TEKNOLOGI DNA

REKOMBINAN
Tim Pengajar Biologi Sel FFUP
Desember 2016
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN/
REKAYASA GENETIKA

Suatu metode penggabungan dua material genetik

yang berlainan atau sama menggunakan seutas
molekul DNA tunggal dengan teknik pengklonan
gen secara invitro.
 Keunggulan Teknologi DNA
Rekombinan
Teknik ini menjanjikan berbagai kemampuan yang revolusioner,
antara lain :
– Cepat
– Dapat diterapkan secara universal
– Dapat dilakukan pengendalian yang ketat terhadap proses
manipulasi
– Dapat membentuk berbagai kombinasi genetik baru yang
belum diseleksi sebelumnya dengan metode laboratorium
KLONING GEN
Perangkat Teknik DNA Rekombinan (kloning) :
• Enzim restriksi
• Vektor / wahana kloning
• Konstruksi dan pengklonan
• Sel penerima vektor (sel host)
• Fragmen DNA sisipan
 Enzim Restriksi

Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan / pemotongan DNA

di beberapa tempat / lokasi spesifik dengan jumlah yang terbatas
& dapat direproduksi.

▲ Enzim ini disebut juga dengan endonukleaserestriksi

( Russell, 1980).
▲ Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester asam
nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan target
umumnya sering muncul berkali kali.
▲ fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda dengan
sedikitnya satu ujung untai tunggal.
Enzim Restriksi terdiri dari 2 golongan

• Enzim gol 1
 Memecah DNA pada tempat yang tidak spesi-
fik, jauh dari tempat pengolahan.
 Mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik.
 Antara lain : enzim-enzim yang terlibat dalam
sistem restriksi
• Enzim gol 2
 Memecah DNA pada tempat yang spesifik.
 Telah banyak diisolasi dari mikroorganisme
(Russell, 1980).

Enzim yang pertama kali ditemukan pada tahun

1970 oleh Hamilton Smith dari Universitas John
Hopkens yaitu : Haemophyllus influenza, yang
dapat segera menguraikan
pemakan DNA asing.
Contoh:Enzim restriksi
 Wahana Kloning

• Seutas molekul DNA tunggal tempat

dilekatkannya material genetik yang kita
inginkan sebelum ditransformasikan kedalam
bakteri tertentu.

• Wahana kloning yang paling sering digunakan

adalah plasmid.
Komponen yang Harus Ada di
Plasmid Vektor Kloning
1. Ori (Origin of replication)
2. Situs pemotongan enzim restriksi (polylinker)
3. Marka Seleksi
Contoh: marka seleksi antibiotik
Fungsi plasmid :
• Mendukung replikasi
• Sebagai vektor untuk pengklonan DNa
• Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten )
– Contoh : plasmid resisten  p BR. 322.
( plasmid R.E Coli ,yaitu : plasmid yang memberi resisten
terhadap ampicilin dan tetrasiklin. )
» DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara
“melisiskan” sel bakteri dan memisahkan DNA
plasmid dari DNA kromosom.
» Plasmid p.BR.322 : merupakan suatu
determinan replikasi plasmid pMBI yang
berkaitan dengan col.E.I. gen plasmid RI ( TN3)
resisten dan gen resisten tetrasiklin plasmid pS
(101) sebagai penanda seleksi.
 PRINSIP PENGKLONAN GEN
(Teknologi DNA rekombinan) menggunakan vektor
(plasmid).

Persyaratan dasar/tahapan :
– Isolasi molekul DNA plasmid lingkar yang harus memiliki
suatu tapak, dimana integrasi DNA asing tidak merusak
fungsi yang essensial.
– Pembangkitan fragmen DNA yang cocok untuk
pengklonan melalui endonukleusrestriksi,
– Sisipan dapat berupa fragmen kromosomal dari
mikroorganisme lain ( prokariot, eukariot) dari hewan/
tumbuhan atau dari larutan DNA yang disintesis secara
kimia.
– Metode penjalinan atau penyambungan DNA asing ke
dalam vektor.
– Penggabungan rekombinan DNA hibrid ke dalam sel inang
– Ekspresi transforman yang memiliki plasmid rekombinan
 Tahapan Kloning
1. Produksi molekul DNA rekombinan
Penggabungan/penyisipan fragmen DNA
yang mengandung gen yang akan diklon ke
molekul DNA vektor (plasmid).
Melibatkan enzim restriksi dan enzim DNA
ligase.
2. Transformasi: Transport vektor/plasmid
rekombinan ke dalam sel inang (biasanya
bakteri)
3. Multiplikasi vektor rekombinan di dalam
sel inang.
4. Seiring dengan pembelahan sel inang,
molekul DNA rekombinan juga diturunkan
ke sel anakan dan kemudian
bermultiplikasi lagi.
5. Setelah sejumlah besar pembelahan sel
terjad, dihasilkan sel-sel inang yang
membawa satu atau lebih salinan molekul
DNA rekombinan. Sel ini disebut sebagai
sel klon.
6. Seleksi klon
Untuk memisahkan sel klon dari sel
nonklon (misal: dengan seleksi antibiotik)
Plasmid dan Kromosom yang mengandung gen target dipotong dengan
enzim restriksi yang sama, misal: EcoRI.
Penggabungan fragmen DNA
dengan DNA vektor/ plasmid
secara enzimatik

Enzim DNA ligase

Transformasi vektor
rekombinan ke sel host
yang sesuai
Vektor
rekombinan
bereplikasi di
dalam sel klon
dan terus
diturunkan dan
diperbanyak
seiring dengan
multiplikasi sel
klon.
Molekul DNA Rekombinan Konstruksi
dan Pengklonan

Penggabungan fragmen dengan enzim restriksi

Eco R I dengan ujung mencuat .
Pengklonan DNA Rekombinan

Proses penggabungan
plasmid rekombinan yang
mengandung gen kedalam
bakteri hidup (gen yang
telah diklon ).
Seleksi Klon DNA Rekombinan Spesifik
 Contoh Aplikasi Rekayasa Genetika

• Sebelumnya, insulin didapatkan dengan cara

memurnikan protein pankreas babi.
• Sekarang dengan tehnik kloning gen,
– yaitu : memindahkan gen insulin manusia ke dalam sel
bakteri. Dengan demikian akan didapatkan produksi insulin
dalam jumlah besar oleh bakteri.
– Cara ini lebih mudah
Penerapan Teknologi DNA Rekombinan

• Dalam industri farmasi

– Pembuatan insulin ( kloning gen ).
– Pembuatan antibiotik
– Pembuatan antibodi monoklonal
– Pembuatan interferon
– Pembuatan vaksin.
http://www.biopharma.com/approvals_2011.html
• Dalam industri makanan dan minuman
– Pembuatan makanan
• Produk pati/karbohidrat ; roti
• Produk susu : keju , kreem asam, mentega
• Dari limbah industri
– Nata decoco
– Sirup hidrolisat
– Pembuatan minuman
• Yoghurt
• Anggur
• Sider ( fermentasi sari buah apel)
• Dalam industri senyawa kimia
– Produksi pelarut dengan cara fermentasi
• Aseton
• Gliserol
• Asam laktat
• Asam sitrat
• Asam asetat
• Asam glukonat
• Asam amino