Tenik DNA REkombinan

Nama : Nisa Fitri Rahmadiani

NPM : 11181088
Kelas : 3FA2

1. Jelaskan komponen apa saja yang dibutuhkan dalam teknik DNA rekombinan beserta
fungsinya masing-masing
Jawab :
a. DNA donor(insert) merupakan sumber dari DNA atau gen yang digabungkan atau
disispkan atau disambungkan kepada DNA dari organisme lain
b. Sel inang (Host cell) yang umum digunakan biasanya adalah suatu bakteri atau yeast.
Tempat diintroduksikan vector rekombinanke dalam sel inang
c. Enzim Restriksi digunakan untuk memotong DNA
Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang
panjangnya 4 sampai 6 pasang basa. Bagian pada DNA yang yang dikenai aksi
pemotongan oleh enzim rstriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens
pengenal adalah urutan nukleotida(urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim
rstriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya.
d. Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA
e. Plasmid digunakan sebagai vector untuk mengklonkan gen atau mengklonkan
fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri
f. Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk
menyisipkan penanda. Transpoposon DNA adalah DNA yang dengan sendirinya
dapat berpindah-pindah tempat atau berpindah posisinya pada satu molekul DNA atau
pada satu kromosom.
g. Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah
diklonkan.
h. Enzim transkrip balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA
i. Pelacak DNA/RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang
diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar.
2. Jelaskan secara singkat tahapan dalam melakukan teknik DNA rekombinan
Jawab :

1. Isolasi sumber DNA

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target
dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa
genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen
DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak
tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap.

Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya
dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan
dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi
fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung fragment
tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara
melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang
berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat.

2. Pemotongan Gen

Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai
yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Molekul DNA rekombinan tidak
dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi
endonuklease yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA pada situs
spesifik. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat-
tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands
dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan
gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya.

Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky
end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang
sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung
kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang
tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa
nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan
dengan basa pasangannya sehingga disebut “sticky” (mudah lengket) atau kohesif.

3. Penggabungan Gen

Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA
lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan.
Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage
dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri,
yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC),
Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Ligasi berhasil
bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan yang sangat
spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung tidak
rata (sticky end), karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T
berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang
mempunyai ujung rata (blunt end) dapat disambungkan dengan sembarang fragmen DNA
lain yang berujung rata. Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang
spesifik menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak
memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata (Suharsono, 2000).

4. Penyisipan Gen ke dalam Bakteri

Penyisipan gen dapat dilakukan melalui dua cara yaitu:

 Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya
(sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel
 Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.
 Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui
perantara fage.

DNA yang masuk ke dalam bakteri dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom
bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. Adapun proses
rekombinasi DNA dari pemotongan hingga penggabungan seperti yang ditampilkan pada
gambar berikut:

5. Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target

Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target / Sel Hidup dapat dilakukan dengan tiga
cara yaitu:

 Transformasi : pengambilan DNA rekombinan dari lingkungan di sekelilingnya.

 DNA-packaging : memasukkan molekul DNA-phage ke dalam partikel phage.
 Minkroinjection : memakai jarum super kecil untuk menginjekasikan DNA rekombinan
langsung ke inti sel yang ditransformasi.

Adapun proses pemasukan DNA rekombinan ke dalam sel target, misalnya pada
tumbuhan dapat ditampilkan seperti gambar berikut: