BAB III

METODE KERJA

III.I Alat dan Bahan Pecobaan

III.1.1 Alat percobaan
Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini meliputi kolom, statif,
pipet tetes, batang pengaduk, corong kaca, vial, gelas kimia,gelas ukur,wadah
kaca (seperti aquariumukuran kecil sampai sedang),kain hitam,lampu,pompa
aerator, cawan petri,aluminuim foil,labu ukur,mikro pipet, spektrofotometer UV-
Vis
III.1.2 Bahan Percobaan
Adapun bahan yang digunakan yaitu alumunium foil, kapas,kertas
saring, silika gel, ekstrak temulawak, eluen etil astetat dan n-heksan dengan
perbandingan (10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 10:10),air laut,ragi,ekstrak,serbuk
DPPH,BHT,kuersetin
III.2 Cara Kerja
III.2.1 Kromatografi Kolom
1. Ditimbang sejumlah fase diam silika gel lalu dibuat bubur silika dengan
cara memasukkan silika gel kedalam gelas kimia kemudian ditambahkan
pelarut n-heksan, diaduk dengan batang pengaduk hingga tercampur rata
2. Disiapkan alat-alat perangkat kolom, dicuci dengan methanol dan
dikeringkan, dirangkai alat kolom dan ditengakkan dengan bantuan staif
dan klem.
3. Dimasukkan kapas diujung kolom untuk mencegah keluarnya fase diam
ketika dibuka
4. Dimasukkan fase diam silika yang telah dibuat bubur silika kedalam kolom
5. Diketuk dinding kolom secara perlahan untuk mendorong gelembung
udara yang ada naik kebagian atas kolom
6. Dimasukkan sampel ekstrak perlahan lahan kedalam kolom
7. Dimasukkan kertas saring kedalam kolom
8. Lalu dimasukkan fase gerak eluen mulai dari dari non-polar hingga polar
dengan perbadingan etil asetat dan n-heksan (10:0, 8:2, 6:4,4:6, 2:8,
10:10)
9. Kemudian hasil pemisahan ditampung pada masing-masing vial yang
telah dikalibrasi
10. Diamati warna yang dihasilkan dan dipisahkan sesuai perbandingan
eluen yang digunakan
III.2.2 ANTIOKSIDAN
a. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
1. Larutan DPPH 50 µM dinuat dengan melarutkan 1,9 mg serbuk DPPH
dalam metanol hingga volume 100 ml
2. Sebanyak 3,8 ml larutan DPPH 50 µM direaksikan dengan 0,2 ml
metanol
3. Kemudian didiamkan selama 30 menit dalam tempat gelap
4. Diukur panjang gelombang 400-600 nm menggunakan spektrofotometer
UV-Vis yang merupakan absorbansi kontrol DPPH
b. Penentuan Aktivitas Antioksidan
1. Larutkan ekstrak metanol 1 mg/ml
2. Larutkan 25 mg ekstrak dalam 25 ml metanol hal yang sama dilakukan
pula dalam membuat larutan ekstrak etil asetat dan air
3. Masing-masing larutan diencerkan dengan menambahkan metanol
hingga diperoleh konsentrasi 10,30,50,70 dan 90 µM/ml
4. Masukan 0,2 ml larutan sampel kedalam vial dan direaksikan dengan 3,8
ml larutan DPPH 50 µM
5. Campuran dihomogenkan dan diamkan selama 30 menit di tempat gelap
6. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 515 nm menggunakan
spektrofotometer UV-Vis
7. Perbandingan hal yang sama dilakukan pula terhadap kuersetin dan
BHT.
III.2.3 BSLT (Brine shrimp lethality test)
a. Penyiapan Larva Udang
Cara Kerja
1. Siapkan wadah kaca kemudian masukkan air laut yang sudah disaring
2. Beri penerangan pada aquarium dan nyalakan pompa aerator
3. Masukkan satu sendok teh telur larva udang
4. Tutup aquarium dengan kain hitam (cahaya untuk aquarium hanya
berasa dari lampu)
5. Beri ragi sebagai makanan larva udang dengan cara mensuspensikan
ragi dengan air laut lalu di masukkan ke dalam aquarium
6. Biarkan larva udang menetas dalam waktu 48 jam

b. Pengujian Toksisitas dengan Metode BSLT

Cara Kerja
1. Siapkan ekstrak dengan beberapa kosentrasi yang telah ditentukan (hasil
studipustaka)
2. Vial disiapkan berdasarkan konsentrasi ekstrak yang akan digunakan
juga untuk kontrol negatif (Vial yang hanya berisi larva dan diberi makan
ragi). Tiap
konsentrasi ekstrak dan kontrol negatif menggunakan 3 vial. Contoh :
misalnya konsentrasi yang digunakan 100 ppm, 200 ppm dan 300 ppm
dan
kontrol negatif, jadi vial yang digunakan 12 (1 perlakuan 3 vial).
3. Kalibrasi vial hingga 10 mL
4. Masukkan air laut ke dalam vial (sedikit saja air laut)
5. Tiap vial diisi dengan 10 larva udang.
6.Dimasukkan masing masing ekstrak berdasarkan konsentrasinya
kemudian vial dicukupkan dengan air laut hingga 10 mL.
7. Beri makan larva udang dengan suspensi ragi
8. Vial ditutup menggunakan alumunium foil lalu di beri lubang pada alfol
9. Kematian larva udang dapat diamati setelah 24 jam, jumlah hewan yang
mati dalam masing-masing vial dapat digunakan untuk menghitung LC
50
III.2.4 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
1. Disiapkan fase diam yang akan digunakan berupa silika gel GF 254
dengan tebal 0, 25 mm dengan ukuran lempeng 20x20 cm sebanyak 5
lempeng dan dipilih fraksi yang akan dimurnikan. Fraksi terpilih
dilarutkan dengan pelarut yang sesuai secukupnya
2. Fraksi terpilih ditotolkan pada lempeng yang telah disiapkan dengan
bentuk pita yang memanjang
3. Lempeng kemudian dielusi dengan fase gerak etil asetat: heksan (3:2
v/v)
4. Plat yang telah dielusi diamati dibawah lampu UV 254 dan 365 nm
5. Pita yang memberikan hasil positif terhadap senyawa yang diinginkan
dilakukan penyemprotan pada tepi lempeng menggunakan serium (IV)
sulfat
6. Pita yang positif selanjutnya dikerok
7. Hasilpreparatif tersebut kemudian disari dengan pelarut kloroform-
metanol (1:1 v/v).
8. Larutan kemudian disentrifus, selanjutnya filtratnya diambil dan
diuapkan
III.2.3 Kromatografi Laois Tipis 2 Dimensi
1. Disiapkan plat KLT
2. Filtrat dari hasil KLTP selanjutnya diuji kemurniannya dengan cara
ditotolkan pada ujung plat yang telah diberi tanda batas atas dan bawah
3. Plat dielusi menggunakan 3 campuran pelarut yang berbedan dengan
polaritas yang berbeda
4. Plat dielusi kembali dengan cara memutar 90° plat dan dielusi
menggunakan eluen yang berbeda
5. Apabila bercak noda yang muncul tunggal maka dapat disimpulkan
isolat tersebut telah murni.