FAKULTAS BIOLOGI

LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN

No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/DNA-01
INSTRUKSI KERJA UJI Halaman : 1 dari 5
Tgl. Terbit : 28/10/15
ISOLASI DNA HEWAN Revisi :0

ISOLASI TOTAL DNA HEWAN DENGAN KIT EKSTRAKSI DNA

1. RUANG LINGKUP
Metode ini digunakan untuk mengisolasi DNA dari sampel jaringan hewan, dapat dari
insang, otot, darah atau jaringan hewan yang lain

2. ACUAN NORMATIF

Karp, A., S. Kresovich, K. V. Bhat, W. G. Ayad and T. Hodgkin. 1997. Molecular tools in
plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. International Plant
genetic Resources Institute.

Sambrook, J., E. F. Fritch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning : a laboratory

manual. Volume 1-3. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring
Harbor.

3. ISTILAH DAN DEFINISI

DNA (Deoxyribosa Nucleic Acid) adalah asam nukleat yang berada di dalam dan atau di
luar inti sel (nukleus) yang dimiliki oleh semua organisme hidup (virus pengecualian)
serta berperan sebagai materi genetik.
Materi genetik adalah suatu faktor pembawa sifat organisme yaitu gen.
Gen adalah segmen / sekuens spesifik dari DNA yang membawa sifat genetik,
diekspresikan pada fenotip dan diwariskan kepada keturunanya
Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel.

Pengesahan Dibuat oleh Diperiksa oleh Disahkan oleh

Nama Subakir Ganies Niken
Tanda Tangan
Tanggal 26/10/15 27/10/15 28/10/15

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.
 FAKULTAS BIOLOGI
LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN
No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/DNA-01
INSTRUKSI KERJA UJI Halaman : 2 dari 5
Tgl. Terbit : 28/10/15
ISOLASI DNA HEWAN Revisi :0

4. CARA UJI
4.1. Prinsip

Prinsip kerja isolasi DNA adalah preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis
membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein
(dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Hasil dari ekstraksi DNA diperlukan uji
kualitas DNA, yang ditentukan oleh kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan
dipotong oleh enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung.

4.2. Bahan

Kit ekstraksi jaringan hewan (gSYNC TM DNA Extraction Kit Geneaid), larutan buffer
TE, larutan TBE 10x, larutan kloroform, akuades dan larutan ethanol.

4.3. Peralatan

Timbangan, mortar, sentrifugasi, mikrotube, botol flakon, pipet eppendorf, pipet tip, pipet
ukur, pro pipet, tabung reaksi, oven, erlenmeyer, gelas beker, elektroforesis,
spektrofotometer Qubit, pendingin.

4.4. Persiapan pengujian

Sampel jaringan hewan yang akan diuji ditimbang dengan berat 50 mg kemudian
dibekukan dengan nitrogen cair atau dimasukkan dalam freezer terlebih dahulu

4.5. Prosedur pengujian

Sampel jaringan hewan diambil 30-50 mg kemudian dimasukkan dalam microtube 1,5
mL dan dipotong-potong menggunakan gunting bedah hingga menjadi potongan kecil-
kecil. Selanjutnya, ditambahkan 200 µL GST buffer dan 20 µL Proteinase K, lalu
divorteks. Suspensi selanjutnya diinkubasi dalam oven pada suhu 60ºC sampai benar-
Pengesahan Dibuat oleh Diperiksa oleh Disahkan oleh
Nama Subakir Ganies Niken
Tanda Tangan
Tanggal 26/10/15 27/10/15 28/10/15

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.
 FAKULTAS BIOLOGI
LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN
No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/DNA-01
INSTRUKSI KERJA UJI Halaman : 3 dari 5
Tgl. Terbit : 28/10/15
ISOLASI DNA HEWAN Revisi :0

benar larut dan lisat menjadi jernih. Bersama dengan inkubasi sampel ini, sebanyak 200
µL Elution buffer/ sampel turut diinkubasi dalam micotube 1,5 mL terpisah. Tahap
selanjutnya adalah pelisisan sel. Suspensi dalam microtube 1,5 mL disentifugasi dengan
kecepatan 12.300 g selama 4 menit. Supernatan diambil kemudian dimasukkan ke dalam
microtube 1,5 mL yang baru. Selanjutnya ditambahkan 200 µL GSB buffer, lalu digojog-
gojog selama 10 detik. Tahap berikutnya adalah pengikatan DNA. Pada tahap ini,
sebanyak 200 µL ethanol absolut dingin ditambahkan lalu segera digojog-gojog selama
10 detik. Selanjutnya, seluruh suspensi diambil dan dimasukkan ke dalam GD collumn
yang sudah terpasang pada collection tube. Kemudian, suspensi disentrifugasi dengan
kecepatan 12.300 g selama 2 menit. Filtrat yang tertampung dalam collection tube
dibuang lalu collection tube dikeringkan untuk dipasang kembali ke GD collumn. Tahap
selanjutnya adalah pencucian, sebanyak 400 µL W1 buffer ditambahkan lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 12.300 g selama 1 menit. Filtrat yang tertampung dalam
collection tube dibuang lalu collection tube dikeringkan untuk dipasang kembali ke GD
collumn. Selanjutnya, sebanyak 600 µL Wash buffer ditambahkan lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 12.300 g selama 1 menit. Filtrat yang tertampung dalam collection tube
dibuang lalu collection tube dikeringkan untuk dipasang kembali ke GD collumn.
Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12.300 g selama 6 menit. Colection tube
dibuang dan diganti dengan collection tube yang baru. Tahap terakhir dari isolasi DNA
genom adalah elusi. Sebanyak 100 µL Elution buffer yang telah dipanaskan di dalam
oven ditambahkan kemudian didiamkan selama 3 menit. Selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 12.300 g selama 1 menit. Langkah elusi yang sama kemudian diulang,
sehingga total elusi dilakukan sebanyak dua kali. Filtrat yang tertampung dalam
collection tube selanjutnya dipindahkan ke dalam microtube 1,5 mL yang baru, lalu
disimpan dalam mesin pendingin bersuhu -20ºC untuk jangka penyimpanan yang lama.

Pengesahan Dibuat oleh Diperiksa oleh Disahkan oleh

Nama Subakir Ganies Niken
Tanda Tangan
Tanggal 26/10/15 27/10/15 28/10/15

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.
 FAKULTAS BIOLOGI
LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN
No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/DNA-01
INSTRUKSI KERJA UJI Halaman : 4 dari 5
Tgl. Terbit : 28/10/15
ISOLASI DNA HEWAN Revisi :0

4.6. Perhitungan

Perhitungan data ukuran DNA dilakukan melalui analisis kualitatif dan kuantitatif DNA.
Analisis data secara kualitatif untuk memperoleh konsentrasi serta kemurnian hasil
ektraksi DNA dapat menggunakan spektrofotometer Qubit kemudian dihitung nilai
konsentrasi dengan persamaan [DNA]=OD260x50x FC
Keterangan : [DNA]: konsentrasi DNA (μl/ml)
OD 260: nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm
FC: faktor pengenceran
Sedangkan umtuk menghitung nilai kemurnian hasil ekstraksi ditentukan dengan
persamaan
DNA= OD 260
OD 280
Keterangan : DNA : kemurnian DNA
OD 260: nilai absorbansi pada panjang gelombang 260nm
OD 280: nilai absorbansi pada panjang gelombang 280nm.

Analisis data kualitatif menggunakan metode elektroforesis dengan pengamatan pita atau
band dilakukan dibawah sinar UV. Uji kualitas DNA dilakukan dengan mengambil
sebanyak 5 µL sampel dicampurkan dengan 2µL loading buffer (30% gliserol; 0,2%
bromfenol biru; 10mM tris-HCL pH 8,0; 0,1 mM EDTA), kemudian dimasukkan ke
dalam 0,8% gel agarosa (0,2µg mL-1 SYBR SAFE) dan dielekroforesis pada 50V selama
40 menit dalam TBE buffer 1X. Hasil positif yang didapatkan saat pengamatan di bawah
sinar UV yaitu tervisualisasinya pita total DNA hasil isolasi. Cara analisis hasil pita yang
didapatkan adalah benar pita total DNA yaitu dengan melihat ukuran pita/band yang
tervisualisasi dalam satuan base pair (bp) dan kemudian dicocokkan dengan marker.

Pengesahan Dibuat oleh Diperiksa oleh Disahkan oleh

Nama Subakir Ganies Niken
Tanda Tangan
Tanggal 26/10/15 27/10/15 28/10/15

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.
 FAKULTAS BIOLOGI
LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN
No. Dokumen : IKU/5.4/BI-GT/DNA-01
INSTRUKSI KERJA UJI Halaman : 5 dari 5
Tgl. Terbit : 28/10/15
ISOLASI DNA HEWAN Revisi :0

5. PENGENDALIAN MUTU
5.1. Pengendalian mutu hasil isolasi DNA
Setiap tahapan isolasi disesuaikan dengan protokol isolasi DNA dengan adanya
modifikasi pada saat optimasi metode sebelumnya sehingga didapatkan pelet
DNA yang berwarna putih bening didasar tube ekstraksi
5.2. Pengendalian mutu hasil DNA
Ukuran DNA yang dapat dipisahkan oleh gel agarosa dengan konstentrasi 0,8%
berkisar dari 10kb – 0,7kb (Beckmann & Osborn, 1992). Konsentrasi dan
kemurnian DNA diuji secara kuantitatif dengan menggunakan metode
spektrofotometri dengan sinar UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Pita ganda DNA dapat menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm
sedangkan kontaminan seperti protein atau fenol akan menyerap sinar UV pada
panjang gelombang 280 nm. Oleh sebab itu, nilai kemurnian DNA dapat diukur
dengan absorbansi Å260/Å280 dengan hasil kemurnian pada kisaran 1,7- 1,8.
Tingkat konsentrasi DNA diketahui dari nilai OD sampel dengan formula [DNA]
(mg/mL) = O.D.260 x 50 x faktor pengenceran (Sambrook and Russel, 1989).

Pengesahan Dibuat oleh Diperiksa oleh Disahkan oleh

Nama Subakir Ganies Niken
Tanda Tangan
Tanggal 26/10/15 27/10/15 28/10/15

Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari
Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.