatkan kelompok umur terbanyak adalah usia dewasa seperti
Guclu, 2016, yang melakukan penelitian prevalensi HBV di Turki mendapatkan persentase
penderita tertinggi pada usia 51-60 tahun dan persentase terendah pada usia 0-12 tahun.
Infeksi hepatitis B lebih jarang ditemukan pada usia sangat muda atau pada penderita
berusia tua. 14 ( Guclu, 2016)

Hubungan jumlah dan subset limfosit dengan progresifitas hepatitis B kronik

 Pada penderita hepatitis B kronik terjadi perubahan aktifitas limfosit T yang
ditandai dengan adanya disfungsi limfosit T. Disfungsi limfosit T ini diduga terjadi akibat
gangguan aktifasi yang menyebabkan gangguan pada respon imun sehingga tubuh tidak
dapat melakukan eliminasi terhadap virus. Respon imun yang tidak efektif ini
menyebabkan infeksi persisten dan inflamasi kronik yang menentukan progresifitas
hepatitis B kronik. Progresifitas hepatitis B kronik pada penderita bervariasi diantaranya
menjadi karier kronik, hepatitis B kronik akut atau mengalami penyakit hati stadium akhir
seperti sirosis hati dan KHS. Pada pasien dengan infeksi VHB kronik, terjadi proses
nekroinflamasi dalam derajat rendah dan berkesinambungan sehingga menyebabkan
timbulnya fibrosis, sirosis dan KHS. 16 (Mc Mahon, 2009). Pada penelitian ini tidak
terdapat perbedaan antara jumlah limfosit dan subset limfosit pada penderita hepatitis B
kronik inaktif, kronik aktif dan penderita dengan penyakit hati stadium akhir. Dengan
demikian dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan jumlah limfosit dan sub set limfosit
dengan progresifitas hepatitis B kronik (p>0,05). Rerata jumlah limfosit total pada
penderita hepatitis B kronik inaktif, hepatitis kronik aktif masih dalam rentang normal
(1000-3000/ul). Begitu juga rerata jumlah sel T CD4 dan sel T CD8 pada penderita
hepatitis B kronik masih berada dalam rentang normal, nilai normal berturut-turut : 64-
1721/ul dan 135-852 /ul. Rasio sel T CD4 terhadap sel T CD8 (CD4/CD8 ratio) pada ke-3
kelompok penderita hepatitis B kronik juga masih dalam rentang normal yaitu sebesar 1,62.
17 (Apoil PA, 2017). Penelitian terhadap jumlah limfosit di darah tepi dan di jaringan hati
pada 21 penderita HBV kronik aktif dan 13 penderita HBV kronik inaktif dibandingkan
dengan 20 penderita HCV oleh Dimitropoulou pada tahun 2011 mendapatkan tidak terdapat
perbedaan jumlah semua limfosit dan subset limfosit pada penderita HBV kronik karier
dengan penderita kronik aktif. Tetapi jika dibandingkan jumlah limfosit penderita HBV
dengan penderita HCV, maka terdapat peningkatan yang signifikan pada jumlah limfosit,
sel T CD4,dan sel T CD8 pada penderita HCV dibanding HBV kronik. Hal ini
menunjukkan respon imun seluler yang adekuat pada penderita HCV sangat penting dan
menentukan efektifitas pembersihan virus serta terhadap derajat kerusakan sel hati
dibanding pada penderita HBV kronik.18 (Dimitropoulou, 2011). Penelitian terhadap tikus
HBV transgenic (HBV transgenic mice) oleh Yan X juga melaporkan jumlah sel T CD4 di
darah tepi yang cukup rendah, namun pemberian interferon alfa subkutan secara signifikan
dapat meningkatkan jumlah limfosit di darah tepi.19 (Yan X, 2016).

Hubungan ekspresi molekul CD28 dengan progresifitas hepatitis B kronik

Respon imun pejamu memainkan peran yang sangat vital dalam pathogenesis dan
luaran klinis infeksi Hepatitis B.12 (Wang 2014). Pada saat seseorang terinfeksi VHB,
kekuatan respon imun yang dijalankan oleh limfosit T CD8 spesifik memainkan peranan
penting dalam mekanisme pengontrolan terhadap virus dan bertanggung jawab atas
kerusakan sel hati. Kelainan pada sistem imun, terutama pada sel T CD4 dan sel T CD8
menyebabkan virus tidak dapat deliminasi sehingga infeksi berlangsung persisten.12,20
(Wang, 2014; Chisari, 2010). Molekul CD28 diekspresikan dipermukaan sel limfosit T dan
berperan dalam aktifasi limfosit T. Jika terjadi penurunan ekspresi CD28 pada limfosit T
akan menyebabkan ganggguan aktifasi limfosit T dan menimbulkan disfungsi sel T. Sel
yang mengekspresikan CD28 memiliki efek berlawanan dengan sel T yang tidak
mengekspresikan CD28. Sel T yang tidak mengeskpresikan CD28 memberikan efek
inhibisi terhadap sel T dan menggganggu proses eliminasi virus. Dengan demikian,
keseimbangan dan rasio antara jumlah limfosit T yang mengekspresikan molekul CD28
dengan limfosit T yang tidak mengekspresikan molekul CD28 yang akan menentukan hasil
akhir aktifasi sel T.11 (Li, 2014). Salah satu faktor penyebab terjadinya disfungsi limfosit T
adalah ketidakseimbangan sinyal dari molekul kostimulator dan koinhibitor yang terjadi
akibat penurunan jumlah limfosit T yang mengekspresikan molekul kostimulator utama
CD28 dan peningkatan jumlah limfosit T yang mengekspresikan molekul koinhibitor utama
PD1 pada permukaannya. Perubahan ekspresi faktor kostimulator dan koinhibitor pada sel
T penderita hepatitis B kronis telah banyak dilaporkan dalam penelitian. Penelitian oleh
Webster Bertoletti menunjukkan ekspresi molekul kostimulator CD28 pada permukaan sel
TD CD8 menyebabkan sel tersebut berdiferensiasi menjadi sel T sitoksik spesifik selama
terjadi stimulasi oleh antigen virus dan hal ini memainkan peranan penting dalam
mekanisme bersihan virus.21 (Webster, 2001).
Pada penelitian ini >90% sel T CD4 dan sel T CD8 penderita hepatitis B kronik
mengekspresikan molekul kostimulator CD28 dan tidak terdapat perbedaan bermakna
diantara kelompok penderita hepatitis B karier inaktif, hepatitis kronik aktif dan penderita
dengan penyakit hati stadium akhir. Hal ini menunjukkan bahwa penderita hepatitis B
kronik tidak mengalami gangguan ekspresi molekul CD28. Dengan demikian disfungsi sel
T pada penderita yang menyebabkan persistensi virus dan kronisitas penyakit pada
penderita hepatitis B kronik ini bukan disebabkan oleh gangguan ekspresi molekul CD28.
Hasil penelitian ini berbeda dengan penelitian Li dkk yang melaporkan terdapat penurunan
jumlah limfosit T CD8 di darah tepi yang mengekspresikan molekul CD28, serta
penurunan rasio sel T CD8+CD28+/CD8+CD28-. Penurunan ini berhubungan dengan
disfungsi sel T dan pathogenesis penyakit hepatitis B kronik.11 (Li, 2014). Perbedaan hasil
ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa faktor lain yang mempengaruhi seperti faktor
terapi, status HBeAg, viral load dan keberadaan penyakit hati stadium akhir.

Hubungan ekspresi molekul CD28 dengan riwayat terapi, status HBeAg, viral load
dan penyakit hati stadium akhir
Analisis lebih lanjut dilakukan untuk mencari hubungan antara ekspresi molekul
CD28 dengan parameter klinis seperti status terapi, status HBeAg, viral load dan
keberadaan penyakit hati stadium akhir. Sebagian besar subjek penelitian (66,7%) penderita
telah mendapat terapi baik terapi interferon maupun terapi dengan nukleosida analog (NA),
status HBeAg positif (60%), HBV DNA terdeteksi (66,7%) dan disertai penyakit hati
stadium akhir sebesar 33,3% . Hasil penelitian didapatkan tidak terdapat hubungan antara
ekspresi molekul CD28 dengan riwayat terapi. Hal ini menunjukkan bahwa pada penderita
hepatitis yang diteliti tidak terdapat gangguan ekspresi molekul CD28, sehingga
kemungkinan gangguan fungsi sel T pada penderita hepatitis B kronik bukan disebabkan
oleh penurunan ekspresi molekul CD28 oleh limfosit T. Penelitian oleh Webster Bertoletti
dkk menunjukkan ekspresi molekul kostimulator CD28 pada permukan sel T CD8 di
sirkulasi menyebabkan diferensiasi sel menjadi sel T CD8 spesifik selama terjadi stimulasi
oleh antigen dan hal ini memainkan peran yang sangat penting dalam proses pembersihan
virus dari tubuh.21 (Webster, 2001). Jika ekspresi molekul CD28 tidak mengalami
penurunan, maka kemungkinan terdapat penyebab lain yang menimbulkan disfungsi sel T
dan kegagalan sistem imun sehingga virus menjadi persisten dan penyakit berlangsung
progresif. Ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD4 dan sel T CD8 pada penderita dalam
penelitian ini tidak dipengaruhi oleh parameter klinis seperti riwayat terapi, status HBeAg
dan viral load (p>0,05). Hasil ini sama dengan laporan Wang dkk yang juga mendapatkan
tidak terdapat hubungan antara ekspresi molekul CD28 dengan, terapi, viral load dan status
HBeAg. Wang juga mengatakan ekspresi molekul CD28 tidak dapat dijadikan indikator
efek pengobatan karena pada penderita yang mendapatkan pengobatan didapatkan ekspresi
molekul CD28 yang lebih rendah dibandingkan penderita yang tidak mendapat
pengobatan.12(Wang, 2014). Hasil penelitian ini berbeda dengan laporan Li dkk yang
meneliti ekspresi molekul CD28 pada sel T CD8 penderita hepatitis B kronik dibandingkan
kontrol sehat. Li dkk menemukan ekspresi CD28 yang lebih rendah pada penderita hepatitis
B kronik dibandingkan kontrol sehat, dan hasil ini berhubungan dengan status HBeAg dan
viral load. Penurunan jumlah limfosit T CD8 yang mengekspresikan molekul CD28 dan
penurunan rasio limfosit T CD8+CD28+/ limfosit T CD8+CD28- menyebabkan inaktifasi sel
T sehingga sel T tidak mampu mengeliminasi virus. Pemberian terapi Peg-IFN-𝛼
menurunkan jumlah limfosit T CD8+CD28- dan meningkatkan rasio limfosit T
CD8+CD28+/limfosit T CD8+CD28-.11 (Li, 2014).
Hasil penelitian ini menunjukkan persistensi virus, kronisitas penyakit dan
progresifitas penyakit hepatitis B kronik akibat disfungsi sel T tidak dipengaruhi oleh
ekspresi molekul CD28, tetapi kemungkinan disebabkan oleh faktor lain seperti faktor virus
atau lingkungan. Namun hal ini harus dibuktikan dengan penelitian lebih lanjut dengan
jumlah sampel yang lebih banyak, desain penelitian case control untuk menganalisis
pengaruh faktor virus dan lingkungan terhadap progresifitas hepatitis B kronik.
Pada waktu dilakukan analisis ekspresi molekul CD28 oleh sel T CD8 penderita
dengan ESLD dan penderita tanpa ESLD , terdapat perbedaan bermakna ekspresi CD28
oleh sel T CD8 penderita dengan ESLD dan penderita tanpa ESLD (p<0,05). Penderita
hepatitis B kronik dengan ESLD mengeskpresikan molekul CD28 yang lebih rendah
dibanding penderita hepatitis kronik tanpa PHSA (p<0,05). Hsu pada tahun 2010 juga
melaporkan penurunan ekspresi molekul CD28 oleh sel limfosit yang menginfiltasi tumor
pada penderita KHS stadium lanjut.22 (Hsu, 2010). Sel T CD8 pada infeksi virus berperan
penting dalam proses eliminasi virus dan sel kanker. Aktifasi sel T CD8 terjadi melalui
sinyal aktifasi dari molekul kostimulator CD28. Penurunan ekspresi CD28 oleh sel T CD8
penderita dengan penyakit hati stadium akhir menunjukkan adanya peran CD28 dalam
perkembangan sirosis hati dan karsinoma hepatoseluler. Penurunan jumlah limfosit T CD8
yang mengekspresikan molekul CD28 pada penderita hepatitis kronik dengan PHSA
mengkonfirmasi adanya gangguan fungsi sel T CD8 akibat perubahan molekul kostimulator
pada penderita hepatitis B kronik stadium lanjut.

Hubungan ekspresi molekul PD-1 dengan progresifitas hepatitis B kronik

Pada penelitian ini didapatkan peningkatan bermakna ekspresi PD-1 pada sel T CD8
sesuai dengan progresifitas penyakit. Tetapi tidak terdapat hubungan ekspresi molekul PD-
1 pada sel T CD4 dengan progresifitas penyakit. Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian
Wang dkk yang mendapatkan peningkatan bermakna molekul PD-1 pada sel T CD4 dan
sel T CD8 pada kelompok penderita tanpa terapi.12(Wang, 2014). Hasil penelitian ini sama
dengan laporan peneliti lain seperti Boni 2007 yang juga melaporkan adanya peningkatan
ekspresi molekul koinhibitor PD-1 pada limfosit T CD8 penderita hepatitis B
kronik.23(Boni, 2007)
Molekul PD-1 merupakan molekul inhibitor yang menyebabkan hambatan aktifasi
sel T dan berperan penting dalam regulasi sistem imun dan self tolerance. Peningkatan
ekspresi molekul PD-1 di permukaan sel T akan menghambat aktifasi sel T dan merupakan
salah satu mekanisme yang bertanggung jawab atas kegagalan respon imun mengeliminasi
virus dan membersihkan sel ganas pada penderita hepatitis B kronik dengan liver sirosis
atau HCC. Perlekatan PD-1 dengan ligan PD-L1 akan merekrut thyrosine phosphatase
SHP-2, yang akan melakukan defosforilasi dan deaktifasi molekul efektor proksimal seperti
Zap70 pada sel T. Inhibisi PD-1 pada sel T menghambat proliferasi sel T dan menghambat
sekresi sitokin seperti IFN- ɤ dan IL-2.24 (Lim, 2016). Blokade yang dilakukan pada
molekul PD-1 mengembalikan fungsi limfosit T dan meningkatkan sekresi sitokin antivirus
seperti IFN-ɤ, TNF-α dan IL-2.25 (Evans, 2010).

Hubungan ekspresi molekul PD-1 dengan terapi, status HBeAg, viral load dan
penyakit hati stadium akhir
Ekspresi molekul PD-1 oleh sel T CD4 dan sel T CD8 pada kelompok dengan
terapi lebih rendah dibandingkan dengan kelompok tanpa terapi (p<0,05). Hasil ini sama
dengan hasil penelitian Wang dkk yang juga menemukan ekspresi molekul PD-1 yang lebih
rendah pada penderita yang mendapat terapi dibandingkan dengan penderita yang tidak
mendapat terapi. Hal ini menunjukkan kemungkinan ekspresi PD-1 pada sel T dapat
dijadikan indicator efisisensi pengobatan pada penderita hepatitis B kronik.12 (Wang,
2014). Evans pada tahun 2010 melaporkan pemberian terapi menurunkan viremia (viral
load) pada penderita hepatitis B kronik secara signifikan dan juga menurunkan ekspresi
PD-1 pada sel T dan meningkatkan reaktifitas sel T.25 (Evans, 2010).
Pada penelitian ini tidak terdapat hubungan antara ekspresi molekul PD-1 dengan
status HBeAg dan viral load. Hasil ini menujukkan bahwa HBeAg dan viral load tidak
mempengaruhi ekspresi molekul PD-1 pada sel T. Hasil penelitian ini berbeda dengan hasil
penelitian Evans pada tahun 2010 yang melaporkan terdapat hubungan langsung antara
viral load dengan ekspresi PD-1 pada permukaan sel T CD8 spesifik HBV.25 (Evans,
2010). Tang dkk pada tahun 2016 menyebutkan terdapat korelasi positif yang bermakna
antara ekspresi PD-1 pada sel T CD8 dengan titer HBV DNA, dimana ekspresi PD-1
tertinggi pada kelompok penderita dengan titer HBV DNA >106 IU/ml.7 (Tang, 2016).
Perbedaan hasil ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan pada besar sampel dan desain
penelitian serta perbedaan pada populasi penderita hepatitis B kronik yang diteliti.
Pada penelitian ini terdapat peningkatan bermakna ekspresi molekul PD-1 pada sel T
CD8 penderita hepatitis kronik dengan penyakit hati stadium akhir dibandingkan penderita
tanpa penyakit hati stadium akhir. Penelitian yang dilakukan oleh Hsu dkk pada penderita
HBV dengan HCC menunjukkan peningkatan jumlah limfosit yang menginfiltrasi tumor
(tumour-infiltrating lymphocytes/TIL) yang mengekspresikan molekul PD-1, penurunan
ekspresi molekul CD28 dan CD127.22 (Hsu, 2010). Hal ini memberikan bukti lebih lanjut
adanya peran molekul PD-1 pada patogenesis penyakit hati stadium akhir terutama KHS
pada penderita hepatitis B kronik. Pada KHS, sel tumor dapat merubah ekspresi immune
checkpoints seperti molekul PD-1 sebagai salah satu mekanisme tumor untuk menghindari
anti-cancer immune surveillance. Pada microenvirontment tumor, antigen spesifik pada sel
T akan menginduksi ekspresi molekul PD-1 pada limfosit T CD8 dan meningkatkan
ekspresi molekul PD-L1 pada sel kanker.26 (Lee, 2018). Peningkatan ekspresi PD-1 dan
PD-L1 ini akan menyebabkan hambatan aktifasi limfosit dan menyebabkan disfungsi sel
T.27 (Cho,2017) Sel T yang mengalami disfungsi berhubungan dengan persistensi viremia
pada HBV dan progresifitas KHS melalui mekanisme penekanan pada imunitas yang
diperantarai sel T spesifik (T-cell exhaustion). Penekanan imunitas akan menginduksi
toleransi imun atau immune escape dari sel kanker.28 (Pardee, 2012). Meskipun pada saat
ini telah dikembangkan immunotherapy menggunakan antibody terhadap molekul
koinhibitor seperti anti CTLA-4, anti PD-1 dan anti PD-L1, namun penggunaan antibody
ini masih memerlukan penelitian lanjutan untuk menilai keamanan dan efektifitas
penggunaan inhibitor terhadap immune checkpoint tersebut.26(Lee, 2018).

Conclusion
Ekspresi molekul CD28 pada penderita hepatitis kronik di Indonesia berada dalam rentang
normal dan tidak berhubungan dengan progresifitas penyakit pada hepatitis B kronik.
Ekspresi molekul PD-1 oleh sel T CD8 mengalami peningkatan terutama pada penderita
hepatitis B kronik dengan penyakit hati stadium akhir, dan peningkatan ini berhubungan
dengan progresifitas penyakit pada hepatitis B kronik. Penelitian ini juga menunjukkan
perjalanan klinis dan progresifitas infeksi hepatitis B tidak mudah diprediksi karena banyak
sekali factor yang mempengaruhi, baik factor virus, factor lingkungan dan factor pejamu,
sehingga diperlukan penelitian lanjutan untuk melihat factor yang paling berperan dalam
progresifitas penyakit pada penderita hepatitis B kronik di Indonesia

References

1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Epidemiology and Prevention of

Vaccine-Preventable Diseases. 2015;13th Edition April.

2. Muljono DH. Epidemiology of hepatitis B and C in Republic of Indonesia.

Euroasian J. Hepato-Gastroenterol. 2017;7:55-59.

3. World Health Organization (WHO). Global Policy Report on the Prevention and

Control of Viral Hepatitis in WHO Member States. World Health Organization,

Geneva, Switzerland. 2013:20

4. Frebel H, Richter K, Oxenius A. How chronic viral infections impact on

antigen-specific T-cell responses. Eur J Immunol. 2010;40:654-663

5. Tzeng H-T, Tsai H-F, Liao H-J, Lin Y-J, Chen L, Chen P-J. PD-1 Blockage

Reverses Immune Dysfunction and Hepatitis B Viral Persistence in a Mouse Animal

Model. PLoS ONE. 2012;7(6): e39179.

6. Ye B, Liu X, Li X, H Kong H, Tian1 L, Chen Y. T-cell exhaustion in chronic

hepatitis B infection: current knowledge and clinical significance. Cell Death and

Disease 2015;6, e1694;

7. Tang Z-S, Hao Y-H, Zhang E-J, Xu C-L, Zhou1 Y, Zheng X1et al. CD28 family of

receptors on T cells in chronic HBV infection: expression characteristics, clinical

significance and correlations with PD-1 blockade. Molecular Medicine Reports

2016;14:1107-16

8. Fletcher GJ, Samuel P, Christdas J, et al. Association of HLA and TNF

polymorphisms with the outcome of HBV infection in the South Indian population.

Genes Immun 2011;12:552-558 [PMID: 21593777 DOI: 10.1038/gene.2011.32]

9. Yano Y, Seo Y, Azuma T, Hayashi Y. Hepatitis B virus and host

factorsHepatobiliary Surg. Nutr. 2013;2:121–123

10. Liu XY, Shi F, Zhao H,Wang HF. Research of PD-1 expression in CD8+ T cell of

peripheral blood with HBV-associated acute-on-chronic liver failure. Zhonghua Shi

Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi 2010;24:125-127

11. Li X, Kong H, Tian L, et al. Changes of Costimulatory Molecule CD28 on

Circulating CD8+ T Cells Correlate with Disease Pathogenesis of Chronic Hepatitis

B. Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International 2014,Article ID

423181, 6pages
12. Wang L, Zhao C, Peng Q, Shi J, Gu G. Expression levels of CD28, CTLA-4, PD-1

and Tim-3 as novel indicators of T-cell immune function in patients with chronic

hepatitis B virus infection. Biomedical reports 2014; 2: 270-274

13. Crawford A, Wherry EJ. The diversity of costimulatory and inhibitory receptor

pathways. Curr Opin Immunol. 2009; 21(2): 179–186

14. Guclu E, Ogutlu A, Karabay O. A Study on the Age-Related Changes in Hepatitis B

and C Virus Serology. Eurasian J Med 2016; 48: 37-41

15. Fattovich G. Natural history and prognosis of hepatitis B. Semin Liver Dis.

2003;23:47–58.

16. McMahon BJ. The Natural History of Chronic Hepatitis B Virus Infection.

Hepatology 2009;49:S45-S55

17. Apoil PA, Puissant-Lubrano B, Congy-Jolivet N, Peres M, Tkaczuk J, Roubinet F,

Blancher A. Reference values for T, B and NK human lymphocyte subpopulations

in adults. Data in Brief 12;2017 :400–404

18. Dimitropoulou D, Karakantza M, Tsamandas AC, Mouzaki A, Theodorou G, Gogos

CA. T-Lymphocyte subsets in peripheral blood and liver tissue of Patients with

chronic Hepatitis B and C. In Vivo. 2011; 25 (5) : 844-40

19. Yan X, Zhong RH, Liu JH, Zhou Y, Tang LB, Li YY et al. Nan Fang Yi Ke Da Xue

Bao 2016; 36 (6): 870-4

20. Chisari FW, Isogawa M, Wieland SF,. Pathogenesis of hepatitis B virus infection.

Pathol Biol 2010;58 (4) : 258–266

21. Webster G; Bertoletti A. Quantity and quality of virus specific CD8 cell response:

relevance to the design of a therapeutic vaccine for chronic HBV infection,”

Molecular Immunology 2001;l.38 (6): 467–73

22. Hsu PN, Yang TC, Kao JT, et al. Increased PD-1 and decreased CD28 expression in

chronic hepatitis B patients with advanced hepatocellular carcinoma. Liver

International 2010; 30 (9)

23. Boni C, Fisicaro P, Valdatta C, Amadei B, Di Vincenzo P, Giuberti T et al..

Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic

HBV infection. J Virol 2007;81: 4215–4225.

24. Lim ST, Chew V, Sieow JL, Goh S, Yeong JPS, Soon AL et al. PD-1 expression on

Dendritic cells suppresses CD8+ T cell function and anti tumor immunity.

Oncoimmmunology 2016; 5 (3) : e1085146

25. Evans AKC. The Role of the Programmed Cell Death (PD-1) Pathway in the

Immunopathogenesis of Chronic Hepatitis B Infection. Disssertation, University

College London, England 2010.

26. Lee JH, Oh SY, Kim JY, Nishida N. Cancer immunotherapy for hepatocellular

carcinoma. Hepatoma Res 2018;4:51

27. Cho H, Kang H, Lee HH, Kim CW. Programmed Cell Death 1 (PD-1) and ytotoxic

T Lymphocyte-Associated Antigen 4 (CTLA-4) in Viral Hepatitis Int. J. Mol. Sci

2017, 18,1517