PCR adalah suatu teknik amplifikasi (perbanyakan) sekuens DNA target spesifik secara in
vitro. PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali
hanya dalam beberapa jam.
            Yang dibutuhkan untuk PCR adalah sebagai berikut:
1.      DNA template

DNA template merupakan total DNA genomik yang diisolasi dari sampel biologis
(darah, sperma, kulit, rambut, dll) yang berisi wilayah target yang akan diperbanyak. DNA
template digunakan sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama.

1.      DNA primer

Merupakan potongan pendek DNA single strand yang mengapit target. DNA primer
inilah yang menentukan keberhasilan PCR.

1.      Taq DNA polymerase

Merupakan enzim yang digunakan sebagai katalis untuk reaksi polimerase DNA.
Dipilih dari bakteri termofilik atau hipertermofilik karena enzimnya bersifat termostabil
sampai temperatur 95 derajat celcius.
Enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai
aktivitas spesifik 10 kali lebih kuat dibandingkan aktivitas enzim Taq polimerase (Thermus
aquaticus).

1.      Nukleotida (GATC)

 Merupakan bahan-bahan yang digunakan untuk menyusun DNA.
G = Guanin; A = Adenin; T = Timin; C = Sitosin

Thermal Cycler

Adalah alat untuk proses PCR. Alat ini mampu mengubah suhu dengan cepat dan
mengulangi siklus selama beberapa kali dengan tiga suhu berbeda selama reaksi PCR.

Proses PCR terdiri dari tiga siklus, yaitu:

1.      Denaturasi
Pada proses ini suhu yang digunakan adalah berkisar 93 – 95 derajat celcius selama 1
menit. Suhu yang digunakan tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga
pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan
aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu, juga dapat
merusak DNA templat. Sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses
denaturasi DNA templat tidak sempurna. Sehingga umumnya suhu denaturasi yang digunakan
adalah 94 derajat celcius. Dalam proses denaturasi, ikatan hidrogen DNA double strand akan
rusak sehingga terpisah menjadi single strand.
2.      Annealing
Suhu kemudian diturunkan menjadi 55 derajat celcius selama 45 detik. Pada proses ini,
DNA primer single strand akan menempel pada daerah tertentu dari target DNA.

3.      Ekstensi
Pada proses ekstensi, suhu dinaikkan menjadi 72 derajat celcius selama 2 menit. Langkah
ini disebut langkah perpanjangan karena pada suhu ini polimerase Taq DNA membentang
dari primer dengan menambahkan nukleotida yang melengkapi templat untuk strand DNA
yang baru tumbuh.
Ketiga siklus ini akan berulang selama 30 kali.

Elektroforesis

            Hasil dari PCR kemudian dipisahkan dengan elektroforesis. Elektroforesis

merupakan teknik untuk memisahkan protein atau DNA dengan jalan memberi perbedaan
medan listrik elektrostatik pada media agar/ poliakrilamid yang direndam dalam TBE (Tris –
Boric Acid – EDTA). Teknik ini dapat digunakan untuk memanfaaatkan muatan listrik yang
ada pada molekul misalnya DNA yang bersifat negatif. Molekul yang dapat dipisahkan antara
lain DNA, RNA, atau protein. Jika suatu molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui
suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub
yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif.

Fragmen DNA pendek atau protein dengan berat molekul rendah akan bergerak paling
jauh. Sampel DNA diberi pemberat (misalnya gliserin) dan pewarna untuk mengetahui
apakah bagian terpendek sudah sampai di ujung. Pewarna yang digunakan biasanya metylen
blue.
 Fragmen-fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dapat ditentukan
ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu bahan semi-padat berupa polisakarida
yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu
buffer. Agar dapat larut dengan baik, pelarutannya dibantu dengan pemanasan hingga gel
agarosa dalam keadaan cair sehingga mudah dituang ke atas lempeng, dan sebelum
mendingin dibuat sumuran dengan menggunaka perspex menyerupai sisir yang ditancapkan
pada salah satu ujung gel yang masih cair. Sehingga ketika gel memadat, terbentuklah
sumuran-sumuran kecil. Ke dalam sumuran inilah nantinya molekul DNA dimasukkan.

Agarosa merupakan polisakarida yang terdiri dari unit agarobiosa. Konsentrasi

agarosa yang biasa digunakan antara 1 – 3%. Ukuran pori gel bergantung pada konsentrasi
agarose, semakin tinggi konsentrasi agarosa maka semakin kecil ukuran pori dan sebaliknya.
Agarosa juga mengandung sulfat, semakin rendah konsentrasi sulfat maka semakin murni
agarosa. Keuntungan menggunakan agarosa adalah agarosa leleh pada suhu yang rendah (62
– 65 derajat celcius).
Tahapan elektroforesis:
1.      Pemasangan sisir pada cetakan gel agarosa.
2.      Menuangkan larutan agarosa yang cair setelah pemanasan.
3.      Setelah permukaan gel padat, sisir diangkat.
4.      Setelah ditambahkan dengan larutan TBE, masukkan DNA sampel dalam setiap sumuran.
5.      Menghidupkan mesin elektroforesis dengan waktu, set voltase dan arah migrasi yang telah
ditetapkan.
6.      Hasil dari elektroforesis kemudian diamati dengan UV illuminator.

Jenis-jenis Elektroforesis
 Elektroforesis Kertas
 Elektroforesis selulosa asetat
 Elektroforesis kapiler
 Elektroforesis gel

Kertas Elektroforesis
Elektroforesis kertas memanfaatkan kertas Kromatografi yang memiliki kapasitas adsorpsi
berbeda dari molekul yang berbeda. Untuk melakukan elektroforesis semacam ini, ada
beberapa langkah yang melibatkan:

 Pertama, kertas filter dibasahi dengan larutan buffer.

 Setelah ini, rendam kedua ujung kertas saring dalam larutan buffer.
 Kemudian tempat sampel di tengah, setelah itu medan listrik diterapkan, yang
 memungkinkan migrasi molekul ke kutub masing-masing tergantung pada
muatannya.

Kegunaan: elektroforesis kertas digunakan untuk analisis protein seperti kasein, serum,
albumin, miosin dll.

Elektroforesis Selulosa Asetat

Jenis elektroforesis ini dikembangkan oleh Kohn pada tahun 1958. Filter membran asetat
biologis digunakan dalam ini daripada kertas kromatografi normal. Elektroforesis selulosa
asetat kurang lebih sangat mirip dengan elektroforesis kertas. Ini melibatkan langkah-langkah
berikut:

Pertama, kertas filter selulosa asetat menjadi lembab dengan larutan buffer.
Setelah ini, rendam kedua ujung kertas filter selulosa asetat dalam larutan buffer.
Kemudian tempat sampel di satu ujung, setelah itu medan listrik diterapkan, yang
memungkinkan migrasi molekul ke kutub masing-masing tergantung pada muatannya.

Kegunaan: Ini digunakan dalam pemisahan protein seperti glikoprotein, hemoglobin dan
molekul protein lipid yaitu. Lipoprotein.

Elektroforesis Kapiler

Jenis elektroforesis ini menggunakan tabung kapiler atau tabung sempit. Ada beberapa
langkah yang melibatkan:

 Pertama, ujung kapiler terendam ke dalam lubang masuk dan keluar.

 Isi botol masuk dan outlet dengan larutan elektrolit.
 Hubungkan elektroda ke catu daya tinggi hingga 5-30 kV.
 Dan sampel kemudian disuntikkan melalui tabung kapiler berongga oleh energi
elektrokinetik.
 Di bawah pengaruh medan listrik, zona analit atau bentuk sampel yang berbeda yang
bermigrasi ke sisi outlet.
 Pita-pita ini kemudian dideteksi secara langsung oleh dinding kapiler.

Kegunaan: Elektroforesis kapiler digunakan untuk analisis makanan, produk farmasi, polutan
lingkungan.

Elektroforesis Gel
 Itu membuat penggunaan gel sebagai matriks pendukung. Metode yang paling populer dan
umum digunakan. Digunakan untuk proses analitik dan persiapan. Ini adalah metode yang
paling umum untuk melakukan proses elektroforesis.

Prinsip: Dalam matriks gel berpori ini digunakan yang terdiri dari jaringan polimer yang
terhubung silang. Melalui jaringan ini, molekul dengan ukuran, muatan dan bentuk yang
berbeda melewati. Ini bergantung pada fakta bahwa molekul bermuatan negatif akan menarik
ke arah akhir positif dan sebaliknya. Setelah migrasi, pita akan muncul pada matriks gel pada
tingkat yang berbeda yang tertinggal adalah molekul yang berat dan yang bergerak lebih
cepat adalah molekul yang lebih ringan melalui pori-pori matriks gel.

Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)

         Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:

Amplifikasi urutan nukleotida.
         Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi.
         Bidang kedokteran forensik.
         Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
         Isolasi Gen.