Judul Buku : Kimia Pemisahan

Penulis : Dr. Sri Adelila Sari S.Pd, M.Si

Tahun : 2019

Penerbit : Tira Smart –Tangerang

Isbn : 978 -602 – 6695 -58 -8

1
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Teknik kromatografi adalah metode pemisahan yang digunakan untuk sintesis
senyawa murni (atau hampir murni). Pada umumnya sebelum suatu senyawa
diidentifikasi dan dapat di ukur kadarnya,  perlu di pisahkan dari matriknya. Oleh karena
itu, pemisahan merupakan langkah penting dalam analisi kualitatis. Suatu analisis kimia
menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik
senyawa terukur. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan
teknik yang paling banyak di gunakan. Salah satunya yaitu kromatografi kolom.
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat. Karena
pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan
preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua
cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari
campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik
langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya
menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian
besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Berdasarkan uraian
tersebut, maka pada makalah ini akan dibahas tentang metode kromatografi kolom.
B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang telah dikemukakan. Di bawah ini

dirumuskan beberapa masalah yang akan dibahas dalam makalah :

1. Apa yang dimaksud dengan kromatografi kolom?

2. Bagaimana prinsip dari kromatografi kolom?
3. Apa fase gerak dan fase diam kromatografi kolom?
4. Bagaimana proses pemisahan dalam kromatografi kolom?
5. Bagaimana analisis kualititatif dan kuantitatif kromatografi kolom?
6. Apa saja penerapan kromatografi kolom dalam kehidupan?

2
C. Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian dari kromatografi kolom
2. Untuk mengetahui prinsip dari kromatografi kolom
3. Untuk mengetahui fase diam dan fase gerak dari kromatografi kolom
4. Untuk mengetahui proses pemisahan / mekanisme pemisahan pada kromatografi
kolom
5. Untuk mengetahui analisis kualititatif dan kuantitatif kromatografi kolom
6. Untuk mengetahui penerapan kromatografi kolom dalam kehidupan.

3
 BAB II

PENGERTIAN DAN PRINSIP KROMATOGRAFI KOLOM

1. Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan. Atau bisa didefinisikan sebagai proses melewatkan
sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan absorpsi terhadap zat-zat yang
sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan apa yang dihasilkan yang di sebut
kromatogram. Pada dasarnya, semua kromatografi menggunakan dua fase yaitu satu fase
tetap (stationary) dan yang lain fase bergerak (mobile). Pemisahan-pemisahan tergantung
pada gerakan relatif dari dua fase ini. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai
dengan sifat-sifat fase tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair.
Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang
pertama kali  di lakukan oleh D.T.Davy yaitu untuk membedakan komposisi minyak
bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan
atau adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan ke dalam kromatografi cair – padat
(KCP) kolom terbuka. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi
komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase
diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat
padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair.
Fase bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran
sepanjang kolom.  Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa
komponen – komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang
berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila dialirkan cairan ( elutor ) secara
kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh penyarat
kolom, maka yang pertama – tama dihanyutkan oleh elutor ialah komponen yang paling
lemah terikat kepada adsorben. Komponen – komponen lainnya akan dihanyutkan
menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada
komponen – komponen tersebut.

4
 Keuntungan kromatografi kolom yaitu dapat digunakan untuk analisis dan
aplikasi preparatif, digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran digunakan
untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Kerugian dari kromatografi kolom yaitu
untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, sehingga
metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.

2. Prinsip Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu
campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering
dan metode basah. Pada metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam
bubuk, diikuti dengan penambahan fase gerak. Sedangkan pada metode basah, sebuah
bubur disiapkan dari eluen dengan fase diam bubuk dan kemudian dengan hati-hati
dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau
dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru
ditambahkan eluen. Eluen perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan
organic.
Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada afinitas
kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang
berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi kolom menggunakan fase
diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi
akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan
waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat
ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam
pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik
dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan
kompresi (misalnya udara, nitrogen, dan argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.

5
 BAB III

FASE DIAM DAN FASE GERAK DALAM KROMATOGRAFI KOLOM

Dalam kromatografi terdapat istilah fase diam dan fase gerak. Ditinjau dari pengertian
keduanya dimana fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting
dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase
diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit.
Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau
cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
Sedangkan fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit, dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga
berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa yang mudah
menguap (volatile).
Pada kromatografi kolom, kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti pati yang
dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian
diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut
(fase gerak) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di
pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fase diam).
Berdasarkan uraian diatas maka dapat kita simpulkan bahwa fase gerak dalam kromatografi
kolom merupakan pelarut sedangkan fase diamnya adalah adsorbenUntuk kromatografi jenis ini
dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan
tertambat lebih lama pada fase diam –> tR lebih besarSebagai contoh jika kita ingin memisahkan
kafein dan parasetamol pada sampel obat flu dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang
nonpolar, maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada
kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam, sedangkan parasetamol
bisa terlarut sedikit tapi hanya sebentar saja.

6
 BAB IV

PROSES PEMISAHAN ATAU MEKANISME PEMISAHAN

A. Penggunaan Kromatografi Kolom

1. Penyiapan Sampel
Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, lalu
dituangkan hati-hati diatas packing kolom. Fase gerak dikeluarkan tetes demi tetes,
diatur kecepatan menetesnya (tergantung besar-kecilnya kolom) dan dijaga kolom
tetap terendam, untuk itu ditambah fase gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak
merusak packing kolom. Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi. Volume
fraksi tergantung berat sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat proses
awal elusi ini. Makin kecil volume fraksi, akan diperoleh pemisahan yang lebih baik.
Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah dengan mencampurnya
dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, biasanya
pelarut yang digunakan adalah pelarut yang digunakan untuk pembuatan ekstrak.
Larutan ekstrak ini kemudian dicampur dengan 2,0-3.0 bagian fase diam, dengan hati-
hati campuran ini dikeringkan didalam rotary evaporator hingga diperoleh serbuk
ekstrak kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan ditutup dengan
selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.
2. Elusi
Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit demi
sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom sehingga fase gerak
mengalir dengan sendirinya. Cara yang praktis adalah dengan memasukkan kedalam
corong pisah, ujung corong pisah dimasukkan kedalam kolom dan ujung lain tertutup,
sedangkan keran terbuka. Fase gerak akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan
keluarnya fase gerak dari kolom.

B. Penggunaan Kromatografi Kolom Partisi

Pada sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan
polaritas pada fase diam. Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan
fase diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa

7
gas, fase diam berupa cairan sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam
berupa gas sedangkan fase diamnya berupa cairan.

1. Preparasi Bahan Penyangga

Untuk bahan penyangga berupa silica gel, bahan penyangga ini harus
dicampur dengan fase diam yang akan digunakan dengan perbandingan 0,5-1,0
bagian fase diam dengan 1,0 bagian bahan penyangga. Pencampuran harus baik,
misalnya dengan menggunakan mortar atau blender sehmgga akan dihasilkan
semacam pasta atau bubur yang tidak terlalu basah tetapi juga tidak kering. Fase
diam kemudian ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut sehingga terjadi sluri.
Setelah itu sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan pengaduk berbentuk
cakram yang diameternya lebih kecil sedikit daripada diameter tabung. Pada pusat
cakram diberi tangkai panjang. Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung dan
digerakkan berkali-kali sepanjang tabung ke atas dan ke bawah, maka cakram
akan dapat bergerak leluasa, dan sluri akan dapat bergerak melalui sela-sela
cakram dengan dinding tabung. Gerakan cakram harus perlahan-lahan, dilakukan
beberapa kali. Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase diam dikeluarkan
melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung.
Untuk kolom selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam aseton.
Campuran kemudian dituangkan ke dalam tabung. Kelebihan aseton dikeluarkan
melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Kolom kemudian
dicuci dengan fase bergerak sampai terjadi keseimbangan. Kadang-kadang
sebelum dicuci dengan fase bergerak, dicuci terlebih dahulu dengan air
berlebihan.

2. Teknik Elusi
Ada beberapa cara mengelusi sampel. Yang pertama dengan cara bertahap
(batch elution atau stepwise elution), yaitu mengelusi kolom dengan suatu jenis
pelarut (dapat merupakan campuran dua macam atau lebih pelarut) sampai
sejumlah volume eluat tertentu dikumpulkan, kemudian elusi dilanjutkan dengan
jenis pelarut lain dengan cara yang sama, demikian seterusnya dengan jenis

8
 pelarut yang lain lagi sampai selesai. Keuntungan dengan menggunakan cara ini
adalah mudah dilakukan penyeimbangan (conditioning) kolom. Dengan demikian
fraksi fraksi yang ingin dipisahkan dapat dielusi dengan sesedikit mungkin eluen.
Cara yang kedua adalah mengalirkan eluen secara berterusan (continuous
elution). Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan pompa peristaltik atau
secara sederhana dengan meletakkan tangki penyedia freservoir) pelarut tepat di
atas kolom.
Cara yang ketiga adalah mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih
pelarut sekaligus dengan rasio yang berubah selama elusi. Cara ini lazim disebut
sebagai pengelusian bertingkat (gradient elution).
C. Kromatografi Kolom Adsorpsi
Berbeda dengan kromatografi partisi, maka dalam kromatografi adsorpsi yang
menjadi fase diam adalah berupa padatan yang sekaligus juga berperan sebagai
penyangga. Permukaan partikel-partikel penyangga mempunyai sifat aktif yang dapat
mengikat komponen-komponen atau molekul-molekul tertentu.
Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan tabung seperti halnya pada
kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan
penyiapan kolom partisi. Pada umumnya penyangga merupakan komponen yang
mempunyai polaritas tinggi, sehingga penyerapan solut pada permukaan penyangga
sangat tergantung pada polaritas solut. Sedangkan eluennya digunakan pelarut yang
polaritasnya rendah.

9
 BAB V
ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF

A. Analisis Kuantitatif
Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya
dengan cara titrasi ataupun spektofotometri.
B. Analisis Kualitatif
Pergerakan komponen melalui kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara
bahan penyerap, komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap bila
suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan
waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan dengan terbentuk pita-
pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen (eluat). Setiap zona yang
keluar dari kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari
kolom.

10
 BAB VI
APLIKASI KROMATOGRAFI KOLOM DALAM KEHIDUPAN

Aplikasi Kromatografi Kolom dalam Kehidupan dapat di jelaskan sebagai berikut:

1. Menganalisa zat pewarna alami dalam tumbuh-tumbuhan.
Contohnya mengekstrak daun atau wortel.
2. Dalam bidang bioteknologi,
a. Kromatografi kolom mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya penentuan
kualitatif maupun kuantitatif senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia
sering menjadi objek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio-farmasi.
b. Kromatografi kolom juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul
penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting
lainnya.
Data-data yang didapat menggunakan kromatografi kolom selanjutnya dapat
meningkatkan mutu produk obat-obatan ,menghasilkan jenis obat baru atau dapat dipakai
untuk mengontrol kondisi obat sehingga bisa bertahan lama
3. Dalam bidang clinical (klinik)
Kromatografi kolom sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan
antara lain:
a. Air liur
Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang
diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk
perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari
sampel air liurnya.
b. Air kencing
Dari air kencing dapat dideteksi jenis penyakit yang diderita oleh pasien yakni
mendeteksi senyawa oksalat. Demikian halnya air liur, air kencing, darah dan fluida
badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan
suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.

11
12