Metode HPTLC Tervalidasi untuk Pengujian Prednisolon

dalam Tablet dan Perbandingan dengan Metode Farmakope

Astha Mehta * dan Anil Thaker

Kata Kunci

HPTLC
Prednisolon
Tablet
Validasi

Ringkasan
Metode kromatografi lapis tipis berkinerja tinggi yang cepat dan andal telah ditetapkan
untuk analisis prednisolon dalam bentuk sediaan tablet. Larutan standar prednisolon
dan sampel diaplikasikan pada pelat HPTLC gel silika gel G60 F yang telah dilapisi,
dicuci sebelumnya dengan metanol, dan pelat dikembangkan
254
dengan 95: 5 ( v / v) kloroform-metanol
sebagai fase gerak. Kuantifikasi dilakukan dengan densitometri pada 250 nm. Plot
akalibrasi dibuat untuk menunjukkan ketergantungan respon (area puncak) pada
jumlah yang dikromatografi dalam kisaran 2-10 μg per pita ( r = 0,9967). Metode ini
divalidasi secara kuantitatif untuk spesifisitas, akurasi, presisi, pengulangan, dan
ketahanan untuk membuktikan kesesuaiannya untuk analisis bentuk sediaan tablet. Gambar 1

Metode ini juga dibandingkan dengan metode farmakope untuk pengujian prednisolon Struktur prednisolon.
dan hasilnya dikonfirmasi secara statistik bahwa metode tersebut dapat digunakan
sebagai pengganti metode farmakope.

Metode HPLC [2] dan UV [3] telah dilaporkan di farmakope dan literatur
berisi metode lain untuk analisis prednisolon dalam tablet dan cairan biologis
[4-7].

1. Perkenalan
Prednisolon, (11 β) - 11,17,21-trihydroxypregna-1,4-diene-3,20dione, Gambar 1, obat yang dilaporkan tidak memungkinkan analisis kuantitatif obat, dan metode
anti-alergi, anti-inflamasi glukokortikoid [1] secara luas digunakan untuk
mengobati rheumatoid arthritis dan secara umum dapat ditoleransi dengan baik.
Prinsip di balik aksinya di dalam tubuh adalah mekanisme umpan balik
negatifnya ke hipotalamus. Prednisolon merangsang korteks adrenal untuk
melepaskan glukokortikoid. Obat tersebut meniru fungsi glukokortikoid endogen
dengan menghambat edema, deposisi fibrin, pelebaran kapiler, migrasi leukosit,
proliferasi kapiler, deposisi kolagen, dan pembentukan bekas luka yang terkait
dengan peradangan yang disebabkan oleh patogen, atau rangsangan kimiawi
atau fisik. Prednisolon bahan aktif dan tabletnya resmi di USP, BP, dan IP.
Beberapa metode KLT telah dilaporkan untuk analisis kualitatif prednisolon
dan, terutama, kortikosteroid lain dalam cairan biologis [8-10]. Metode TLC
yang digunakan untuk ekstraksi sampel biologis bersifat kompleks, seperti juga
persiapan fase gerak. Metode ini digunakan sebagai dasar untuk
pengembangan metode kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (HPTLC) untuk
analisis prednisolon dalam formulasi farmasi. Hidrokortison berhubungan
dengan prednisolon dan memiliki aksi mineralokortikoid parsial yang
menyebabkan efek samping, misalnya retensi garam; karena itu levelnya kritis
dan dikontrol hingga 1%. Panjang gelombang absorbansi maksimum
hidrokortison adalah 240 nm, sangat dekat dengan prednisolon, sehingga
sangat sulit untuk mendeteksi keberadaannya dalam formulasi prednisolon
dengan menggunakan metode UV. Estimasi kadar hidrokortison dalam tablet
prednisolon dengan HPLC terlalu memakan waktu dan rumit untuk penerapan
metode ini pada sejumlah besar batch. Jadi untuk pengujian formulasi, penting
untuk memisahkan keduanya dan untuk mengatasi kelemahan metode lain
yang dilaporkan untuk pengujian.

A. Mehta, Departemen Kimia Farmasi, Sekolah Farmasi dan Manajemen Teknologi, Universitas
NMIMS, Vile Parle-W Mumbai-400056, India; dan A. Thaker, Departemen Jaminan Kualitas,
Sekolah Farmasi dan Manajemen Teknologi, Universitas NMIMS, Vile Parle-W, Mumbai-400056, Dalam makalah ini kami melaporkan pengembangan dan validasi metode HPTLC
India.
yang cepat, sederhana, spesifik, sensitif, akurat, dan tepat untuk analisis
E-mail: astha2212@gmail.com prednisolon dalam bentuk sediaan tablet.

208 Jurnal 0933-4173

Kromatografi Planar 23 (2010) 3, 208-211
/ $ 20.00 © Akadémiai Kiadó, Budapest
DOI: 10.1556 / JPC.23.2010.3.8

Gambar 2
Densitogram khas diperoleh dari standar prednisolon.
Gambar 3
Densitogram khas diperoleh dari standar prednisolon yang dibubuhi hidrokortison zat
terkait.
2. Percobaan
2.1 Bahan Kimia, Bahan, dan Larutan
Standar kerja prednisolon dan hidrokortison, plasebo tablet prednisolon, dan
tablet prednisolon (5 mg BP; LPC Medical, Inggris) adalah hadiah murah hati
dari Rusan Pharmaceutical, Mumbai, India. Kloroform kadar AR dan metanol
kadar HPLC berasal dari Merck, Mumbai, India.
Standar kerja prednisolon (25 mg) ditimbang secara akurat, dipindahkan ke
labu ukur 25 mL, dilarutkan dalam metanol, dan diencerkan hingga volume
menghasilkan larutan stok 1 mg mL. –1. Larutan stok ini (5 mL) selanjutnya
diencerkan menjadi 10 mL dengan metanol untuk memberikan standar kerja
0,5 μg μL. –1.
Larutan ini (10 μL) diaplikasikan pada pelat untuk menghasilkan 5 μg per pita.
2.2 Persiapan Sampel
Dua puluh tablet dihancurkan dan digiling menjadi bubuk halus. Massa bubuk
yang setara dengan 5 mg prednisolon dipindahkan ke labu ukur 10 mL dan obat
diekstraksi dengan 5-8 mL metanol dengan bantuan sonikasi selama 15 menit.
Volume akhir diencerkan menjadi 10 mL dengan metanol untuk menghasilkan
larutan sampel yang mengandung 0,5 μg μL –1 prednisolon. Larutan standar kerja
konsentrasi 0,5 μg μL –1 dan larutan sampel (masing-masing 10 μL) dianalisis
dengan HPTLC.
2.3 Kromatografi
HPTLC dilakukan pada pelat aluminium foilback 20 cm x 20 cm yang dilapisi
dengan 0,2 mm lapisan silika gel 60 F 254
Jurnal Kromatografi Planar 23 (2010) 3
Uji Prednisolon dalam Tablet
(E. Merck, Darmstadt, Jerman). Sebelum digunakan, pelat dicuci terlebih dahulu
dengan metanol. Sampel diaplikasikan pada pelat sebagai pita 5-mm, terpisah 5
mm, dengan menggunakan aplikator sampel Desaga (Wiesloch, Jerman) AS 30;
laju penyemprotan adalah 7 s μL –1. Pelat dikembangkan hingga jarak 7,5 cm dari
tepi bawah pelat, dengan 95: 5 ( v / v) kloroform- metanol sebagai fase gerak,
dalam ruang pengembangan palung kembar yang sebelumnya dijenuhkan
dengan uap fase gerak selama 30 menit. Setelah pengembangan pelat
dikeringkan dan kemudian dipindai pada 250 nm, panjang gelombang
penyerapan prednisolon maksimum dan di mana pengotor hidrokortison juga
terdeteksi, dengan menggunakan densitometer Desaga CD 60 dengan perangkat
lunak Proquant (versi 1.3) dan perangkat lunak browser zoom. Dimensi celah
adalah 4,0 mm x 1,0 mm. Area puncak digunakan untuk perhitungan.
2.4 Validasi Metode
Metode ini divalidasi untuk linieritas, spesifisitas, akurasi, presisi intra-hari
dan antar-hari, reproduktifitas aplikasi sampel, ketahanan, dan stabilitas
dalam larutan. Batas kuantifikasi dan deteksi prednisolon juga ditentukan.
Untuk mengukur linieritas respon detektor larutan prednisolon konsentrasi 1
μg μL –1 disiapkan dan digunakan untuk mengaplikasikan 2-10 μg per pita ke
piring (dengan memvariasikan volume yang diterapkan). Pengukuran
fotometrik dilakukan dan area puncak setiap pita dicatat. Kekhususan
metode diperiksa dengan kromatografi standar kerja, plasebo, zat terkait
(hidrokortison), dan larutan sampel prednisolon yang diekstraksi dari tablet.
Akurasi metode dievaluasi dengan pengukuran pemulihan. Jumlah standar
obat yang diketahui ditambahkan ke tablet plasebo pada tiga tingkat yang
berbeda,
80, 100, dan 120% dari jumlah yang ada di tablet. Sampel diekstraksi, ekstrak dikromatografi, dan
perolehan rata-rata dihitung. Presisi intra-hari ditentukan dengan menganalisis standar
prednisolon dan enam larutan sampel dengan konsentrasi 5 μg per pita pada hari yang sama.
Presisi antar hari ditentukan dengan menganalisis standar dan enam larutan sampel pada hari
berikutnya. Reproduksibilitas aplikasi sampel dinilai dengan aplikasi 10 μL larutan standar
prednisolon ke piring, mengembangkan pelat, memindai bintik prednisolon, dan menghitung
deviasi standar relatif (RSD,%) untuk pengukuran luas puncak. Kekokohan metode ini diperiksa
dengan melihat standar dan larutan sampel pada pelat dan mengembangkan pelat setelah sedikit
mengubah kondisi. Kondisi yang berubah adalah rasio kloroform terhadap metanol pada fase
gerak (dari 95: 5 menjadi 97: 3 dan 93: 7), lebar pita (dari 5 mm menjadi 6 atau 7 mm), dan
panjang gelombang deteksi (dari 250 nm hingga 260 atau 240 nm). Kestabilan larutan diuji
dengan menganalisis larutan sampel pada awalnya dan kemudian larutan yang sama setelah 8
jam, dibandingkan dengan larutan standar yang baru disiapkan. Batas deteksi dan batas
kuantifikasi diperkirakan dengan inspeksi visual dan berdasarkan deviasi standar respons dan
kemiringan plot kalibrasi. dibandingkan dengan larutan standar yang baru disiapkan. Batas deteksi
dan batas kuantifikasi diperkirakan dengan inspeksi visual dan berdasarkan deviasi standar
respons dan kemiringan plot kalibrasi. dibandingkan dengan larutan standar yang baru disiapkan.
Batas deteksi dan batas kuantifikasi diperkirakan dengan inspeksi visual dan berdasarkan deviasi
standar respons dan kemiringan plot kalibrasi.
2.5 Perbandingan dengan Metode Farmakope
Saat mengembangkan metode analisis baru, diharapkan untuk membandingkan
hasil dari metode baru dengan hasil dari metode yang diterima. Metode statistik
dapat digunakan untuk memeriksa
209
Uji Prednisolon dalam Tablet

Tabel 1 Tabel 3

Analisis prednisolon dalam bentuk sediaan tablet. Data validasi metode.

Klaim label [mg] 5 Rentang linier [μg per band] 2–10

Jumlah yang ditemukan ± SD Sebuah) [ mg] Uji 4,92 ± 0,12 Koefisien korelasi 0,9969

± SD Sebuah) [%] 98.61 ± 2.1 Batasan deteksi 0,2 μg per tempat

CV [%] 2.14 Batas penghitungan 0,6 μg per tempat

Sebuah) Nilai rata-rata ± deviasi standar ( n = 10) Ketepatan 100,02%

Presisi (RSD, [%])

Pengulangan 0.74
Meja 2
Antar hari ( n = 6) 2.6
Akurasi metode HPTLC untuk prednisolon (label klaim 5 mg per tablet).
Intra-hari ( n = 12) 2.7

Kekokohan (RSD, [%])

Jumlah ditambahkan ke plasebo [%] 80 100 120

Jumlah pulih [mg] Sebuah) Perubahan fase gerak

3.9 5.1 6.0
(kloroform-metanol 93:07, 95: 5, 97: 3) 0,5
Pemulihan [%] ± SD 98,3 ± 5,2 101,3 ± 6,6 100,5 ± 7,5
Perubahan lebar pita (± 1 mm) Perubahan 1.00
RSD [%] 0.31 0.30 0.29
panjang gelombang (± 10 nm) Stabilitas 96–90%
Sebuah) Setiap pembacaan adalah mean dari analisis rangkap tiga
solusi (RSD, [%]) Kekhususan 1.1

Spesifik

apakah satu rangkaian hasil berbeda secara signifikan dari yang lain. Itu F tes
mengevaluasi perbedaan antara penyebaran hasil dan t tes mengevaluasi
perbedaan antara sarana [11]. Larutan standar dan sampel dianalisis dengan Tabel 4

metode HPTLC dan metode yang direkomendasikan dalam BP (metode Hasil analisis diperoleh dari sepuluh tablet dengan tiga metode.
HPLC) dan IP (metode UV). Sepuluh tablet individu diekstraksi dan dianalisis
dalam rangkap dua. Tidak. Kandungan [%] Kandungan [%] Kandungan [%]

dengan HPTLC oleh HPLC (BP) oleh UV (IP)

1 96.22 96.01 96.09

2 100.40 99.21 100.65

3. Hasil dan Pembahasan
3 99.71 98.72 100.07

Survei literatur menunjukkan berbagai metode telah dilaporkan untuk analisis 4 97.42 96.69 97.90
prednisolon. Kebanyakan adalah metode HPLC atau UV, yang canggih, mahal, 5 96.55 95.92 97.03
dan memakan waktu. Metode KLT dan HPTLC yang dilaporkan adalah untuk
6 98.44 99.71 99.01
identifikasi tetapi tidak digunakan untuk estimasi kuantitatif dari formulasi. Oleh
karena itu diputuskan untuk menetapkan metode analisis prednisolon 7 102.68 101.19 102.49

menggunakan HPTLC, teknik serbaguna, cepat, dan hemat biaya. 8 100.42 100.37 100.65

9 96.85 95.96 96.50

10 97.46 100.04 97.63

Karena prednisolon mudah larut dalam metanol, bubuk tablet diekstraksi
Rata-rata 98.62 98.38 98.80
dengan pelarut ini. Sonikasi matriks sampel selama 15 menit membantu
mengekstrak prednisolon sepenuhnya. Fase seluler 95: 5 ( v / v) kloroform-metanolRSD 2.1 2.0 2.1

menghasilkan
migrasi prednisolon yang optimal ( R F 0,53 ± 0,02, Gambar 2)
dan resolusi obat dari zat hidrokorsium terkait
tanpa gangguan dari komponen lain dari matriks formulasi (eksipien). Ketika
ficient dari 0.9969. Batas deteksi dan batas kuantifikasi masing-masing adalah
kelebihan hidrokortison ditambahkan ke larutan sampel untuk memeriksa
0,2 μg per pita dan 0,6 μg per pita. Pemulihan rata-rata, dihitung setelah
spesifisitas metode kromatogram menunjukkan resolusi puncak obat dari
penggunaan faktor pengenceran yang sesuai, adalah 100,02% ( Meja 2). Koefisien
puncak zat terkait adalah 1,52 ( Gambar 3). Jumlah prednisolon dalam
variasi intra-day dan inter-day adalah 2,7% dan 2,6%. Nilai rendah seperti itu
formulasi tablet dihitung dengan menerapkan faktor pengenceran yang
menunjukkan bahwa metode tersebut tepat. RSD untuk pengulangan
sesuai dan membandingkan luas puncak larutan standar dan sampel. Uji
pengukuran luas puncak adalah 0,74%. Ini jauh di bawah spesifikasi pemindai,
prednisolon dalam formulasi tablet, dengan pengukuran luas puncak,
dan dengan demikian menunjukkan bahwa pemindai berfungsi dengan benar.
ditemukan 98,61 ± 2,1% ( Tabel 1).
Pengujian kekokohan metode dengan mengubah komposisi fase gerak dan lebar
pita RSD hasil pengujian adalah 0,52 dan 1,00%. Mengubah panjang gelombang
sebesar ± 10 nm menghasilkan hasil assay mulai dari 96 hingga 90%.
Respon terhadap standar prednisolon adalah fungsi linier dari jumlah dalam kisaran
2 hingga 10 μg per pita, dengan koefisien korelasi-

210 Jurnal Kromatografi Planar 23 (2010) 3

 Uji Prednisolon dalam Tablet

Tabel 5

Hasil dari F dan t tes.

metode F uji t uji

F dihitung F ditabulasi (keyakinan 95%) T dihitung T tabulasi (keyakinan 95%)

HPTLC dibandingkan dengan HPTLC UV 1.00029 3.18 0.1960 2.086

dibandingkan dengan HPLC 1.06680 3.18 0.2508 2.086

Karena hasil robustness yang diperoleh masih dalam batas penerimaan 3% RSD,
maka metode ini robust untuk perubahan kecil pada kondisi metode. Ketika
stabilitas larutan diuji pada awalnya dan setelah 8 jam, hasil pengujian
masing-masing adalah 101,7% dan
100,1%. Hasil ini menunjukkan obat stabil dalam larutan yang digunakan untuk analisis.
Referensi
[1] KD Tripathi, Penting dari Farmakologi Obat. Edisi ke-4,
Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd., NewDelhi, 1991, 291.
[2] Farmakope Inggris, Vol. II, HMSO, Cambridge, Internasional
edn., 2002, hal 1801.

Telah diamati bahwa eksipien yang ada dalam formulasi tidak mengganggu
puncak prednisolon. Resolusi antara zat terkait dan obat adalah 1,52 ketika
hidrokortison ditambahkan ke preparasi sampel. Data validasi yang berbeda
[12] untuk metode tersebut telah diringkas dalam Tabel 3.
[3] Farmakope India, Vol. III, New Delhi, 2007, hal 1582.
[4] JQ Rose, AM Yurchak, WJ Jusko, J. Pharmacokin. Biofarm. 9
(1981) 389–417.
[5] KB Petersen, WJ Jusko, M. Rasmussen, K. Schmiegelow, Kanker
Chemother. Pharmacol. 51 ( 2003) 465–473.

[6] SMH Al-Habet, HJ Lee, J. Pharm. Sci. 78 ( 1989) 105–108.

Metode tersebut ternyata cepat, sederhana, spesifik, sensitif, tepat, akurat dan
kuat. Jika dibandingkan dengan metode farmakope yang direkomendasikan [7] U. Turpeinen, H. Markkanen, M. Valimaki, U.-H. Stenman, Clin.

untuk tablet prednisolon, hasil yang sama diperoleh untuk sepuluh tablet ( Tabel Chem. 43 ( 1997) 1386–1391.

4). Hasilnya dievaluasi secara statistik oleh kami F dan t tes dan ditemukan
lulus kriteria bahwa nilai yang dihitung harus kurang dari nilai tabulasi ( Tabel 5).
Dengan demikian dipastikan metode tersebut dapat digunakan sebagai
pengganti metode farmakope untuk mendapatkan hasil pengujian dan
keseragaman konten, dan dapat digunakan untuk analisis kontrol kualitas rutin
prednisolon dari tablet.
[8] KE Vanoosthuyze, LSG Van Poucke, ACA Deloof, Anal.
Chim. Acta 275 ( 1993) 177–182.
[9] SMH Al-Habet, HJ Rogers, J. Pharm. Sci. 78 ( 1989) 660–666. [10] SMH Al-Habet,
HJ Rogers, J. Clin. Pharm. 27 ( 1989) 285–290. [11] R. Klaus, W. Fischer, HEHauck, Kromatografi
39 ( 1994) 97–102.

[12] Pedoman ICH / CGMP Q2 (R1), Validasi Proses Analitis-

Tanggal: Teks dan Metodologi, Jenewa, 1996.

Ms menerima: 19 Maret 2009

Diterima: 18 November 2009

Jurnal Kromatografi Planar 23 (2010) 3 211