OPTIMASI METODE SPEKTROFOTOMETRI CAHAYA

TAMPAK UNTUK PENETAPAN KADAR

SULFAMETOKSAZOL DALAM PLASMA MANUSIA

DISUSUN OLEH :

Nabila Revivti 2017210149

Rahmatullah 2018212283
Citra Ayu Destari 2018212286*

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA
2020
I JUDUL PERCOBAAN

Optimasi Metode Spektrofotometri Cahaya Tampak Untuk Bioanalisis

Sulfametoksazol Dalam Plasma Darah Manusia
II TUJUAN

Mampu melakukan penentuan panjang gelombang serapan maksimum dan

waktu stabil pengukuran dalam rangka optimasi metode spektrofotometri
cahaya tampak untuk penetapan kadar sulfametoksazole dalam plasma
manusia
III TEORI

Pengembangan metode merupakan proses merancang , mencoba dan

menemukan metode analisis yang baru atau memperbaiki, meningkatkan
kinerja dan memodifikasi metode analisis yang telah ada.metode analisis
yang dikembangkan jika terpilih selanjutnya dilakukan validasi metode.
Untuk analisis rutin , secara berkala dilakukan verifikasi metode untuk
menunjukan metode telah sesuai.
Spektrofotometri merupakan salah satu metode analisis instrumental yang
menggunakan dasar interaksi energy dan materi. Spektrofotometri dapat
dipakai untuk menentukan panjang gelombang tertentu, dan panjang
gelombang yang dipakai adalah panjang gelombang maksimum yang
memberikan absorbansi maksimum. Salah satu prinsip kerja
spektrofotometri didasarkan pada fenomena penyerapan sinar oleh spese
kimia tertentu didaerah ultra violet dan sinar tampak ( visible ). Cahaya
yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang
gelombang 400-800nm dan memiliki energy sebesar 299-149 kJ/mol.
Ketika cahaya dengan berbagai panjang gelombang ( cahaya polikromatis )
mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja
yang akan diserap, electron-elektronyang dimiliki oleh suatu molekul dapat
berpindah ( eksitasi ) berputar ( rotasi ) dan bergetar ( Vibrasi ) jika dikenai
suatu energy. Jika zat menyerap cahaya tampak dan ultra violet maka akan
terjadi perpindahan electron dari keadaan dasar menuju kekeadaan
 tereksitasi ( transisi elektronomik ), apabila cahaya yang diserap adalah
cahaya inframerah maka electron yang ada dalam atom atau electron pada
suatu molekul dapatbergetar ( vibrasi). Atas dasar inilah spektrofotometri
dirancang untuk mengukur konsentrasi yang ada dalam suatu sampel.
Pada praktikum percobaan ini dilakukan optimasi metode analisis untuk
penetapan kadar sulfametoksazole dalam plasma darah manusia secara
spektrofotometri cahaya tampak. Parameter penting yang harus dioptimasi
pada bioanalisis dengan spektrofotometer cahaya tampak antara lain adalah,
penentuan panjang gelombang serapan maksimum dan waktu stabil
pengukuran larutan.

IV ALAT DAN BAHAN :

A. Bahan :
1. Sulfametoksazole
2. Plasma darah
3. Asam trikloro asetat
4. Natrium nitrit
5. Natrium hidroksida
6. Ammonium sulfamat
7. N-(naftil) etilendiamin
8. Air suling
B. Alat :
1. Spektrofotometer UV-Vis
2. Sentrifuse
3. Mikropipet.
V PROSEDUR KERJA :
A. Pembuatan Larutan Pereaksi :
1. Larutan standar sulfametoksazole 500μg/ml
Larutan standar sulfametoksazole 500μg/ml digunakan sebagai
larutan stok untuk membuat larutan sulfametoksazole dalam 500
μg/ml plasma darah ( blank plasma ) dengan konsentrasi 20,40,60
μg/mL. pembuatannya sebagai berikut:
1) Timbang seksama 50 mg sulfametoksazole, masukkan kedalam
 labu tentukur 100mL
2) Larutkan dengan larutan natrium hidroksida 0,1N sampai tanda
batas dan di homogenkan.

2. Larutan Asam Trikloroasetet 20%

1) Timbang seksama 20g asam triloroasetat (TCA) dan masukkan ke
dalam labu tentukur 100 mL
2) Larutkan dengan air sampai tanda batas dan dihomogenkan.

3. Larutan Natrium Nitrit 0,1%

1) Timbang saksama 0,1 gram natrium nitrit (NaNO2) dan masukan
ke dalam labu tentukur 100 mL
2) Larutkan dengan air sampai tanda batas dan dihomogenkan.

4. Larutan Ammonium Sulfamat 0,5%.

1) Timbang seksama 500 mg ammonium sulfamat dan masukan ke
dalam labu tentukur 100 mL
2) Larutkan dengan air samapi tanda batas dan homogenkan

5. Larutan N-(naftil) etilendiamina dihidroklorida 0,1%

1) Timbang seksama 100 mg N-(naftil) etilendiamina dihidroklorida
dan masukan ke dalam labu tentukur 100 mL
2) Larutkan dengan air sampai tanda batas dan homogenkan
3) Larutan disimpan dalam botol berwarna gelap.

6. Pembuatan plasma blangko

1) Pipet 500 μL plasma manusia dimasukan kedalam tabung reaksi.
2) Tambah 1,5 mL larutan TCA 20% dan sentrifugasi 3000 rpm
selama 5 menit.
3) Ambil 1,0 ml supernatan lalu dimasukan ke dalam tabug reaksi
lain.
 4) Kedalam tabung tambahkan 0,1mL larutan natrium nitrit 01%
melalui dinding dan diamkan 3 menit.
5) Tambahkan 0,2mL ammonium sulfamat 0,5% dan diamkan 2
menit.
6) Tambahkan 0,2 mL larutan N-(naftil) etilendiamin 0,1% dan
diamkan ditempat gelap. Tambahkan aquadest sebanyak 3,5 mL
larutan dipindahkan ke dalam kuvet dan diukur intensitas
warnanya pada spektrofotometer sebagai blangko.

B. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

1) Buat larutan sulfametoksazole dalam plasma darah ( blank plasma )
500μl dan dimasukan ke dalam tabung reaksi.
2) Tambah 1,5 mL larutan TCA 20% dan sentrifugasi 3000rpm selama 5
menit
3) Ambil 1,0 mL supernatant pada tiap konsentrasi lalu dimasukan ke
dalam tabung reaksi lain.
4) Tambahkan 0,1 mL larutan Natrium Nitrit 0,1% kedalam tabung
melalui dinding tabung dan diamkan 3 menit.
5) Tambahkan 0,2mL ammonium sulfamat 0,5% dan diamkan 2 menit.
6) Tambahkan 0,2mL larutan N-(naftil) etilendiamin 0,1% diamkan
ditempat gelap.
7) Tambahkan aquadest sebanyak 3,5 mL dan pindahkan larutan
kedalam kuvet dan diukur intensitas warnanya pada spektrofotometer.
8) Buat spectrum serapan pada panjang gelombang 400-600 nm dan
tentukan panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum.

C. Uji Waktu Stabil

Uji ini dilakukan untuk mengetahui berapa lama kestabilan dari senyawa
yang terbentuk. Penentuan waktu stabil adalah sebagai berikut :
 1) Buat larutan uji seperti pada penyiapan larutan untuk penetapan
panjang gelombang serapan maksimum yaitu pada bagian V.b.1)
sampai V.b.6).
2) Ukur serapan larutan pada panjang gelombang serapan maksimum
selama 1 jam dengan interval pengukuran 5 menit.
VI DATA PENGAMATAN :
A. Operating Time
Waktu/ menit Absorban
Seri I Seri II Seri III
5 0,8359 0,8068 0,8185
10 0,8379 0,8079 0,8160
15 0,8378 0,8085 0,8164
20 0,8385 0,8092 0,8179
25 0,8381 0,8092 0,8179
30 0,8389 0,8098 0,8188
35 0,8392 0,8102 0,8192
40 0,8396 0,8109 0,8192
45 0,8403 0,8113 0,8206
50 0,8411 0,8096 0,8224
55 0,8389 0,8081 0,8213
60 0,8381 0,8079 0,8203

B. Panjang gelombang maksimum ( λ )

Panjang gelombang maksimum ( λ) 536nm

C. Kurva Baku

C ( μg/ml ) Serapan ( A )
20 0,25115
40 0,5023
60 0,75345
VII PERHITUNGAN
A. Pembuatan larutan standar / larutan stok sulfametoksazol
1. Konsentrasi 20 bpj
V1.N1= V2.N2
V1.500μg/ml = 500 μLx 20 bpj
V1 = 20 μl
2. Konsentrasi 40 bpj
V1.N1= V2.N2
V1.500μg/ml = 500 μLx 40bpj
V1 = 40 μl
3. Konsentrasi 60 bpj
V1.N1= V2.N2
V1.500μg/ml = 500 μLx 60 bpj
V1 = 60 μl

B. Perhitungan regresi kurva baku

a=0
b = 0,01255
r=1
maka diperoleh persamaan :
y = a + bx
y = 0 + 0,01255x
C. Nilai Y setelah regresi kurva baku :
1) 20 bpj
y = 0 + 0,01255 x 20
y = 0,125
 2) 40 bpj
y = 0 + 0,01255 x 40
y = 0,502

3) 60 bpj
y = 0 + 0,01255 x 60
y = 0,753

VIII PEMBAHASAN
● Larutan Standar Sulfametoksazol 500 µg/ml digunakan sebagai
larutan stok untuk membuat larutan sulfametoksazol dalam 500 µl
plasma darah (blank plasma) dengan konsentrasi 20, 40, 60 µg/mL ,
Pembuatannya dengan Timbang saksama 50 mg sulfametoksazol,
masukkan kedalam labu tentukur 100mL dan Larutkan dengan
larutan natrium hidroksida 0,1N sampai tanda batas dan
dihomogenkan.
● Asam trikloro asetat berfungsi untuk mengendapkan protein,
sedangkan Natrium nitrit digunakan untuk pembentukan garam
diazonium. Sulfametoksazol memiliki gugus amina aromatic primer
dimana salah satu syarat diazotasi adalah memiliki rx diazotasi.
Untuk Natrium hidroksida digunakan sebagai pelarut, Ammonium
sulfamat digunakan ammonium sulfamat yang berfungsi untuk
menghilangkan HNO2 yang berlebih. Ammonium sulfamat
merupakan suatu reduktor sehingga dapat bereaksi redoks dengan
HNO2. N-(naftil) etilendiamin digunakan untuk membentuk senyawa
kopling yang memiliki gugus kromofor yang lebih panjang sehingga
dapat dideteksi dengan spektrofotometri UV-vis
● spektrometer uv vis digunakan untuk mengukur absorbansi dari
sulfametoksazol yang berada dalam larutan plasma darah, terjadinya
interaksi antara materi dan cahaya yang dipancarkan alat pada
panjang gelombang terntentu, larutan zat uji menyerap cahaya pada
 panjang gelombang yang hampir monokromatis.
● larutan blanko yang digunakan adalah plasma darah yang telah
diendapkan oleh TCA dan disentrifugasi dan diberikan 1ml larutan
natrium nitrit 1%, 0,2ml amonium sulfamat 0,5%, 0,2ml etilendiamin
dan aquadest.
● Gelombang overlay:

Chart Title
0.8
0.75
0.7
0.6
0.5 0.5
0.4
0.3
0.25
0.2
0.1
0 0 0
440 460 480 500 520 540 560 580 600 620

● Waktu stabil pengukuran larutan dalam rangka optimasi metode

spektrofotometri cahaya tampak utnuk penetapan kadar
sulfametoksazol dengan konsentrasi 60 pbj adalah 20 menit

IX KESIMPULAN
● Waktu stabil dari hasil pengukuran serapan larutan pada panjang
gelombang maksimum selama satu jam dengan interval 5 menit
menunjukkan waktu stabil di menit 20-25 dengan panjang
gelombang Seri I 0,8385, Seri II 0,8092, Seri III 0,8179 pada menit
ke 20 dan panjang gelombang seri I 0,8381, seri II 0,8092 dan seri III
0,8179 pada menit ke 25
X DAFTAR PUSTAKA
● Tim Dosen Bioanalisis 2020, Diktat Penuntun Praktikum
Bioanalisis. Jakarta. Fakukltas Farmasi Universitas Pancasila.
● Rohman A. Kromatografi Untuk Analisis Obat. Jogjakarta. Graha
Ilmu; 2009.
● Redja IW, Aziz Z, Yantih N. Analisis Instrumental. Departemen
Pendidikan Nasional Direktorat Jendral Pendidikan Menengah dan
Tinggi. 2009. Jakarta. Universitas Pancasila; 2009

Jakarta, 19 Desember 2020

Citra Ayu Destari