Nama : Dea Aulia Frazha

Nim : 1807025014
Tugas : Fisiologi Genetika

Plasmid

Plasmid adalah komponen stabil dan berada di luar kromosom sebagai unit replikasi
otonom. Dalam definisi tertentu, plasmid adalah parasit obligat yang sangat efektif yang
hanya terdiri dari molekul DNA beruntai ganda. DNA biasanya tidak selalu bulat (bentuk
linier ada pada spesies Borrelia dan Streptomyces). Ukuran plasmidnya kecil (2 ± 3kb) dan
ada pula yang sangat besar (> 500kb). Terkadang plasmid besar dapat membawa gen yang
hampir sama banyaknya dengan kromosom bakteri kecil. Plasmid biasanya berukuran
besar, dan ketika mereka memiliki gen seperti gen RNA ribosom yang diperlukan untuk
pertumbuhan normal pada inang, mereka dianggap sebagai kromosom. Inang plasmid
biasanya memiliki sel tunggal, seperti bakteri, archaea, dan ragi. Sel inang berperan dalam
replikasi, transkripsi, dan terjemahan yang diperlukan untuk mempertahankan plasmid.
Inang dari plasmid biasanya merupakan organisme bersel tunggal, seperti bakteri,
ragi, dan archaea. Sel inang ini menyediakan mesin replikasi, transkripsi, dan terjemahan
yang diperlukan untuk pemeliharaan plasmid. Plasmid mengandung asal replikasinya
sendiri, gen yang bertanggung jawab untuk menarik protein replikasi inang ke asal plasmid,
dan gen yang dapat memastikan pemeliharaan yang stabil dalam beberapa kasus.
Kebanyakan plasmid muncul sebagai satu unit replikasi (replikasi). Selain asal
replikasi, plasmid biasanya juga membawa gen penyandi asal replikasi protein yang disebut
protein Rep. Protein ini berinteraksi dengan protein inang untuk memuat sistem ekstensi
replikasi inang ke DNA plasmid. Setelah protein diunggah, proses sintesis DNA seperti
yang dijelaskan dalam kromosom bakteri. Meskipun permulaan replikasi dapat menjadi
rumit (beberapa plasmid besar yang mengkode helikase dan hingga tiga protein Rep),
hanya dua protokol umum yang diperlukan untuk menjelaskan sebagian besar replikasi
plasmid. Satu disebut replikasi theta, dan yang lainnya disebut replikasi loop bergulir.
Dalam mode penyalinan cache, ada banyak varian, beberapa di antaranya telah dipelajari
dengan lebih baik. Dalam mode replikasi theta (Gambar 1), untai DNA direplikasi melalui
sintesis untai kontinu (pemimpin)., sedangkan replikasi untai kedua terjadi dengan sintesis
untai terputus-putus (tertinggal), seperti replikasi kromosom.

Gambar 1. Theta replication

Kemajuan ilmiah sangat sedikit, misalnya dalam pengembangan manipulasi DNA
dan teknologi rekayasa genetika, hanya sedikit potensi risiko yang diantisipasi secara hati-
hati. Namun, ironisnya adalah bahwa setelah 18 tahun, meskipun sebagian besar manipulasi
DNA termasuk dalam kategori risiko nol atau risiko rendah, ketakutan publik tidak hilang.
Komunitas ilmiah hanya memiliki sifat mengeksploitasi sifat ini, sebagian, secara spesifik.
Data tersebut dapat mendukung pandangan berikut: rekayasa genetika aman.
Organisme dapat diubah dengan menata ulang atau menghapus materi genetik asli
atau dengan memasukkan DNA heterolog atau asing dari spesies lain. Gen asing dapat
dimasukkan ke dalam kromosom penerima atau inang, dan strain dapat dipertahankan
secara stabil, yaitu gen direplikasi sebagai komponen dari kromosom inang, sehingga kedua
sel anak mewarisi salinan gen tersebut di setiap siklus pembelahan sel. .
Rekayasa genetika telah dibangun di sekitar proses kloning gen, yang pada dasarnya
merupakan metode untuk memperoleh sejumlah besar fragmen DNA tertentu. Kloning gen
melibatkan pemotongan molekul DNA di situs tertentu, memisahkan fragmen secara fisik,
dan kemudian menyalin fragmen yang disimpan dalam cache beberapa kali dengan
mereplikasi di mikroorganisme yang sedang tumbuh. Plasmid bertindak sebagai vektor
untuk fragmen DNA. Pusat plastik kecil mudah dipotong di lokasi tertentu di mana fragmen
DNA asing dapat dimasukkan. Setelah loop dibentuk kembali dengan menggabungkan
ujung loop, chimera yang mengandung plasmid dan DNA asing dimasukkan ke dalam sel
bakteri, biasanya E. coli. Gen resistensi antibiotik pada plasmid memudahkan untuk
memperoleh sel pembawa plasmid (transforman) dengan cara menyebarkan sel bakteri pada
agar yang mengandung antibiotik membentuk koloni. Alat replikasi plasmid terletak di
chimera, sehingga saat koloni tumbuh, banyak salinan gen kloning diproduksi di dalam
bakteri. Metode biokimia kemudian digunakan untuk mengidentifikasi koloni yang
mengandung fragmen yang diinginkan, dan koloni tersebut ditumbuhkan sebagai kultur
murni untuk mendapatkan sel dalam jumlah besar. Plasmid yang diisolasi dari sel-sel ini
membawa fragmen yang diinginkan. Setelah DNA plasmid diisolasi, fragmen yang
diinginkan dapat dipotong dengan memotong dengan endonuklease restriksi, dan kemudian
dimurnikan untuk digunakan dalam berbagai penelitian.
Selama proses replikasi, dibandingkan dengan DNA sirkuler tertutup kovalen, setiap
molekul DNA linier menghadapi masalah yang cukup serius, sehingga diperlukan
mekanisme khusus untuk menghindari pemendekan bertahap pada setiap loop replikasi.
Pada eukariota, ribonukleotida telomerase mencegah pemendekan kromosom, dan enzim
mengkompensasi reduksi akhir dengan menambahkan motif urutan pendek (pengulangan
telemetri) ke ujung kromosom. Pengaturan tersebut memungkinkan tampilan DNA
telemetri disimpan dalam batas yang telah ditentukan. Replikasi DNA dapat diakhiri
dengan penyelarasan sederhana, dan ujung 3 'dan 5 dapat digabungkan setelah menyalin
stempel melingkar. Namun, penghentian replikasi theta juga dapat melibatkan sinyal
penghentian replikasi, mirip dengan sinyal terminasi replikasi yang ditemukan di garpu
replikasi kromosom bakteri, yang diblokir di ujungnya oleh protein pengikat ujung spesifik
dengan aktivitas anti-helikase di kedua arah. Penyelesaian proses replikasi juga
membutuhkan resolusi dari molekul anak yang terkait dengan topoisomerase, mungkin
DNA topoisomerase IV.
Dalam replikasi lingkaran bergulir (Gambar 2), dua rantai plasmid disintesis secara
asinkron, menggunakan urutan awal dan mekanisme awal yang berbeda. Protein promotor
(Rep) yang dikodekan oleh plasmid mengikat awal untai ganda dan menimbulkan celah di
situs tertentu. Nick menghasilkan 3-hydroxy terminus, yang kemudian digunakan sebagai
primer untuk sintesis DNA. Helikase yang dikodekan inang mungkin diperlukan untuk
mengubah kompleks awal menjadi bentuk di mana DNA polimerase III dapat digunakan
untuk sintesis DNA.

Gambar 2. Replikasi Lingkaran Bergulir

DNA dari strain yang mengandung plasmid diekstraksi, dan DNA plasmid dipisahkan
dan dimurnikan dari DNA kromosom. Seperti kromosom bakteri, plasmid yang berasal dari
bakteri biasanya tertutup secara kovalen dalam molekul DNA untai ganda melingkar, tetapi
jika plasmid mengandung lokasi target enzim yang unik (situs kloning), asam nukleat
restriksi tipe II Dicer dipotong menjadi benang. Endonuklease restriksi biasanya memotong
DNA untai ganda secara asimetris, menghasilkan molekul plasmid linier dengan ujung
lengket, yang merupakan sekuens untai tunggal komplementer pendek di setiap ujung
molekul.

A. Plasmid Linear
Plasmid linier dengan polipeptida terlampir 5 ' Plasmid DNA dengan protein terkait
secara kovalen. Akhir 5 merupakan kelompok ekstrakromosom terbesar elemen
linier. Seiring dengan virus yang memiliki struktur genom linier serupa dan dengan
transposon mereka juga dikenal sebagai invertrons. Linear Plasmid jenis ini ada pada
bakteri, khususnya di Actinomycetes; pada tumbuhan dan jamur tempat mereka berada
organel, biasanya di mitokondria. Plasmid linier ragi, bagaimanapun, terletak di sitoplasma.
Sebuah plasmid DNA dengan lima protein yang terhubung secara kovalen di
ujungnya merupakan kelompok terbesar dari elemen linier ekstrachromosomal. Pada saat
yang sama, virus dengan genom linier struktural serupa dan transposonnya juga disebut
invetron. Jenis plasmid linier ini ditemukan pada bakteri, terutama aktinomiset, tumbuhan
dan jamur, dan biasanya terletak di organel mitokondria. Gambar di bawah ini adalah
diagram skema seleksi plasmid linier dengan 5 protein lampiran

Gambar.3 Representasi skematis dari seleksi linier 5 protein terlampir

Dalam kloning DNA, vektor umum berperan dalam menginduksi transkripsi dan
translasi sisipan, dan klon rekombinan yang mengandung kerangka pembacaan terbuka atau
DNA berulang dapat dipilih. Sebaliknya, transkripsi dari promotor kloning dapat membuat
plasmid tidak stabil. Oleh karena itu, vektor kloning dalam E. coli baru yang disebut vektor
"pJAAZ" dipertahankan sebagai plasmid linier. Diagram kultur sekuens menunjukkan
bahwa kondisi yang telah dirancang sebelumnya digunakan untuk menstabilkan sisipan
CGG dalam vektor pJAZZ, sehingga memaksimalkan kemungkinan penataan ulang dan
bahkan penghapusan.
 Sebuah survei terbaru dari plasmid di antara 1800 strain ragi mencakup sekitar 600
spesies mengungkapkan DNA linier. Plasmid dapat ditemukan pada frekuensi sekitar 1% ±
2%. Plasmid linier berbeda dari ragi semua plasmid eukariotik lainnya dalam beberapa
aspek. Mereka terletak di sitoplasma dan menyandikan protein tambahan selain DNA dan
RNA polimerase yang mirip virus; bulu- thermore, beberapa memberikan fenotipe yang
menguntungkan tuan rumah mereka

Gambar.4 Pemilihan plasmid linier mikroba dengan 5’ protein terlampir

B. Plasmid Rekombinan
Sebuah mikroorganisme hasil rekayasa genetika (GEM), sekarang biasanya dikenal
sebagai genetik mikroorganisme yang dimodifikasi (GMO), didefinisikan oleh Komisi
Eropa (EC) sebagai mikroorganisme yang materi genetiknya telah diubah dengan cara yang
tidak terjadi secara alami dengan kawin atau rekombinasi alami. Suatu organisme mungkin
diubah dengan mengatur ulang atau menghapus materi genetik asli atau dengan
memasukkan heterologous, atau asing, DNA dari spesies lain. Gen asing mungkin
dimasukkan ke dalam kromosom penerima, atau 'inang', regangan di tempat yang stabil
terawatt artinya, gen tersebut direplikasi sebagai bagian integral dari kromosom inang jadi
bahwa satu salinan gen diwarisi oleh kedua sel anak di setiap putaran sel divisi. Namun,
karena sejumlah alasan, gen asing biasanya diperkenalkan ke inang sebagai komponen
plasmid multikopi.
Plasmid mereplikasi secara otonom, elemen genetik ekstrachromosomal, misalnya
molekul DNA yang mengandung asal replikasi) yang terjadi secara alami di sebagian besar,
jika tidak semua, spesies mikroba. Plasmid alami dapat berukuran mulai dari 2kb hingga
lebih dari 100 kb. Jumlah salinan molekul plasmid di setiap sel (salinan number) adalah
karakteristik dari plasmid, meskipun dapat bervariasi dari satu host ke host lain dan menjadi
dimodifikasi oleh perubahan lingkungan (lihat bagian 5.1.2), dan berkisar dari satu hingga
beberapa ratus. Secara umum, plasmid besar memiliki jumlah salinan yang rendah
sedangkan yang kecil plasmid memiliki nomor salinan yang tinggi. Strain inang bisa lebih
banyak mengandung dari satu jenis plasmid, asalkan plasmid tersebut kompatibel. Plasmid
itu memiliki struktur yang sangat mirip biasanya tidak dapat ditampung dalam host yang
sama dan mereka kemudian disebut sebagai milik grup ketidakcocokan yang sama.
Sedikit yang diketahui tentang fungsi atau evolusi plasmid di alam, kecuali itu banyak
dari plasmid yang telah diisolasi dan dikarakterisasi dari berbagai macam spesies
mengandung gen untuk enzim yang menonaktifkan, atau menetralkan, antibiotic atau
melindungi inang dari efek racun logam berat (Silver dan Misra, 1988). Plasmid ini
memberikan keuntungan bagi tuan rumah ketegangan, memungkinkan pertumbuhan di
lingkungan yang merugikan. Namun, apapun keuntungan mereka dapat memberikan inang
alami mereka, plasmid telah terbukti sangat bermanfaat bagi ilmuwan dan ahli bioteknologi
sebagai vektor untuk memasukkan DNA asing ke dalam bakteri dan mikroorganisme
lainnya.
C. Konstruksi Plasmid Rekombinan
Pada tahun 1973, Cohen et al. menerbitkan makalah mereka yang sekarang terkenal
di mana mereka menggambarkan penautan. Fragmen DNA ke replikon plasmid bakteri dan
selanjutnya memasukkan komposit, chimeric, molekul menjadi Escherichia coli melalui
transformasi. Walaupun intervensi selama 19 tahun telah melihat sejumlah besar
perkembangan dalam manipulasi DNA teknologi, metode yang Cohen et al. uraikan dalam
tulisan ini masih intinya teknik standar yang digunakan untuk transfer gen.
DNA dari strain yang mengandung plasmid diekstraksi dan DNA plasmid diambil
dipisahkan dari DNA kromosom dan dimurnikan. Seperti kromosom bakteri, plasmid asal
bakteri biasanya tertutup secara kovalen melingkar untai ganda. Molekul DNA tetapi dapat
dilinierisasi dengan memotong dengan batasan Tipe II endonuclease. Jika plasmid berisi
satu situs target unik untuk itu enzim (situs kloning). Batasan endonuklease biasanya
memotong untai ganda DNA asimetris, sehingga menghasilkan molekul plasmid linier
dengan ujung lengket, yaitu urutan untai tunggal komplementer pendek di setiap ujung
molekul.DNA yang akan dimasukkan juga dirawat dengan endonuklease yang
menghasilkan fragmen dengan ujung lengket serupa, sehingga ketika plasmid dan sisipan
DNA bercampur di bawah kondisi yang sesuai, anil terjadi antara urutan komplementer.
Enzim ligase digunakan untuk membentuk ikatan kovalen antar sisipan dan DNA vektor.

D. Penggunaan Plasmid Rekombinan

Sampai saat ini, manfaat terbesar dari DNA rekombinan (r-DNA) telah bertambah
penelitian dan Pengembangan. Dengan menggunakan kosmid, plasmid mengandung
bakteriofag, yang dapat mempertahankan sisipan DNA yang sangat besar, sekarang
memungkinkan untuk mengkloning seluruh genom organisme kompleks dalam satu
populasi bakteri. Pembentukan 'gen tersebut perpustakaan 'untuk sejumlah organisme telah
mengizinkan pengurutan keseluruhan genom dari beberapa plasmid, virus dan organel dan
sekuensing kromosom E. coli, jamur dan organisme yang lebih kompleks, termasuk
manusia, sedang berlangsung.
 Kloning gen memberikan pendekatan yang relatif sederhana untuk membentuk asam
amino urutan hampir semua protein. Reaksi berantai polimerase memungkinkan untuk
membuat salinan cDNA dari gen apa pun, bahkan yang diekspresikan di tingkat paling
rendah di jaringan asalnya atau untuk 'berjalan' di sepanjang kromosom dari satu gen ke
gen berikutnya. Begitu sebuah gen diklon pada plasmid multikopi, itu bisa urutan dan
urutan basa dengan jelas menetapkan urutan asam amino dari produk terjemahan. Selain
itu, fasilitas produksi dalam jumlah relatif banyak dari hampir semua protein, yang berasal
dari prokariotik atau eukariotik, telah menjadi mungkin dengan cepat kemajuan dalam
pengetahuan kita tentang struktur dan fungsi protein dan membuka jalan untuk petualangan
dalam rekayasa protein.
Sebaliknya, kloning gen, dalam kombinasi dengan teknik im-munokimia, sekuensing
peptida dan sintesis oligonukleotida, sekarang mengizinkan isolasi dan identifikasi gen
untuk setiap protein yang dapat disiapkan di bentuk yang relatif murni. Kemampuan untuk
mengurutkan gen dan elemen kontrol yang berdekatan juga berkontribusi sangat memahami
pemahaman kita tentang mekanisme yang mengatur ekspresi gen, dan vektor kloning telah
dirancang khusus untuk mempelajari karakteristik elemen kontrol seperti promotor, sinyal
inisiasi terjemahan, terminator transkripsi dan situs pengikatan modulator lainnya.

E. Vektor Plasmid Linear

Urutan genom yang hampir lengkap tersedia untuk lebih 1300 eukariotik dan 4400
organisme prokariotik. Generasi selanjutnya teknologi pengurutan berkembang pesat ini
database, tanpa perlu membangun DNA genom perpustakaan. Namun, kloning dan
konstruksi perpustakaan masih penting untuk perakitan genom novel de novo dan untuk
penutupan celah genom yang lebih besar. Tepat kloning juga penting untuk analisis
fungsional gen yang sepenuhnya baru. Sayangnya, banyak daerah pengkodean yang
diurutkan sebagai serta celah di majelis sulit untuk ditangkap plasmid melingkar
konvensional. Misalnya, selesai genom manusia mengandung setidaknya 241 celah di
dalam urutan euchromatic, yang tidak terdeteksi di BAC, perpustakaan fag P1, fosmid atau
kosmid (4,5). Banyak dari daerah yang belum dikloning juga hilang dari generasi
berikutnya majelis urutan, mungkin karena mereka sangat sifat berulang (5–7). Secara
signifikan, berkembang pesat gen khusus manusia dapat ditemukan di beberapa di
antaranya daerah (8,9). Komposisi urutan miring juga bisa menghalangi kloning pada E.
coli . Sangat AT kaya genom terkenal sulit untuk dikloning, seperti pada slime
jamur Dictyostelium discoideum, parasit malaria.
Upaya bertahun-tahun membuahkan hasil 18.000 klon unik. Gen yang tersisa
ditentukan biasanya ditargetkan oleh PCR atau sintesis gen, namun hampir 1.600 gen tidak
pernah ditemukan (16). Termasuk di antaranya adalah gen untuk lebih dari 100G reseptor
berpasangan protein, keluarga protein yang terlibat dalam berbagai macam proses
transduksi sinyal sel. Penjelasan yang mungkin karena ketidakmampuan untuk menangkap
cDNA adalah apa adanya beracun bagi bakteri, mengandung urutan berulang atau
sebelumnya lebih dari 4–6 kb. Ketidakstabilan fragmen kloning diperburuk oleh fitur
vektor kloning khas. Transkripsi DNA kloning dapat menyebabkan seleksi terhadap
terbuka bingkai bacaan yang menyandikan protein beracun atau dapat menyebabkannya
penataan ulang atau penghapusan urutan berulang, seperti itu sebagai ulangan di- atau tri-
nukleotida atau saluran poli-T. Selain itu, promotor aktif dalam sisipan dapat menulis ke
tulang punggung vektor, mengganggu plasmid replikasi atau ekspresi penanda yang dapat
dipilih.
Jumlah salinan vektor yang tinggi dapat mengurangi kemampuan untuk mengkloning
fragmen besar (misalnya> 8kb) atau daerah dengan kuat struktur sekunder (23,24). Kaleng
supercoiling plasmid menginduksi salib dan struktur sekunder lainnya, mendukung
penghapusan atau pengaturan ulang (25,26). Untuk menghindari beberapa masalah ini,
generasi pertama vektor linier 'pG591' dan 'pN15L' dibangun (27,28). Vektor ini didasarkan
pada coliphage N15, yang memiliki genom dsDNA linier. Setelah infeksi, DNA fag N15
biasanya diedarkan melalui itu ujung kohesif. Enzim fag unik yang disebut protel omerase
(TelN) memotong di situs tertentu, tel RL, linierisasi DNA fag. TelN kemudian menutup
setiap pemotongan yang baru ujung, menghasilkan ujung 'jepit rambut' yang tertutup secara
kovalen (29). Selama lisogeni, profag bereplikasi sebagai linier molekul dsDNA,
mempertahankan ujung yang tertutup secara kovalen.
Gambar 5. Perakitan Genom Flavobacterium (69% AT) di vector pJAZZ