BAB IV

ANALISIS KUALITATIF PROTEIN

TUJUAN :
 Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein
 Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode

A. Pre-lab
1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin?
Ninhidrin ( Triketohirinden hidrat ) adalah suatu senyawa oksidator kuat yang apabila
bereaksi dengan asam a-amino pada pH 4-8 akan menghasilkan warna ungu. Reaksi ini
terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan CO. Reaksi ninhidrin
digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asam a-amino. Pada asam amino, terdapat
gugus karboksil yang dapat dilepaskan dengan proses dekarboksilasi dan menghasilkan
suatu amina (Suprapta KA, 2014).

2. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode biuret?

Analisis protein dengan metode biuret bertujuan untuk ikatan peptida pada suatu sampel.
Biuret akan memberi warna ungu bila direaksikan dengan larutan basa kuat yaitu
penambahan CuSO4. Perubahan warna menjadi ungu, menandakan bahwa dalam larutan
tersebut telah terbentuk senyawa kompleks. CuSO4 dalam suasana basa bereaksi dengan
senyawa yang mengandung dua atau tiga ikatan peptida. Senyawa ini terbentuk antara Cu 2+
dengan gugus C=O dan N-H dari rantai peptida. Reaksi ini disebut reaksi biuret (Putra AR,
2013).

3. Mengapa pengujian protein selalu dilakukan pada kondisi alkali/basa?

Pada kondisi basa protein dapat membentuk warna ungu/violet yang menandakan
terbentuknya senyawa kompleks karena adanya reaksi dengan polipeptida atau ikatan-
ikatan peptida yang menyusun protein (Anisa C, 2009)
B. Tinjauan Pustaka
1. Protein
Protein adalah molekul makro yang mempunyai berat molekul antara lima ribu
hingga beberapa juta. Protein terdiri atas rantai-rantai panjang asam amino, yang
terikat satu sama lain dalam ikatan peptida. Asam amino terdiri atas unsur-unsur
karbon, hidrogen, oksigen dan nitrogen, beberapa asam amino di samping itu
mengandung unsur-unsur fosfor, besi, sulfur, iodium, dan kobalt (Almatsier S, 2009).
2. Uji Ninhidrin
Reaksi ninhidrin dengan pereaksi triketohirinden hidrat (oksidator kuat)
digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asam a-amino. Apabila bereaksi
dengan asam a-amino pada pH 4-8 akan menghasilkan warna ungu (Suprapta KA,
2014). Berikut adalah reaksi uji ninhidrin:

Sumber: (Suprapta KA, 2014)

3. Uji Biuret
Pembentukan kompleks Cu2+ dengan gugus –CO dan –NH dari rantai peptida
dalam suasana basa. Pada reaksi ini positif untuk zat yang mengandung dua atau lebih
ikatan peptida. Reaksi ini negatif untuk asam amino yang tidak mempunyai ikatan
peptida atau yang hanya mengandung 1 ikatan peptida. Sampel akan berwarna ungu
jika reaksi positif (Suprapta KA, 2014). Berikut adalah reaksi uji biuret:
 Sumber: (Putra AR, 2013)
4. Fungsi reagen
a. Reagen ninhidrin
Reagen bersifat oksidator kuat. Pereaksi digunakan untuk mengatahui adanya
kandungan asam a-amino dengan hasil positif berwarna ungu. Pembentukan
larutan kompleks berwarna ungu ini terjadi karena dekarboksilasi oksidatif dari
asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, NH3 dan CO2. Kemudian terjadi
reaksi antara ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan
molekul NH3 yang dibebaskan (Putra AR, 2013). Berikut struktur pereaksi
ninhidrin:

Sumber: (Putra AR, 2013)

b. Reagen biuret
Reagen biuret yang mengandung Ion Cu2+ dalam suasana basa akan bereaksi
dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu atau violet (Putra AR, 2013). Berikut struktur
pereaksi biuret:

Sumber: (Putra AR, 2013)

5. Tinjauan bahan
a. Gelatin
Gelatin adalah suatu polipeptida larut berasal dari kolagen, yang merupakan
konstituen utama dari kulit, tulang, dan jaringan ikat binatang. Gelatin diperoleh
melalui hidrolisis parsial dari kolagen. (Winarno, 2008).
 Sumber: (Sri dkk, 2015)
b. Susu skim
Susu skim adalah bagian susu yang tertinggal sesudah krim diambil sebagian
atau seluruhnya. Susu skim mengandung semua zat makanan dari susu kecuali
lemak dan vitamin-vitamin yang larut lemak (Buckle KA et al., 2009).

Sumber: (Buckle KA et al, 2009)

c. MSG (Monosodium Glutamat)
MSG adalah bentuk garam dari asam glutamat. Asam glutamat sendiri
merupakan asam amino non-essensial yang menjadi bahan baku sintesis asam
amino lain dan sebagai substrat bila sintesis gluthation (Winarno, 2008).

Sumber: (Ilyas S, 2013)

d. Aspartam
Aspartam memiliki rumus kimia C14H18N2O5 dan berat molekul 294.301 atau
aspartil feninilalanin metil ester (APM). Senyawa aspartam bersifat tidak berbau,
berbentuk tepung kristal berwarna putih, sedikit larut air, dan berasa manis
(Winarno, 2008).

Sumber: (Barokah U, 2007)

C. Diagram Alir
1. Uji Ninhidrin

Tabung reaksi

2 ml larutan sampel

2 ml larutan ninhidrin

Dimasukkan ke dalam air mendidih selama 15-20 detik

Diamati warna larutan

Hasil

2. Uji Biuret
3 ml sampel

1 ml NaOH 10%

Dikocok

5 tetes larutan CuSO4 0,1%

Diamati timbulnya warna

Hasil

D. Hasil Percobaan Dan Pengamatan :

1. Uji Ninhidrin
a. Tuliskan data hasil uji Ninhidrin
Sebelum
No Sampel Sesudah pemanasan Hasil uji
Pemanasan
Putih keruh, ada endapan ungu
1 Susu skim Kuning keruh +
muda
2 MSG Bening keunguan Hitam (Ungu sangat pucat) +
Aspartam Bening Tidak mengalami perubahan -
3 Ungu bening (ada endapan
Setelah dikocok : Putih keruh +
kristal)
Gelatin Putih keruh Hitam (Ungu sangat pucat) +
4
Setelah dikocok : Bening Bening -

b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Ninhidrin dari beberapa sampel dalam percobaan
ini!
Uji nindidrin bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya asam amino bebas yang terdapat
di dalam suatu sampel. Pengujian dilakukan dengan menambah reagen ninhidrin
(Triketohidrin Hidrat) yang akan bereaksi dengan asam amino bebas dan menghasilkan
kompleks berwarna ungu ruhemann.
1.1 Analisa Prosedur
Pada uji ninhidrin, sebanyak 2 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian
tambahkan lagi pereaksi ninhidrin. Pereaksi ninhidrin berfungsi sebagai pereaksi yang akan
bereaksi dengan asam amino bebas dalam suatu larutan. Sampel yang digunakan adalah
larutan susu skim, larutan larutan gelatin, larutan monosodium glutamat, larutan aspartam.
Perubahan warna saat penambahan ninhidrin belum signifikan terjadi karena belum dilakukan
pemanasan. Selanjutnya masukkan tabung reaksi ke dalam air mendidih selama 20 detik.
Perlakuan ini bertujuan untuk mempercepat reaksi. Warna ungu akan muncul dan menyebar
perlahan saat pemanasan. Perubahan warna larutan menjadi ungu pada larutan sampel
menandakan bahwa sampel tersebut terdapat kandungan asam α-amino yang bebas.
Pembentukan larutan kompleks berwarna ungu ini terjadi karena dekarboksilasi oksidatif dari
asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, NH3 dan CO2. Selain itu, terjadi reaksi antara
ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dan dengan molekul NH 3 yang
dibebaskan sehingga terbentuk kompleks berwarna ungu. Semakin pekat warna ungu yang
muncul maka jumlah asam amino bebas pada sampel semakin banyak.
1.2 Analisa Hasil
Pengujian sampel pertama dilakukan pada larutan susu skim. Setelah dilakukan
pengujian, sampel larutan susu skim berubah menjadi warna ungu yang menandakan hasil
positif mengandung asam amino bebas. Protein yang dikandung oleh susu skim paling besar
adalah kasein. Kasein mengandung semua asam-asam amino esensial. Salah satu asam amino
esensial yang terdapat di dalam susu skim adalah triptofan dan tirosin. Selain kasein terdapat
jenis protein lain yaitu albumin dan globulin. Asam amino bebas berasal dari protein albumin
yaitu glutamin dan trisin (Array, 2009).
Pengujian selanjutnya dilakukan pada sampel larutan MSG (Monosodium Glutamat).
Berdasarkan hasil pengujian, MSG menunjukkan hasil positif mengandung asam amino
bebas. Pada MSG terdapat asam amino non esensial yaitu asam glutamat. Asam glutamat
kemudian ditambah soda (Natrium karbonat) sehingga terbentuk monosodium glutamat
(MSG). Glutamat yang terdapat di dalam MSG dan yang berasal dari hidrolisa protein
tumbuhan merupakan glutamat dalam bentuk bebas. Konsumsi glutamat bebas akan
meningkatkan kadar glutamate dalam plasma darah (Loliger, 2010).
Sampel ketiga adalah aspartam. Aspartam merupakan salah satu pemanis buatan nutritif
(artificial sweetener). Terdapat 2 hasil pengujian pada aspartam. Hasil pertama menunjukkan
negatif mengandung asam amino bebas karena tidak mengalami perubahan warna. Hasil
pengujian kedua menunjukkan positif mengandung asam amino karena lautan berwarna ungu
bening. Menurut Winarno FG (2008) Aspartam tersusun dari 2 macam asam amino yaitu
asam aspartat dan fenilalanin. Gugus amina (NH2) yang bebas terdapat pada salah satu gugus
asam aspartat. Berdasarkan literatur, kebeneran pengujian terletak pada hasil yang positif.
Peluang terjadi kesalahan pengujian dapat disebabkan oleh beberapa hal seperti tidak
dilakukan pengocokan terlebih dahulu pada sampel karena sampel berbentuk suspensi, umur
simpan dari sampel dan reagen, kemurnian sampel (tidak ada kontaminasi), serta kesalahan
pelabelan pada sampel.
Sampel terakhir adalah gelatin. Sama halnya seperti aspartam, gelatin memiliki 2 hasil uji
yang berbeda. Hasil uji pertama positif mengandung asam amino bebas. Hasil uji kedua
menunjukkan sampel tidak mengalami perubahan warna secara signifikan atau dinyatakan
negatif. Warna awal berwarna bening setelah pemanasan warna bening agak kekuningan.
Gelatin tersusun atas beberapa asam amino yaitu prolin, hidroksiprolin, sistein, dan triptofan.
Pada uji ninhidrin, jika sampel mengandung asam amino prolin hasil positif ditunjukkan
dengan warna kuning bukan biru. Sehingga pada uji ninhidrin dengan sampel gelatin hasil uji
dapat berpeluang positif (Marzuki et al, 2011). Kesalahan hasil pengujian dapat disebabkan
beberapa hal seperti yang telah dijelaskan sebelumnya pada uji ninhidrin dengan aspartam.
2. Uji Biuret
a. Tuliskan data hasil uji Biuret
Sebelum ditambah
No Sampel Sesudah ditambah reagen Hasil uji
reagen
1 Susu skim Putih susu + Naoh : Kuning bening +
 + CuSO4 : Ungu di bagian atas
2 MSG Bening + Naoh : Bening -
+ CuSO4 : Bening
3 Gelatin Bening keunguan + Naoh : Bening kekuningan +
+ CuSO4 : Ungu bening
4 Aspartam Putih kapur + Naoh : Pink bening -
+ CuSO4 : Biru di bagian atas
b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Biuret dari beberapa sampel dalam percobaan ini!
Uji biuret ini adalah uji umum bagi protein dan positif untuk senyawa yang mengandung
dua atau lebih ikatan peptida. Pengujian dilakukan dengan cara menambahkan NaOH dan
CuSO4 sebagai reagen. Ion Cu2+ akan bereaksi dengan ikatan peptida dalam suasana basa
sehingga akan terbentuk kompleks berwarna ungu.
2.1 Analisa Prosedur
Langkah awal dalam melakukan pengujian adalah memasukkan sebanyak 2 ml sampel ke
dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan sebanyak 1 ml NaOH 10%. Tabung reaksi
dikocok. Penambahan NaOH yang bersifat alkali bertujuan untuk menciptakan suasana basa
pada pengujian protein. Selain itu, penambahan basa juga berfungsi untuk menjaga struktur
protein dan katalisator. Penambahan NaOH belum menentukan hasil positif atau negatif dari
sampel, karena seharusnya tidak terjadi perubahan warna pada sampel. Langkah selanjutnya
adalah menambahkan 5 tetes CuSO4 ke dalam tabung reaksi. Pada saat perubahan warna
mulai terbentuk sampel tidak perlu dilakukan pengocokan. Warna ungu akan muncul dan
menyebar jika CuSO4 bereaksi dengan ikatan peptida pada sampel. Semakin pekat warna
ungu yang muncul menandakan semakin banyak jumlah ikatan peptida pada sampel.
2.2 Analisa Hasil
Sampel pertama diujikan pada susu skim. Hasil pengujian menunjukkan susu skim positif
mengandung dua atau lebih ikatan peptida dengan perubahan warna yang awalnya berwarna
putih susu menjadi ungu pada bagian atas. Susu skim memiliki ikatan peptida didalamnya
meskipun susu skim tersusun dari asam-asam amino yang membentuk ikatan peptida yang
tidak begitu panjang. Hal tersebut sudah cukup untuk dapat diidentifikasi dengan
menggunakan uji biuret (Waluyo L, 2010).
Sampel selanjutnya adalah MSG (Monosodium Glutamat). Pada pengujian MSG
perubahan warna tidak terjadi. Warna awal sebelum ditambahkan reagen adalah bening
kemudian setelah ditambahkan reagen warna tetap bening. Menandakan MSG negatif tidak
memiliki ikatan peptida. MSG tidak memiliki ikatan peptida karena MSG merupakan garam
natrium dari asam glutamat (hanya memiliki 1 senyawa asam amino) sehingga tidak terdapat
ikatan peptida didalamnya karena tidak ada senyawa asam amino lain untuk berikatan
(Waluyo L, 2010).
Sampel ketiga diujikan pada gelatin. Hasil pengujian dinyatakan positif pada pada gelatin
karena terjadi perubahan warna dari bening menjadi ungu bening. Gelatin memiliki ikatan
peptida karena gelatin tersusun dari beberapa asam amino yaitu prolin, hidroksiprolin, sistein
dan triptofan. Pembentukan ikatan peptida terbentuk karena sifat amfoternya, maka dua
molekul asam amino atau lebih dapat bersenyawa satu sama lain (Marzuki et al, 2011).
Sampel uji biuret terakhir adalah aspartam. Hasil pengujian menunjukkan terdapat
perubahan warna dari putih kapur menjadi biru di bagian atas. Perubahan warna tersebut
dinyatakan negatif. Menurut Waluyo L (2010), aspartam merupakan bentuk metil ester dari
dipeptida dua asam amino yaitu asam amino asam aspartat dan asam amino essensial
fenilalanin yang ketika dipanaskan ikatan peptidanya putus. Warna biru yang terbentuk
sebenarnya merupakan hasil positif.

PERTANYAAN
1. Bagaimana mengidentifikasi adanya gugus amino pada sampel dengan menggunakan uji
Ninhidrin?
Reaksi ninhidrin digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asam alfa amino.
Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia sehingga terbentuk senyawa
kompleks berwarna ungu. Pada asam amino, terdapat gugus karboksil yang dapat dilepaskan
dengan proses dekarboksilasi menjadi CO2, NH3, dan aldehid (Suprapta KA, 2014)
2. Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Biuret?
Biuret akan memberi warna ungu bila direaksikan dengan larutan basa kuat yaitu
penambahan CuSO4. Perubahan warna menjadi ungu, menandakan bahwa dalam larutan
tersebut telah terbentuk senyawa kompleks. CuSO4 dalam suasana basa bereaksi dengan
senyawa yang mengandung dua atau tiga ikatan peptida. Senyawa ini terbentuk antara Cu 2+
dengan gugus C=O dan N-H dari rantai peptida (Putra AR, 2013).

KESIMPULAN

Tujuan dari uji kualitatif protein menggunakan metode ninhidrin adalah untuk
mengetahui ada tidaknya asam amino bebas pada sampel sedangkan metode biuret untuk
mengetahui ada tidaknya ikatan peptida (dua atau lebih) pada sampel. Prinsip pengujian pada
metode ninhidrin yaitu menguji sampel dengan penambahan pereaksi ninhidrin yang akan
bereaksi dengan asam amino bebas sehingga membentuk senyawa kompleks berwarna ungu
ruhemann. Pada metode biuret prinsip pengujiannya adalah dengan menambahkan NaOH
selaku katalis dan CuSO4 sebagai pereaksi. Ion Cu2+ akan bereaksi dengan ikatan peptida
dalam suasana basa sehingga terbentuk kompleks berwarna ungu violet.
Berdasarkan hasil pengujian hasil positif mengandung asam amino bebas pada uji
ninhidrin adalah sampel susu skim, MSG, dan aspartam ditandai dengan terbentuknya
kompleks warna ungu, sedangkan hasil negatif pada sampel gelatin. Pada uji biuret
berdasarkan hasil pengujian hasil positif memiliki ikatan peptida adalah sampel susu skim dan
gelatin ditandai dengan terbentuknya warna ungu, sedangkan hasil negatif pada sampel MSG
dan aspartam.

DAFTAR PUSTAKA

Almatsier, Sunita. 2009. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama
Anisa, Cut. 2007. Uji Kualitatif Protein dan Asam Amino (Uji Biuret). Banda aceh:
Universitas Unsyiah
Barokah. 2007. Pengaruh Aspartam terhadap Kadar Kreatinin Serum dan Struktur Histologis
Ren Mencit (Mus Musculus L.) Strain Swiss. Skripsi. FMIPA. Surakarta: Universitas
Sebelas Maret
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wotton M. 2009. Ilmu Pangan. Adiono, Purnomo H,
penerjemah. Jakarta (ID): UI-Press. Terjemahan dari: Food Science. ISBN 979-8034-09-0
Ilyas S. 2013. Monosodium Glutamat.
[http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/38871/4/Chapter%20ll.pdf] Dilihat
pada 4 Maret 2016
Putra, Anggi Rio. 2013. Uji Aktivitas Hemaglutinasi Lektin Biji Jatropha Multifida L pada
Penderita Kanker, Malaria, dan Demam Berdarah serta Implementasinya pada
Pembelajaran Menggunakan Video. Bengkulu: Universitas Bengkulu
Sri,S, et all. 2015. Proses Pembuatan Gelatin dari Kulit Kepala Sapi dengan Proses
Hidrolisis Menggunakan Katalis HCl. FTI Teknik Kimia. Yogyakarta: UPN Veteran
Yogyakarta
Suprapta, Kadek Anggra. 2014. Identifikasi Asam Amino Pada Albumin Telur Dan Sampel
Unknown. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha
Winarno, FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: M-Brio Press

DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN

Array. 2009. Komponen Kimia pada Susu. Jakarta: M-Brio Press
Marzuki, et al. 2011. Ekstraksi Dan Penggunaan Gelatin Dari Limbah Tulang Ikan Bandeng
(Chanos Chanos Forskal) Sebagai Emulgator Dalam Formulasi Sediaan Emulsi.
Majalah Farmasi dan Farmakologi, No. 2 (15): 63–68
Loliger, J. (2010), Function and Importance of Glutamate for Savory of Foods. The Journal of
Nutrition, 130, 915S-920S
Waluyo, L. 2010. Kimia Organik. Malang : UMM Press.

LAMPIRAN
No Keterangan Gambar
1 Sampel uji ninhidrin sebelum
penambahan reagen
2 Sampel uji ninhidrin setelah
penambahan reagen

3 Sampel uji biuret sebelum

penambahan reagen

4 Sampel uji biuret setelah

penambahan reagen