Diktat Praktikum Mikrobiologi 2021

Panduan Praktikum Mikrobiologi
PANDUAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
2021
LABORATORIUM FISIOLOGI DAN BIOKIMIA
FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERTANIAN

UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Fakultas Peternakan Dan Pertanian Universitas Diponegoro
PANDUAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
Disusun Oleh :
Tim Asisten
Mikrobiologi
Editor :
Heppy Haryanta, ST.
Dr. Ir. Nurwantoro, MS

LABORATORIUM FISIOLOGI DAN BIOKIMIA

FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERTANIAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
Tim Asisten Mikrobiologi @ 2016

Nianuraisah, Fatan Dwi Putra, Apriyanto, Jundina Muthia Z., Rizky Choirunnisa, Hidayatul
Fitria, Faidatul Milla, Mega Hardianti,
Editor :
Heppy Haryanta, ST.
Dr. Ir. Nurwantoro, MS.
Cetakan VI, November 2014

Diterbitkan Oleh :
Laboratorium Fisiologi dan Biokimia
Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro Semarang
Hak cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mencetak dan menerbitkan sebagian atau seluruh isi buku ini dengan cara dan
dalam bentuk apapun tanpa seijin penyusun.

KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Allah SWT karena atas rahmat dan hidayah-Nya
penyusun dapat menyelesaikan Panduan Praktikum. Panduan praktikum ini
merupakan hasil revisi panduan praktikum yang ada, setelah dilakukan
evaluasi dari hasil praktikum yang terlaksana beberapa waktu lalu maka
dipandang perlu untuk memperbaharui panduan praktikum yang ada.
Penyusun menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada
semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan buku panduan
praktikum Mikrobiologi ini, semoga budi baik beliau terbalas oleh-Nya.
Harapan kami semoga panduan praktikum ini bermanfaat bagi
mahasiswa maupun para pembaca lainnya dan dapat meningkatkan minat
mahasiswa dalam mempelajari Mikrobiologi. Tak lupa penyusun mengharap
tegur sapa dari berbagai pihak demi penyempurnaan buku panduan
praktikum ini.
Akhirnya penyusun menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya
atas perhatian dan koreksi dari berbagai pihak,semoga budi baik beliau
dibalas oleh-Nya.
Semarang, Maret 2020
Penyusun

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR.................................................................................. i
DAFTAR ISI............................................................................................... ii
TATA TERTIB PRAKTIKUM...................................................................... iii
PERCOBAAN I : MEDIUM DAN LARUTAN PENGENCER................... 1
PERCOBAAN II : STERILISASI.............................................................. 6
PERCOBAAN III : METODE HITUNGAN CAWAN.................................. 10
PERCOBAAN IV : PEWARNAAN GRAM................................................ 24
ii

Agar kelancaran praktikum Mikrobiologi di Laboratorium dapat berjalan

dengan baik, maka mahasiswa peserta praktikum (praktikan) diharuskan
mengikuti tata tertib praktikum yang ada.
1. Sebelum dilakukan praktikum akan diadakan pengujian pendahuluan (pre
test umum) tentang materi yang akan di dicoba dalam praktikum dan
materi yang berkaitan dengan percobaan.
2. Setiap mahasiswa peserta praktikum diharuskan hadir di Ms.
Teams /official YouTube Mikrobiologi 2021 pada waktu yang telah
ditentukan 10 menit sebelum praktikum dimulai. Jika berhalangan karena
sakit atau alasan lain, mahasiswa harus memberi tahu secepat mungkin
kapada asisten mahasiswa.
3. Mahasiswa yang diperkenankan mengikuti praktikum adalah mahasiswa
peserta praktikum yang telah dinyatakan lulus pada pengujian
pendahuluan (pre test) praktikum tentang pengetahuan dalam materi
yang akan dipraktikumkan.
4. Sebelum praktikum dimulai mahasiswa peserta praktikum harus sudah
hafal dengan cara pembuatan reagensia yang dibutuhkan dan seluruh
prosedur praktikum pada masing-masing percobaan.
5. Mahasiswa peserta praktikum diharuskan dan diwajibkan memakai
pakaian sopan dan rapi selama praktikum berlangsung.
6. Mahasiswa peserta praktikum tidak diperkenankan meninggalkan
meeting room selama praktikum berlangsung tanpa seijin asisten
mahasiswa.
7. Setiap kelompok praktikum diwajibkan mengikuti semua percobaan.
8. Mahasiswa peserta praktikum harus tunduk pada peraturan yang berlaku,
disiplin, jujur, tenang dan sungguh-sungguh dalam mengikuti percobaan
praktikum.
9. Mahasiswa peserta praktikum yang tidak tunduk dan menurut pada tata
tertib praktikum yang telah ditentukan dalam petunjuk praktikum ini, maka

asisten mahasiswa berhak mengeluarkan dari meeting room dan

dinyatakan tidak lulus.
10. Setelah semua percobaan praktikum dilaksanakan oleh tiap-tiap
kelompok maka akan dilakukan tes akhir (post test) yang bahannya
meliputi keseluruhan rangkaian materi praktikum.
SELAMAT BEKERJA
iv
PEROBAAN I
MEDIUM DAN LARUTAN PENGENCER
Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang
dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain itu medium dapat pula
digunakan sebagai isolasi, memperbanyak, penguji sifat-sifat fisiologis dan
sebagai media penghitung jumlah mikroba.
Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam
medium diperlukan persyaratan tertentu yaitu sebagai berikut :
1. Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh
mikroba.
2. Medium harus mempunyai tekanan osmose, tegangan muka dan pH
yang sesuai.
3. Medium tidak mengandung zat-zat penghambat.
4. Medium harus steril.
Medium dibedakan menjadi tiga macam yaitu :

1) Medium cair, yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan termasuk
menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi dan uji-uji lainnya,
misalnya Nutrient Broth, Glucose Broth, dsb;
2) Medium padat, digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan
sehingga membentuk koloni yang dapat dilihat, dihitung atau diisolasi
misalnya Nutrient Agar, Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar; dan
3) Medium setengah padat, memiliki konsistensi diantara medium cair dan
medium padat.

Cara pembuatan medium dengan komponen bahan kimia

- Menimbang masing-masing komponen bahan kimia secara teliti
- Melarutkannya dalam air
- Kemudian mengatur pH dari masing-masing komponen kimia tersebut
- Mensterilkan menggunakan autoklaf pada suhu dan waktu yang
ditetapkan, misalnya suhu 121 0C selama 15 menit.
Berbagai jenis medium telah diperdagangkan dalam bentuk campuran

lengkap dalam keadaan kering, sehingga dalam penggunaannya hanya
dilarutkan dalam air dan disterilisasi. Air yang digunakan untuk melarutkan
medium adalah air destilata atau sebaiknya air yang telah dideionisasi.
Medium padat mengandung bahan pemadat seperti agar, gelatin atau
silika gel. Medium yang paling sering digunakan adalah agar yang diperoleh
dari ganggang laut dan telah diperdagangkan dalam bentuk murni dan kering.
Konsentrasi penggunaan agar biasanya 1,5%, tetapi jika akan dilakukan
goresan pada permukaan agar dapat digunakan konsentrasi 1,8-2,0%.
Medium yang disimpan dalam keadaan telah memadat, misalnya dalam
lemari es, dapat dicairkan kembali dengan cara memanaskan wadah yang
berisi medium tersebut di dalam panci yang berisi air mendidih selama
beberapa menit atau menggunakan autoclave.
Larutan Pengencer
Larutan pengencer digunakan untuk mengencerkan sampel dan
biasanya mengandung bufer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba.
Bufer yang sering digunakan sebagai larutan pengencer adalah fosfat,
karena memiliki ciri-ciri :
- Satu-satunya komponen anorganik yang memiliki sifat bufer pada
kisaran pH normal
- Tidak bersifat racun terhadap mikroba

- Dapat digunakan sebagai sumber fosfat untuk pertumbuhan mikroba

seperti : KHPO4 dan/atau KH2PO4.
- Dapat menggunakan larutan garam fisiologis (0,85%), larutan Ringer
maupun air destilata.
Larutan pengencer dapat ditempatkan dalam tabung reaksi dalam

jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (1 ml atau 1 gr sampel di
dalam 9 ml), pengenceran dalam jumlah 90 ml untuk membuat pengenceran
1:10 (10 ml atau 10 gr sampel di dalam 90 ml), atau dalam jumlah 99 ml
untuk membuat pengenceran1:10 (11 ml atau 11 gr sampel di dalam 99 ml)
dan pengenceran 1:100 (1 ml atau 1 gr sampel di dalam 99 ml). Pada sampel
yang kurang seragam dan membutuhkan sampel dalam jumlah besar larutan
2
pengencer dapat ditempatkan dalam erlenmeyer dalam jumlah 225 ml atau
450 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (25 gr sampel di dalam 225 ml
atau 50 gr di dalam 450 ml). Sterilisasi larutan pengencer dilakukan seperti
pada sterilisasi medium.
Bentuk Medium Jumlah medium / wadah

Agar cawan 10 – 15 ml/cawan petri (Ø 10 cm)
Agar tegak + 8 – 9 ml/tabung reaksi (Ø 16 mm)
Agar miring + 6 – 7 ml/tabung reaksi (Ø 16 mm)
Medium cair + 9 – 10 ml/tabung reaksi (Ø 16 mm)
Medium cair berisi tabung durham + 9 ml/tabung reaksi (Ø 16 mm)
PERCOBAAN I. PEMBUATAN MEDIUM
Materi
Bahan : Nutrient Broth, Lactose Broth, kentang, dextrose, agar, aquades
dan asam tartarat.
Alat : Timbangan, elenmeyer, waterbath, gelas beker, gelas ukur,
pisau, kain saring, pH meter.
Prosedur

A. Pembuatan Medium Nutrient Broth (NB) dan Nutrient Agar (NA).

1. Menimbang Nurient Broth (NB) sesuai kebutuhan.
2. Melarutkan NB dalam aquades. Aduk atau campur menggunakan
pengaduk magnetik dan lakukan sterilisasi menggunakan autoklaf.
3. Untuk membuat Nutrient Agar (NA), tambahkan 1,5% agar dalam
Nutrient Broth (NB).
B. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan Acidified Potato

Dextrose Agar (APDA).
1. Kupas kentang dengan pisau hingga bersih, kemudian bilas dengan air
hingga bersih.
2. Irislah kentang tersebut dengan ukuran sekitar 1x1x1 cm.
3. Timbang kentang dengan tepat sebanyak 500 g.
4. Masukkan kentang ke dalam gelas beker, kemudian tambahkan 1000
ml aquades, tutup gelas beker dengan alumunium foil serapat
mungkin.
5. Panaskan dalam waterbath hingga mendidih selama 30 menit.
6. Setelah itu dinginkan, kemudian lumatkan kentang hingga hancur.
7. Ambil fitrat kentang dengan cara menyaringnya menggunakan kain
saring / kapas yang bersih.
8. Setelah filtrat terkumpul ukurlah volumenya untuk membuat medium
PDA, dengan komposisi : 200 ml filtrat kentang
4 g dextrose
4 g agar
pH 6,8 – 7,2
9. Selanjutnya untuk membuat medium PDA, terlebih dahulu siapkan
larutan asam tartarat 10%
10. Sterilkan medium PDA dan larutan asam tartarat 10 % dalam autoklaf
pada suhu 121 0C, 2 atm selama 15 menit.

11. Setelah steril masukkan medium PDA dan larutan asam tartarat 10%
ke dalam inkubator bersuhu 50oC.
12. Setelah keduanya mencapai suhu 50oC tambahkan dengan pipet ukur
steril larutan asam tartarat 10% ke dalam medium PDA secara
aseptis. Maka medium yang dihasilkan tersebut adalah medium APDA
(setiap 1000 ml PDA membutuhkan 10 ml larutan asam tartarat 10%,
pH medium APDA berkisar 3,5-4,0)
4 Pertanyaan
1. Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen dibawah ini di dalam
medium :
a. Pepton c. Ekstrak sapi
b. Agar d. NaCl
2. Jelaskan perbedaan masing-masing medium dibawah ini :
a. Nutrient Agar
b. Potato Dextrose Agar
c. Lactose Broth
d. Plate Count Agar
e. Briliant Green Lactose Bile Broth
3. Sebut dan jelaskan klasifikasi medium !
PERCOBAAN II 5
STERILISASI

Sterilisasi adalah suatu usaha yang dilakukan untuk membebaskan alat-

alat atau bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan, termasuk
mikroba. Sterilisasi merupakan kunci sukses dalam pekerjaan yang berkaitan
dengan mikrobiologi.
Alat dan bahan yang dipergunakan di dalam bidang mikrobiologi harus
dalam keadaan steril, artinya pada bahan atau alat tersebut tidak terdapat
mikroorganisme yang kehadirannya tidak diinginkan karena dapat
menggangu proses yang sedang dilakukan.
Beberapa Metode Sterilisasi

A. Sterilisasi secara fisik
Sterilisasi secara fisik dengan pemanasan merupakan sterilisasi yang
paling banyak digunakan. Sterilisasi dengan pemanasan ini terdiri dari 4
metode, yaitu :
1. Sterilisasi dengan pemijaran.
Metode ini terutama dipakai untuk sterilisasi jarum preparat, jarum
ose dan sebagainya yang terbuat dari logam. Caranya dengan
membakar langsung alat-alat tersebut diatas api bunsen, seperti
ditunjukkan pada Ilustrasi 1.
2. Sterilisasi dengan udara panas

Sterilisasi metode ini menggunakan alat “hot air sterilizer” atau
oven. Metode sterilisasi ini dipakai untuk mensterilkan alat-alat gelas
seperti erlenmeyer, cawan petri, pipet hisap, tabung reaksi, dsb. Pada
umumnya suhu yang digunakan pada metode sterilisasi ini adalah
160 0C selama 2 jam atau 170 0C selama 1 jam.
6 3. Sterilisasi dengan menggunakan uap air panas

Metode sterilisasi ini dilakukan pada bahan-bahan yang tidak tahan
panas dan mengandung cairan, serta tidak dapat disterilisasi

menggunakan oven. Sehingga bahan-bahan tersebut disterilisasi

dengan menggunakan uap air panas. Alat yang digunakan disebut
“Arnold Steam Sterilizer”. Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan
0
bahan dalam uap panas bersuhu 100 C selama 30 menit untuk
membunuh sel-sel vegetatif mikroba. Pemanasan diulang sebanyak
tiga kali dengan selang waktu 24 jam.
4. Sterilisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan

Metode sterilisasi ini menggunakan alat yang disebut autoklaf. Alat
ini dilengkapi dengan manometer, termometer dan klep pengaman.
Cara sterilisasi dengan menggunakan metode ini merupakan cara
sterilisasi yang paling baik dibandingkan dengan metode sebelumnya.
Bahan-bahan yang disterilisasi dengan menggunakan metode ini tidak
rusak karena pemanasan dan tekanan. Bahan yang disterilkan harus
dalam tabung atau erlenmeyer yang ditutup dengan rapat. Lama
sterilisasi ini adalah 15 – 30 menit dalam suhu 121 0C dengan tekanan
2 atm. Sterilisasi dengan metode ini biasanya digunakan untuk
mensterilkan medium dan larutan pengencer.
B. Sterilisasi secara kimia

Senyawa kimia yang banyak digunakan sebagai disinfektan antara lain :
CuSO4, AgNO3, ZnO, larutan alkohol dan beberapa garam seperti NaCl, KCl,
dan KNO3 yang dapat digunakan untuk membunuh mikroba karena tekanan
osmotiknya, yaitu dengan jalan dehidrasi protein pada substrat.
C. Sterilisasi secara mekanis atau filtrasi

Bahan-bahan cair yang sangat peka terhadap pemanasan (misalnya
serum darah, toksin, antibiotik dsb) relatif tidak tahan terhadap panas yang
tinggi (seperti medium tertentu yang mengandung senyawa gula) dapat
disterilisasi dengan menggunakan metode filtrasi ini. Pada metode ini filter
7
yang seringkali digunakan adalah filter Chamberland dan Berkefeld yang

mempunyai berbagai tingkat porositas. Untuk lebih jelas lihat Ilustrasi 1.
Pemijaran Filtrasi
Ilustrasi 1. Berbagai Metode Sterilisasi
PERCOBAAN II. STERILISASI
Materi
Alat : Oven, autoklaf, cawan petri, pipet hisap, erlenmeyer.
Bahan : kertas pembungkus, kapas, alkohol dan alumunium foil.
Prosedur
A. Sterilisasi Kering
1. Siapkan pipet, cawan petri, erlemeyer serta alat gelas lainnya sesuai
dengan kebutuhan.
2. Bersihkan cawan petri dengan menggunakan kapas yang dibasahi
dengan alkohol untuk menghilangkan kotoran dan lemak yang
menempel pada cawan, kemudian bungkus sepasang cawan petri
tersebut dengan kertas pembungkus (sepasang cawan tiap bungkus).
3. Bersihkan pipet hisap dan sumbat bagian pangkal pipet dengan kapas,
kemudian bungkus beberapa pipet dengan kertas, jangan lupa memberi
tanda pada bagian pangkal dan ujung.
4. Tutup mulut erlenmeyer dengan menggunakan alumunium foil dengan
rapat.
8
5. Masukkan cawan petri, pipet dan erlenmeyer kedalam oven selama 2

jam pada suhu 160 0C atau 1 jam pada suhu 170 0C.
6. Setelah selesai keluarkan pipet, cawan petri dan erlenmeyer dari oven,
tunggu hingga dingin (suhu ruang) sebelum digunakan.
B. Sterilisasi Basah
1. Masukkan medium yang akan disterilisasi ke dalam erlenmeyer atau
tabung reaksi serta larutan pengencer dalam tabung reaksi, kemudian
tutup rapat dengan menggunakan kapas.
2. Masukkan erlenmeyer dan tabung reaksi tersebut ke dalam autoklaf,
kemudian tutup autoklaf dengan rapat.
3. Nyalakan autoklaf, tunggu hingga manometer dan termometer
menunjukkan tanda sterilisasi atau pada suhu 121 0C dengan tekanan 2
atm, diamkan selama 15 menit.
4. Setelah 15 menit tunggu hingga tekanan autoklaf berkisar 0,5 atm,
buka katup pengaman dan biarkan hingga autoklaf tidak lagi
bertekanan (uap air keluar), setelah itu buka autoklaf dan keluarkan
mediumnya.
5. Khusus untuk medium agar, untuk menurunkan suhunya dan menjaga
agar tidak membeku maka masukkan medium ke dalam inkubator
bersuhu 55 0C, sebelum digunakan.
Pertanyaan
1. Jelaskan perbedaan sterilisasi kering dan sterilisasi basah !
2. Jelaskan tujuan sterilisasi !
PERCOBAAN III 9

METODE HITUNGAN CAWAN

(Total Plate Count)
Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam

bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, Most Probable Number
(MPN), dan metode hitungan mikroskopik langsung. Dari metode-metode
tersebut, metode yang paling banyak digunakan adalah hitungan cawan.
Metode lain yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam
suatu larutan adalah metode turbidimetri (kekeruhan) menggunakan
spektrofotometer. Tetapi metode ini sukar diterapkan pada bahan pangan
karena membutuhkan larutan medium yang bening, sedangkan ekstrak
bahan pangan (misalnya sari buah), biasanya mengandung komponen-
komponen yang menyebabkan kekeruhan, sehingga kekeruhan larutan tidak
sebanding dengan jumlah mikroba yang terdapat di dalamnya.
Pengenceran
Jumlah kandungan mikroba terbaik adalah berkisar antara 30 – 300
koloni. Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel
mikroba per ml, per gram atau per cm memerlukan perlakukan pengenceran
sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri, sehingga
setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah
yang dapat dihitung. Pengenceran biasa dilakukan secara desimal yaitu 1:10,
1:100 dan seterusnya, atau 1:100, 1:10.000, 1:1.000.000 dan seterusnya
seperti terlihat pada Ilustrasi 2. Larutan yang digunakan untuk pengenceran
dapat berupa larutan bufer fosfat, larutan garam fisiologis 0,85%, larutan
Ringer maupun aquades.
Cara Pemupukan

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel mikroba yang masih
hidup ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel mikroba tersebut
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan
merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba
karena :
1). Hanya sel yang hidup yang dapat dihitung;
2). Dapat menghitung beberapa jenis mikroba sekaligus;
3). Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena yang
terbentuk mungkin dapat berasal dari satu sel mikroba dengan
penampakan pertumbuhan yang spesifik.
Selain keuntungan tersebut, metode hitungan cawan memiliki beberapa
kelemahan diantaranya yaitu :
1). Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang
sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk satu koloni;
2). Medium dan kondisi yang berbeda dapat menghasilkan nilai yang
berbeda;
3). Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat
dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar; dan
4). Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung.
Metode hitungan cawan dapat dibedakan menjadi dua cara yaitu metode
tuang (pour plate) dan metode permukaan (surface plate).
Metode Tuang (Pour Plate)

Dari pengenceran yang dikehandaki, sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan
tersebut (lihat Ilustrasi 2) dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet
1 ml. Sebaiknya waktu antara dimulai pengenceran sampai menuangkan
kedalam cawan petri tidak boleh lebih lama dari 30 menit. Kemudian ke
11
11
dalam cawan tersebut di masukkan agar cair steril yang telah didinginkan
sampai 47 – 50 0C sebanyak 10 – 15 ml. Selama penuangan medium, tutup
cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari
luar. Setelah penuangan, cawan segera digerakkan diatas meja secara hati-
hati untuk menyebarkan sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan
angka delapan. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasi di
dalam inkubator.
Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis
mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan
dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, se-sel yang
masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat dilihat oleh
mata. Setelah akhir masa inkubasi, koloni yang terbentuk dihitung. Setiap
koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi banyak
sel, meskipun sebenarnya juga bisa berasal dari lebih dari satu sel yang
letaknya berdekatan. Perhitungan jumlah koloni dapat dilakukan
menggunakan “Queebec Colony Counter”. Ketelitian akan lebih tinggi jika
dilakukan secara duplo, yaitu mengunakan dua cawan petri untuk setiap
pegenceran.
Metode Permukaan (Suface Plate)

Pada metode permukaan, medium agar yang telah steril terlebih dahulu
dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. Setelah medium
membeku dengan sempurna, sampel yang telah diencerakan sebelumnya
dipipet pada permukaan medium tersebut sebanyak 0,1 ml. Kemudian
diratakan dengan cara memutar cawan petri di atas meja. Selanjutnya
diinkubasi dan dilakukan perhitungan koloni seperti yang dilakukan pada
metode tuang. Harus diingat bahwa jumlah sampel yang ditumbuhkan hanya
0,1 ml, jadi harus dimasukkan ke dalam perhitungan pengenceran untuk
mendapatkan “Total Plate”.

Ilustrasi 2. Skema Pengenceran dan Pencawanan (Pour Plate/TPC)
13
Cara Menghitung Koloni

Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran
dilakukan secara desimal. Sebagai contoh, misalnya penetapan jumlah koloni
pada susu. Pengenceran awal 1:10 (=10 –1) dibuat dengan cara
mengencerkan 1 ml susu ke dalam 9 ml larutan pengencer dengan
pengenceran yang lebih tinggi misalnya sampai 10 –5 atau 10–6 tergantung
pada mutu susunya. Setelah diinkubasi, misalnya diperoleh 62 koloni, pada
cawan yang mengandung pengenceran 10 –4, maka jumlah koloni dapat
dihitung sebagai berikut (1 ml larutan pengencer dianggap memiliki berat 1
gr) :
Faktor Pengenceran = Pengenceran x Pengenceran x ∑ yang ditumbuhkan

Awal selanjutnya
1 1 1 1
= x x x x 1,0
10 10 10 10
= 10–4
1
Koloni per ml = Jumlah koloni x Faktor Pengencera n
1
= 62 x
10- 4
= 62 x 10 4
= 6,2 x 10 5
Standart Perhitungan
Untuk melaporkan suatu hasil analisa mikrobiologi digunakan suatu
standar yang disebut “Standard Plate Count” (SPC), yang menjelaskan
mengenai cara menghitung koloni pada cawan serta memilih data yang ada
untuk menghitung jumlah koloni di dalam suatu sampel.
14
Cara menghitung koloni adalah sebagai berikut :

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah

koloni antara 30 – 300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu
kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat
dihitung sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
Data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan-peraturan
sebagai berikut :
1. Hasil yang dilaporkan terdiri dari dua angka desimal, yaitu angka
pertama dan angka kedua. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih
besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka
kedua.
Jumlah Koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
2,34 x 10 4 28 dan 1 tidak dihitung
234* 28 1
2,3 x 104 karena < 30
1,25 x 10 5
700 125* 10 700 > 300; 10 < 30
1,3 x 105
1,97 x 106
TBUD TBUD 197* TBUD > 300
2,0 x 106
Ket : TBUD = Terlalu Banyak Untuk Dihitung
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan

kurang dari 30 koloni pada cawan petri (< 30), hanya jumlah koloni
pada pengenceran yang terendah yang dihitung.
Jumlah Koloni per pengenceran SPC

Keterangan
10-2 10-3 10-4
(1,6) <3,0 x 10 3
16* 1 0 3
Hitung pengenceran 10 –2
1,6 x 10
15

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan

lebih dari 300 koloni pada cawan petri (> 300) hanya jumlah koloni
pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara
menghitung jumlahnya pada ¼ bagian cawan petri, kemudian hasilnya
dikalikan 4.
Jumlah Koloni per pengenceran
SPC Keterangan
10-2 10-3 10-4
3,55 x 106
TBUD TBUD 355* 6
3,6 x 10
3,25 x 10 5
TBUD 325* 20 5
3,3 x 10
4.Jika terdapat dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan

jumlah antara 30 dan 300, maka keduanya dibagi atau dibandingkan
(tertinggi : terendah).
- Jika hasil perbandingan dari kedua pengenceran tersebut lebih
kecil atau sama dengan 2, maka tentukan rata-rata dari kedua
nilai tersebut dengan mempertimbangkan pengenceranya.
- Jika perbandingannya lebih besar dari 2, yang dihitung pada spc
hanya hasil dari pengenceran terendah.
Jumlah Koloni per
pengenceran SPC Keterangan
-2
10 10-3 10-4
(2,93 x 104+ 4,1 x 104) : 2 Hitung rata-ratanya
karena
293* 41* 4 = 7,03 x 104
41.000 / 29.300 =
4
3,5 x 10 1,4 (< 2)
Hitung
pengenceran 10 –2
140* 32* 2 1,4 x 10 4 (terendah) karena
32.000 / 14.000 =
2,3 (> 2)
16

5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu
Jumlah Koloni per
pengenceran SPC Keterangan
-2
10 10-3 10-4
175* 16 1 1,9 x 10 4 Dicari rata-rata dari
208* 17 0 pengenceran 10 –2
138* 42* 2 1,5 x 10 4 Dicari rata-rata dari 10–2 dan 10-3
Hasil perbandingan
pengenceran 10–2 dan 10–3
162* 43* 4 adalah 2,8 > 2 (maka diambil
dari rata-rata pengenceran
terendah yaitu 10-2)
290* 36* 4 3,1 x 10 4 Dicari rata-rata dari 10–2 dan 10-3
Hasil perbandingan
pengenceran 10–2 dan 10–3
280* 32* 1 adalah 1,2 < 2 (maka diambil
dari rata-rata pada pengenceran
10-2 dan 10-3)
291* 25 3 3,0 x 10 4 Dicari rata-rata dari
pengenceran 10 –2 meskipun 305
305* 27 0
> 300
PERCOBAAN III. METODE HITUNGAN CAWAN
Materi
Alat : tabung reaksi, cawan petri, pipet, penghisap, erlenmeyer, bunsen
Bahan : sampel yang akan dihitung (bakteri/jamur/mikroba), medium
Prosedur
1. Siapkan dan beri label larutan pengencer dan cawan petri steril
sesuai dengan pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan

17
2. Lakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang ditentukan

(bahan yang segar dilakukan sampai tingkat pengenceran 10 –6 dan
yang busuk sampai 10–9).
3. Lakukan pencawanan pada 3 atau 4 tingkat pengenceran yang
terakhir. “Lihat Ilustrasi 2”, dengan jumlah pengenceran yang sesuai
dengan yang ditetapkan.
4. Tuang + 10 ml medium agar ke dalam cawan petri dan goyangkan
membentuk angka delapan supaya sampel merata. Tunggu hingga
medium memadat.
5. Lakukan inkubasi dengan posisi terbalik pada suhu ruang selama
24 – 48 jam.
6. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada cawan, dan laporkan
jumlah koloni per ml menurut standar yang ditetapkan.
.
Selain cara diatas dapat juga dilakukan dengan cara :
1. Siapkan dan beri label larutan pengencer dan cawan petri steril
sesuai dengan pengenceran dan pemupukan yang ditetapkan
2. Lakukan pengenceran sampai tingkat pengenceran yang
ditentukan yaitu 10–6
3. Tuang + 10 ml medium agar ke dalam cawan petri dan
goyangkan membentuk angka delapan supaya sampel merata.
Tunggu hingga medium memadat.
4. Lakukan pencawanan pada 3 atau 4 tingkat pengenceran yang
17
terakhir (seperti pada ilustrasi 2). Kemudian diratakan.
5. Lakukan inkubasi pada suhu ruang selama 24 – 48 jam.
6. Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada cawan, dan laporkan
jumlah koloni per ml menurut standar yang ditetapkan.
Pertanyaan

1. Bagaimana prosedur perhitungan total mikroba pada sampel susu

bubuk hingga pengenceran 10 –5. Hitung pula kebutuhan alat dan
bahan!
2. Laporkan “Standard Plate Count” dari sampel dibawah ini :
Pengenceran
Sampel –2 SPC
10 10 –3 10 –4 10 –5
Kaldu 280 45 3 -
daging 262 28 1 -
TBUD TBUD 708 158
Susu segar
TBUD TBUD 782 302
Sosis TBUD 294 35 5
Dendeng 55 15 1 0
PERCOBAAN IV
18 PEWARNAAN BAKTERI
Ada berbagai macam cara pewarnaan yang dilakukan untuk mewarnai

bakteri yang merupakan modifikasi atau gabungan dari cara pewarnaan
sederhana. Pewarnaan bakteri dapat dibedakan atas beberapa golongan
yaitu :
a. Pewarnaan Sederhana
b. Pewarnaan Deferensial
1. Pewarnaan gram
2. Pewarnaan asam cepat (acid fast)

19
c. Pewarnaan Struktural
1. Pewarnaan inti sel (Feulgen)
2. Pewarnaan endospora
3. Pewarnaan dinding sel
4. Pewarnaan kapsul
5. Pewarnaan flagela
d. Pewarnaan untuk menguji komponen-komponen tertentu di dalam sel
seperti :
1. Glikogen
2. Lipida
Fiksasi
Fiksasi adalah kegiatan membunuh bakteri dan membuat sel-sel bakteri
tersebut melekat pada gelas objek, biasanya digunakan panas dari api
bunsen. Jika kultur diambil dari medium cair, maka penyebaran dapat
langsung dilakukan diatas kaca objek yang bersih menggunakan loop. Tetapi
jika kultur yang diambil dari medium padat maka sebelumnya di atas kaca
objek harus diberi setetes air, kemudian kultur diambil sedikit dengan
menggunakan ujung loop yang telah dipijarkan dan diratakan di atas kaca
objek sehingga terbentuk lapisan tipis. Kesalahan yang sering dilakukan
adalah pengambilan kultur yang terlalu banyak dari medium padat, sehingga
akan terbentuk lapisan sel yang terlalu tebal pada kaca objek.
Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan salah satu cara pewarnaan yang paling
sering dilakukan dalam pekerjaan mikrobiologi. Cara pewarnaan gram
diciptakan pertama kali tahun 1884 oleh seorang ahli baktereologi yang
bernama Cristian Gram. Cara pewarnaan ini merupakan cara pewarnaan
deferensial, dimana dengan cara ini bakteri dapat dibedakan menjadi dua
grup yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan dari

kedua grup bakteri tersebut disebabkan oleh perbedaan komponen dalam

lapisan – lapisan dinding selnya.
Pada pewarnaan gram, mula-mula bakteri diwarnai dengan zat warna
basa yaitu violet kristal, dan diikuti perlakuan menggunakan suatu mordant
yaitu larutan yodium (lugol). Mordant adalah suatu zat yang dapat menaikkan
afinitas atau pengikatan antara sel dengan zat warna. Keberadaan mordant
menyebabkan zat warna akan lebih sukar tercuci. Sel kemudian dicuci
dengan alkohol untuk menghilangkan violet kristal. Setelah dicuci dengan air,
sel diwarnai dengan “counterstain” yaitu safranin. Sel-sel yang tidak dapat
melepaskan warna akan tetap berwarna kristal violet yaitu biru-ungu dan
disebut bakteri gram positif, sedang sel-sel yang dapat melepaskan violet
kristal dan mengikat safranin sehingga berwarna merah-merah muda disebut
bakteri gram negatif.
Komposisi Larutan Pewarna Gram :
Gram A
Ungu kristal 90 %.................................................................................2,0 g
Etanol 95 % ........................................................................................20,0 g
Amonium oksalat ................................................................................0,8 g
Aquadest .............................................................................................80 ml
20
Gram B
Kristal iodium ......................................................................................1,0 g
Kalium iodida ......................................................................................2,0 g
Aquadest .............................................................................................300 ml
Gram C
Etanol 95 %
Gram D
Larutan safranin (2,5% dalam etanol 95%)..........................................10 ml
Aquadest .............................................................................................100 ml

21
PERCOBAAN V. PEWARNAAN GRAM

Materi
Alat : kaca objek, bunsen, loop, mikroskop.
Bahan : larutan gram (A, B, C dan D), biakan bakteri
Prosedur
1. Pada Kultur Cair, sebarkan satu atau lebih loop kultur cair pada
kaca objek sehingga mencapai diameter kira-kira 1 – 1,5 cm 2.
2. Keringkan / fiksasi dengan nyala api kecil.
3. Pada Kultur Padat, berilah 1 – 2 tetes air pada kaca objek
4. Ambil sejumlah kecil mikroba menggunakan ujung loop,
kemudian sebarkan pada air diatas kaca objek sehingga
mencapai diameter 1 – 1,5 cm 2. Suspensi yang terbentuk tidak
boleh terlalu keruh untuk mencegah terbentuknya preparat yang
terlalu tebal.
5. Keringkan / fiksasi dengan nyala api kecil.
6. Teteskan pewarna violet kristal (Gram A) diatas preparat diamkan
selama 1 menit.
7. Bilas dengan aquades dengan cara memegang kaca objek pada
posisi miring.
8. Buanglah sisa air yang tertinggal, dan tetesi menggunakan
larutan lugol (Gram B) selama 2 menit.
9. Bilas dengan aquades, kemudian hilangkan warna dengan Gram
C sampai warna biru tidak luntur lagi.
10. Bilas kembali dengan aquades, kemudian tetesi dengan
safranin (Gram D) selama 30 detik.
11. Bilas dengan air dan keringkan menggunakan tisu.
12. Periksalah dibawah mikroskop hingga perbesaran 100 x.
Pertanyaan
1. Jelaskan perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif !

2. Sebutkan jenis dan bentuk koloni bakteri yang termasuk patogen !
Daftar Pustaka
Fardiaz, S. 1989. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Penerbit IPB.
Bogor.
Cappucino, J. G. Sherman, N. 1983. Microbiology a Laboratory Manual.

Addison-Wesley Publishing Company. United State of America.

22 Catatan :
26 Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Catatan :

Fakultas Peternakan Dan Pertanian Universitas Diponegoro 27
DAFTAR NAMA ASISTEN MIKROBIOLOGI TAHUN 2019
No Nama Angkatan CP/ ID LINE

1 Wikky Sindu 2017 wikkysindualpido99
2 Ayudhia Utami 2017 ayudhiau
3 Fredericca 2017 Snoopyyy01
4 Nur Hafidzah 2017 nhdk20
5 Ni Putu Intan 2017 intan_apsari
6 Elly Luthfiyanti 2018 ellyluthfiyanti
7 Anastasia Zalsa 2018 anastasiazalsa
8 Farhan Taufiqul 2018 farhantaufiqul2
9 Yuki Zulpa 2018 Yukizlp
10 Halba Lanauly 2018 halba.lsw
11 Anggun Miftahurrahmi 2018 anggunmiftahurrahmi1
12 Mochamad Kresna Duta 2019 @dutakrisna21
13 Nailur Rahma 2019 rahma_nara13
14 Faradhilla Dewi Rosanti 2019 dhilla_0306
15 Nurlayla Athiyatul Maula 2019 maulalayla14
16 Virna Rania Insyira 2019 virnarania
17 Mahira Ilma 2019 mahiraauda
18 Valentinus Farrel Alpharezi 2019 farrel_alph02
28
@ 2019 Copyright by
Tim Asisten Mikrobiologi 2019


Diktat Praktikum Mikrobiologi 2021

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Diktat Praktikum Mikrobiologi 2021

Judul Asli:

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Panduan Praktikum Mikrobiologi

LABORATORIUM FISIOLOGI DAN BIOKIMIA

FAKULTAS PETERNAKAN DAN PERTANIAN

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

LABORATORIUM FISIOLOGI DAN BIOKIMIA

Panduan Praktikum Mikrobiologi

Tim Asisten Mikrobiologi @ 2016

Cetakan VI, November 2014

Hak cipta dilindungi Undang-Undang

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Semarang, Maret 2020

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Agar kelancaran praktikum Mikrobiologi di Laboratorium dapat berjalan

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

asisten mahasiswa berhak mengeluarkan dari meeting room dan

MEDIUM DAN LARUTAN PENGENCER

Medium dibedakan menjadi tiga macam yaitu :

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Cara pembuatan medium dengan komponen bahan kimia

Berbagai jenis medium telah diperdagangkan dalam bentuk campuran

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

- Dapat digunakan sebagai sumber fosfat untuk pertumbuhan mikroba

Larutan pengencer dapat ditempatkan dalam tabung reaksi dalam

Bentuk Medium Jumlah medium / wadah

PERCOBAAN I. PEMBUATAN MEDIUM

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

A. Pembuatan Medium Nutrient Broth (NB) dan Nutrient Agar (NA).

B. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA) dan Acidified Potato

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Sterilisasi adalah suatu usaha yang dilakukan untuk membebaskan alat-

Beberapa Metode Sterilisasi

2. Sterilisasi dengan udara panas

6 3. Sterilisasi dengan menggunakan uap air panas

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

menggunakan oven. Sehingga bahan-bahan tersebut disterilisasi

4. Sterilisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan

B. Sterilisasi secara kimia

C. Sterilisasi secara mekanis atau filtrasi

yang seringkali digunakan adalah filter Chamberland dan Berkefeld yang

PERCOBAAN II. STERILISASI

5. Masukkan cawan petri, pipet dan erlenmeyer kedalam oven selama 2

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

METODE HITUNGAN CAWAN

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Metode Tuang (Pour Plate)

Metode Permukaan (Suface Plate)

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Ilustrasi 2. Skema Pengenceran dan Pencawanan (Pour Plate/TPC)

Cara Menghitung Koloni

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

Faktor Pengenceran = Pengenceran x Pengenceran x ∑ yang ditumbuhkan

Cara menghitung koloni adalah sebagai berikut :

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah

2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan

Jumlah Koloni per pengenceran SPC

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan

4.Jika terdapat dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan

Laboratorium Fisiologi Dan Biokimia

PERCOBAAN III. METODE HITUNGAN CAWAN