Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.

net/publication/295831075

Pengaruh ERmorfologi pada struktur dan fungsi sinaptik di Drosophila melanogaster

Artikel di Jurnal Ilmu Sel · Februari 2016

DOI: 10.1242 / jcs.184929

KUTIPAN BACA

44 512

8 penulis , termasuk:

Joseph Faust Ethan Fan

Universitas Rice Pusat Medis Universitas Texas Barat Daya

28 PUBLIKASI 593 KUTIPAN 1 PUBLIKASI 44 KUTIPAN

LIHAT PROFIL LIHAT PROFIL

Diana Pendin Michael Stern

Universitas Padova Universitas Rice

31 PUBLIKASI 906 KUTIPAN 54 PUBLIKASI 2.594 KUTIPAN

LIHAT PROFIL LIHAT PROFIL

Beberapa penulis publikasi ini juga mengerjakan proyek terkait berikut:

model Drosophila untuk subtipe Hereditary Spastic Paraplegia Lihat proyek

Interaksi Membran-Antibiotik Lihat proyek

Semua konten setelah halaman ini diunggah oleh Joseph Faust pada 06 Desember 2016.

Pengguna telah meminta peningkatan dari file yang diunduh.

© 2016. Diterbitkan oleh The Company of Biologists Ltd | Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
ARTIKEL PENELITIAN
Pengaruh ERmorfologi pada struktur dan fungsi sinaptik di
Drosophila melanogaster
James B. Summerville 1, *, Joseph F. Faust 1, *, Ethan Fan 1, Diana Pendin 2, Andrea Daga 3, Joseph Formella 1,
Michael Stern 1, ‡ dan James A. McNew 1, ‡
ABSTRAK
Paraplegia spastik herediter (HSP) adalah sekumpulan penyakit genetik yang
disebabkan oleh mutasi pada salah satu dari 72 gen yang mengakibatkan
degenerasi akson kortikospinalis yang bergantung pada usia disertai dengan
kelenturan dan kelumpuhan. Dua gen yang terlibat dalam HSP menyandikan
protein yang mengatur morfologi retikulum endoplasma (ER). Atlastin 1 (ATL1,
juga dikenal sebagai SPG3A) mengkodekan fusi membran ER GTPase dan reticulon
2 (RTN2, juga dikenal sebagai SPG12) membantu membentuk pembentukan
tabung ER. Di sini, kami menggunakan ERmarker fluorescent baru untuk
menunjukkan bahwa ERwithinwild-type Drosophila Terminal saraf motorik
membentuk jaringan tubulus yang terfragmentasi dan berdifusi saat ortolog
atlastin 1 hilang. atl. atl atau Rtnl1 kerugian mengurangi pelepasan pemancar yang
ditimbulkan dan meningkatkan arborisasi. Mirip dengan protein HSP lainnya, Atl
menghambat pensinyalan protein morfogenetik tulang (BMP), dan hilangnya atl
menyebabkan defisit alat gerak tergantung usia pada orang dewasa. Hasil
ini menunjukkan peran penting ER dalam fungsi saraf, dan mengidentifikasi
hubungan mekanistik antara morfologi ER, fungsi saraf, pensinyalan BMP,
dan perilaku orang dewasa.
KATA KUNCI: Atlastin, ER, Reticulon, Neuron
PENGANTAR
Fungsi organel intraseluler terkoordinasi erat dengan lokasi di dalam sitoplasma.
Retikulum endoplasma (ER) adalah jaringan yang saling berhubungan dari tabung
sempit dan cisternae atau lembaran pipih (Hu et al., 2011; Shibata et al., 2009,
2006; Terasaki et al., 2013; Westrate et al., 2015). Di sebagian besar sel, RE adalah
organel subseluler yang paling melimpah dan memperluas proses yang rumit ke
seluruh sitoplasma. Membran ER dibentuk menjadi arsitektur tubularnya oleh aksi
protein struktural dalam keluarga reticulon, REEP dan DP1 (English dan Voeltz,
2013; Hu et al., 2008; Shibata et al., 2009; Voeltz et al., 2006 ; Yang dan Strittmatter,
2007). Anggota keluarga protein yang beragam ini berbagi motif protein umum
yang disebut domain homologi retikulon (RHD). Hidrofobik ∼ 200amino-acid RHD
kemungkinan membentuk struktur jepit rambut heliks yang menginterkalasi
empat segmen heliks hidrofobik ke dalam selebaran luar membran ER untuk
menginduksi kelengkungan dan mempertahankan bentuk tubular (Voeltz et al.,
2006; Zurek et al., 2011). Banyak anggota keluarga Reticulon, REEP dan DP1 juga
mengandung segmen N-terminal yang diperluas mulai dari beberapa ratus hingga
seribu asam amino yang kemungkinan besar menyediakan fungsionalitas
tambahan.
1 Departemen Biosains, Program Biokimia dan Biologi Sel, Universitas Rice, Houston, TX 77005, AS.
2 CNR, Neuroscience Institute, 35121 Padova, Italia. 3 E. Institut Ilmiah Medea, 31015 Conegliano,
Italia.
* Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama untuk pekerjaan ini
‡ Penulis untuk korespondensi ( stern@rice.edu ; mcnew@rice.edu )
Diterima 15 Desember 2015; Diterima 17 Februari 2016
(Di Sano et al., 2012). Sifat dari sebagian besar fungsi sekunder ini
masih belum diungkapkan.
Jaringan ER yang besar juga menjaga kontinuitas luminal dan membran di
seluruh sitoplasma. Sifat jaringan ER yang saling berhubungan ini diperlukan
untuk fungsi ER dan dipertahankan oleh fusi membran ER GTPase atlastin (Orso et
al., 2009), yang merupakan anggota dari keluarga protein terkait dinamin fusi
(fusion DRP) (McNew et al., 2009). al., 2013; Moss dkk., 2011; Pendin dkk.,
2011).
ER terkait erat dengan dan secara fungsional terhubung ke
membran plasma. Hubungan ini sering dikaitkan dengan
pengelolaan Ca 2+ simpan di lumen UGD. Protein ER STIM1
berdifusi melalui membran ER untuk mencari pasangan
pengikat pada membran plasma termasuk saluran Orai (Jozsef
et al., 2014; Soboloff et al., 2012). Set protein ini -
asosiasi protein bekerja untuk mengembalikan ER Ca 2+ melalui Ca
yang dioperasikan di toko 2+ sistem saluran. UGD - Situs kontak
membran plasma juga dihasilkan oleh asosiasi ER-integral
extended synaptotagmin (E-Syt) dengan fosfolipid dalam membran
plasma (Fernández-Busnadiego et al., 2015; Giordano et al., 2013;
Schauder et al., 2014) serta protein seperti junctophillins pada jenis
sel tertentu (Helle et al., 2013; Stefan et al., 2013).
Baru-baru ini, UGD ditemukan terkait dengan stabil
struktur endosomal (Raiborg et al., 2015a; Rowland et al., 2014). Dalam
keadaan ini, protein spesifik pada setiap permukaan yang berinteraksi
tetap didefinisikan secara tepat, tetapi konsekuensi dari interaksi
tersebut adalah pemisahan fungsional dari kargo tertentu dalam
endosom yang memungkinkan penyortiran yang diatur ke dalam
subdomain membran sebelum peristiwa fisi membran yang diarahkan
ER ( Raiborg dkk., 2015a, b; Rowland dkk., 2014).
Struktur ER tampaknya sangat penting untuk fungsi sel
mengingat bahwa penyakit manusia terjadi ketika komponen yang
mengontrol struktur ini dikompromikan oleh mutasi. Paraplegia spastik
herediter (HSPs) adalah sekelompok kelainan genetik terkait yang
disebabkan oleh mutasi pada lebih dari 70 gen, dilambangkan SPG1 untuk SPG72
(Lo Giudice dkk., 2014; Noreau dkk., 2014). Kelemahan dan kelenturan ekstremitas
bawah merupakan dua gambaran klinis yang menonjol dari penyakit ini, yang
terjadi sebagai konsekuensi dari disfungsi atau degenerasi neuron motorik atas
(Blackstone et al.,
2010). Pengamatan bahwa atlastin 1 ( ATL1) dan reticulon 2 ( RTN2) adalah
gen HSP yang bertanggung jawab SPG3A dan SPG12,
masing-masing, melibatkan morfologi ER dalam disfungsi saraf
yang menyebabkan HSP.
Sifat dari tiga gen HSP tambahan, spartin ( SPG20),
Jurnal Ilmu Sel
spastin ( SPAST, juga dikenal sebagai SPG4) dan NIPA1 ( juga dikenal sebagai
spichthyin atau SPG6), melibatkan perdagangan reseptor melalui sistem endositik
di disfungsi saraf HSP. Misalnya, hilangnya spartin melemahkan serapan reseptor
EGF yang distimulasi ligan (Bakowska et al., 2007) serta serapan FM143 yang
distimulasi depolarisasi (Nahm et al., 2013), sedangkan hilangnya spastin
meningkat
1635
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

nomor tubulus endosom dan mengubah pemilahan reseptor struktur ER yang berubah di semua jaringan yang diperiksa (Gbr. 1). Setelah
transferin (Allison et al., 2013). NIPA1 juga terletak di endosom dan fiksasi, tubulus ER tampak terpecah menjadi punctae diskrit dan tubulus
mendorong endositosis reseptor untuk protein morfogenetik berlabel seragam yang terlihat pada pencitraan langsung diubah menjadi
tulang (BMP) (Tsang et al., 2009). ' manik-manik pada seutas tali ' morfologi sesuai dengan tubulus yang pecah. Saya t
Analisis fenotipik mutasi dalam ortolog HSP sistem model ada kemungkinan bahwa tubulus ER dipertahankan di bawah tekanan
telah memberikan petunjuk tambahan untuk fungsi seluler melalui hubungan dengan jaringan sitoskeletal yang mendasarinya dan
protein ini. Di Drosophila, hilangnya spastin, spartin dan fiksasi kimiawi mengganggu tegangan mekanis ini. Terlepas dari
spichthyin memberikan seperangkat fenotipe yang serupa, tetapi tidak mekanismenya, pengamatan ini mengungkapkan efek mengganggu fiksasi
identik, termasuk mikrotubulus yang distabilkan, peningkatan jumlah jaringan pada UGD in vivo. Untuk alasan ini, semua pencitraan ER berikutnya
bouton sinaptik dan penurunan pelepasan pemancar yang ditimbulkan pada yang dipamerkan di sini dilakukan pada sel hidup.
persimpangan neuromuskuler larva (NMJ), defisit lokomotor yang
bergantung pada usia dan peningkatan sinyal BMP pada larva NMJ (Nahm et BiP - sfGFP - HDEL menandai UGD
al. ., 2013; Ozdowski et al., 2011; Sherwood et al., 2004; Wang et al., Kami menyelidiki anatomi ER di terminal saraf motorik larva secara lebih
2007). Fenotipe bersama ini mungkin mencerminkan gangguan jalur rinci. Untuk mengarahkan BiP tersebut - sfGFP - Sinyal HDEL dengan membran
umum dalam perdagangan reseptor endositik pada mutan ini. plasma, kami mengekspresikan BiP - sfGFP - HDEL dengan penanda membran
Beberapa fenotipe ini, seperti mikrotubulus yang distabilkan, defisit plasma myr :: tdTomato. Kami menemukan BiP itu - sfGFP -
lokomotor yang bergantung pada usia dan peningkatan jumlah bouton HDEL terletak berdekatan dengan sinyal myr :: tdTomato (Gbr.
sinaptik, juga diamati pada lalat yang kekurangan atlastin ( atl) ( Lee dkk., 2A - C), menunjukkan bahwa ER berada di saraf motorik
2009, 2008). terminal langsung mendasari membran plasma. Kami juga bersama
Di sini, kami memperluas analisis fenotipik yang diubah ini atl dan mengungkapkan BiP - sfGFP - HDEL bersama dengan penanda membran ER
reticulon-like 1 ( Rtnl1) aktivitas di Drosophila. Kami menunjukkan bahwa ER tdTomato - Sec61 β. Seperti yang diharapkan, kedua penanda ini menunjukkan
di terminal saraf motorik dari larva tipe liar membentuk jaringan tubulus tumpang tindih yang luas (Gbr. 2D - F), sehingga memvalidasi kedua transgen
yang menyerupai a ' keranjang ', tetapi menyebar pada larva yang kurang sebagai penanda ER.
atl. Kami menemukan bahwa gangguan neuronal RNA (RNAi) -mediated
knockdown dari keduanya atl atau Rtnl1 meningkatkan arborisasi di persimpangan Itu atl 2 Mutasi nol mengubah struktur ER di akson motorik dan
neuromuskuler larva dan mengurangi pelepasan pemancar yang ditimbulkan dari serangan presinaptik
terminal saraf motorik larva, dan mandi yang ditinggikan [Ca 2+] atl mengkodekan fusi ER GTPase (Orso et al., 2009), dan dengan demikian
kami mengantisipasi bahwa, dengan mencegah fusi ER, mutasi nol atl 2
sepenuhnya menyelamatkan fenotipe pelepasan pemancar ini. Kami juga
menunjukkan itu atl hanya diperlukan di neuron motorik untuk akan memecah UGD. Untuk menguji prediksi ini, kami membandingkan
mempengaruhi pelepasan pemancar, sedangkan Rtnl1 dibutuhkan morfologi ER pada badan sel neuron motorik, segmen awal akson motorik,
tambahan pada otot target dan glia perifer. Akhirnya, kami menunjukkan dan terminal saraf motorik dalam kontrol dan atl 2 hewan (Gambar 3A). Kami
kerugian itu atl meningkatkan pensinyalan BMP pada neuron motorik larva menemukan sedikit efek pada morfologi ER dalam badan sel (Gambar 3Bi
dan menyebabkan defisit alat gerak tergantung usia pada orang dewasa. versus Gambar 3Bii), tetapi pada segmen awal akson, kami menemukan
Jadi, kehilangan atl dan Rtnl1 memberikan fenotipe yang serupa, tetapi tidak bahwa jembatan silang ER yang ditemukan pada tipe liar hampir atl 2 sel, dan
identik, satu sama lain serta dengan mutan yang cacat spartin, spastin dan spichthyin.
bahwa tubulus ER lurus panjang yang diamati pada tipe liar menjadi
Hasil kami menunjukkan hubungan mekanistik spesifik antara morfologi ER bergelombang (Gbr. 3Biii, iv). Di saraf motorik
dan beberapa aspek anatomi dan fungsi saraf. terminal, kami menemukan itu atl 2 menghilangkan struktur keranjang dan
menyebabkan sinyal ER menyebar, yang kami kaitkan dengan fragmentasi ER (Gbr.
HASIL 3Ci, ii).
Fiksasi kimia mengganggu morfologi ER di Drosophila Untuk mengukur efek atl 2 pada ER morfologi di terminal saraf,
neuron motorik, otot dan sel S2 kami beralasan bahwa BiP - sfGFP - Sinyal HDEL masuk atl 2
Struktur ER sulit untuk diperiksa Drosophila. Untuk mengatasi masalah ini, larva akan didistribusikan secara seragam di seluruh bouton dan dengan
kami mengembangkan reagen yang ditingkatkan untuk in vivo demikian histogram frekuensi untuk intensitas piksel dalam setiap terminal
pencitraan UGD. Pertama, kami menggunakan GFP mutan, disebut akan menunjukkan distribusi Gaussian. Sebaliknya, kami mengantisipasi
Superfolder GFP (sfGFP) (Aronson et al., 2011; Costantini et al., 2015; bahwa intensitas piksel di terminal saraf tipe liar akan terdiri dari sejumlah
Pédelacq et al., 2006), yang telah ditemukan terlipat dengan baik di kecil piksel cerah yang menunjukkan tubulus, dan sejumlah besar piksel
lingkungan pengoksidasi seperti ER lumen. Protein ini masuk ke UGD gelap yang menunjukkan rongga di antara tubulus. Jadi, kami
karena penambahan Drosophila Urutan sinyal BiP dan dipertahankan memperkirakan bahwa histogram frekuensi untuk intensitas piksel dari tipe
dengan penambahan sinyal retensi HDEL ER dari calreticulin (BiP - sfGFP - HDEL).
liar akan miring secara positif. Kami membandingkan histogram frekuensi
Selanjutnya, kami memperkenalkan penanda membran ER yang intensitas piksel, dinormalisasi menjadi intensitas rata-rata, antara tipe liar
mengandung Sec61 β ditautkan ke penanda fluorescent tdTomato. Pada dan atl 2 dan menemukan, seperti yang diperkirakan, kemiringan positif yang
Gambar 1, kami menunjukkan ER yang diberi label oleh BiP - kuat pada tipe liar (Gbr. 3Ciii) tetapi distribusi yang lebih Gaussian di
sfGFP - HDEL diekspresikan dalam tubuh sel neuron motorik (Gbr. atl 2 ( Gambar 3Civ). Selain itu, intensitas piksel mode dan median
1A), neuromuscular junction (NMJ) (Gbr. 1B), otot dinding tubuh mendekati rata-rata dalam atl 2, konsisten dengan Gaussian
larva (Gbr. 1C) dan sel S2 yang dikultur (Gbr. 1D). distribusi, tetapi kurang dari rata-rata dalam tipe liar, konsisten
Hasil sebelumnya menunjukkan struktur organel itu in vivo labil terhadap
Jurnal Ilmu Sel

dengan kemiringan positif (Gambar 3D). Selain itu, kami membandingkan

fiksasi (Johnson et al., 2015), dan oleh karena itu penggambaran struktur ER
yang akurat mungkin memerlukan pencitraan dalam sel hidup. Untuk
menentukan apakah ER berstruktur dalam Drosophila larva atau sel S2 juga
labil terhadap fiksasi, kami membandingkan struktur ER dalam sel hidup
dengan jaringan tetap. Kami menemukan bahwa fiksasi yang sangat ringan
(formaldehida 4% selama 5 menit tanpa permeabilisasi) secara signifikan
pemindaian garis di seluruh terminal saraf di atl 2 dan tipe liar. Sedangkan
pemindaian garis tipe liar menunjukkan beberapa puncak, sesuai dengan tubulus
di dalam keranjang, atl 2 pemindaian garis seragam, konsisten dengan sinyal ER
difus (Gbr. 3Cv, vi).
Selanjutnya, kami menentukan apakah file atl 2 Fragmentasi ER dapat
direkapitulasi oleh target atl knockdown di neuron motorik. Jadi, kami

1636
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

Gambar 1. Fiksasi kimia mengganggu jaringan ER di neuron motorik, otot, dan sel S2. Irisan confocal representatif melalui pusat (A) dan
pinggiran (A ′) dari badan sel wild-typemotor neuron (MN) yang hidup dan tetap di korda saraf ventral. (B) ER dalam pertarungan larva tipe liar dalam kondisi hidup dan
tetap. (B ′) Perbesaran daerah kotak di B. (C) ER pada otot tipe liar 6 dari segmen A3 dalam kondisi hidup dan tetap. (C ′) Perbesaran bidang kotak di
C. (D) ER dalam sel S2 dalam kondisi hidup dan tetap. (D ′) Perbesaran daerah kotak di D. Fiksasi kimia dicapai dengan 5 menit paparan paraformaldehyde 4%. ER
dicitrakan menggunakan BiP - sfGFP - HDEL. Batang skala: 5 µm, kecuali B ′ ( 2 µm).

mengungkapkan keduanya atl Transgen RNAi dan dominan-negatif
atl K51A alel (Orso et al., 2009) di neuron dan menemukan penurunan
serupa pada jembatan silang ER tubulus di segmen awal akson
(Gbr. 4D - F) dan sinyal ER difus serupa di terminal saraf motorik
Rilis pemancar yang dibangkitkan terganggu atl 2 dan Rtnl1 1 null
mutan
Tingkat yang berubah dari beberapa protein HSP, termasuk Spartin dan
Spastin, mengubah pelepasan pemancar Drosophila terminal saraf
Jurnal Ilmu Sel

(Gbr. 4G - SAYA). Hasil ini menunjukkan bahwa pemeliharaan
struktur ER yang benar di neuron motorik membutuhkan aktivitas
atlastin.
Berlawanan dengan atl 2, nol Rtnl1 1 alel tidak memberikan kelainan yang dapat
dideteksi dalam struktur ER di badan sel neuron motorik, akson atau terminal
saraf (data tidak ditampilkan).
motorik (Nahm et al., 2013; Ozdowski et al., 2011; Sherwood et al.,
2004). Kami menguji kemungkinan itu atl 2 dan Rtnl1 1 mungkin
juga mempengaruhi pelepasan pemancar. Kami menggunakan larva
persiapan neuromuskuler (Jan dan Jan, 1976; Stewart et al.,
1994) untuk mengukur transmisi sinaptik dan menemukan bahwa setiap mutasi
memang menurunkan pelepasan pemancar yang ditimbulkan, menggunakan

1637
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

Gambar 2. Marka ER lumen BiP - sfGFP -

HDEL berkolokalisasi dengan penanda membran
ER tdTomato - Sec61 β. Larva instar ketiga
terminal saraf motorik dari segmen otot A2
4. (A - C) Confocal representatif z- proyeksi yang
menunjukkan penanda membran plasma myr ::
tdTomato (A), ERmarker BiP - sfGFP - HDEL (B) dan
sinyal gabungan (C).
(D - F) z- proyeksi yang menunjukkan penanda
membran ER tdTomato - Sec61 β ( D), penanda
lumen ER BiP - sfGFP - HDEL (E) dan sinyal gabungan
(F). Semua transgen digerakkan oleh driver neuron
motorik OK371-Gal4. Batang skala: 5 µm.

depolarisasi otot akibatnya disebut potensi junctional rangsang (EJP) sebagai pelepasan vesikula individu pemancar, tidak terpengaruh secara substansial atl 2 atau
pembacaan. Gambar. 5A dan B menunjukkan rata-rata EJP dalam tipe liar Rtnl1 1 larva (Gambar 5G). Peningkatan sederhana, meskipun signifikan, pada
versus atl 2, masing-masing, di empat mandi yang ditunjukkan [Ca 2+]. amplitudo EJP mini diamati pada atl 2 kemungkinan adalah efek latar belakang
Saat mandi [Ca 2+] dari 0,6 mM, keduanya atl 2 dan Rtnl1 1 kurangi pelepasan genetik yang tidak terkait dengan atl genotipe, sebagai mini EJP
pemancar hampir dua kali lipat (Gbr. 5C). amplitudo tidak terpengaruh secara signifikan lengan-Gal4- ekspresi terdorong
Untuk memastikan bahwa fenotipe pelepasan pemancar ini disebabkan dari atl + transgen (data tidak ditampilkan), dan elav-Gal4- ekspresi didorong atl
oleh hilangnya atl dan Rtnl1, kami menentukan apakah ekspresi UAS- atl + dan RNAi tidak mempengaruhi amplitudo EJP mini (Gbr. 5H).
UAS-Rtnl1 + transgen akan cukup untuk memulihkan pelepasan pemancar Telah diamati sebelumnya bahwa atlastin dan retikulon memberikan
tipe liar ke atl 2 dan Rtnl1 1. Kami menemukan bahwa atl 2 efek berlawanan pada morfologi ER. Secara khusus, sedangkan atl 2
fenotipe pelepasan pemancar sepenuhnya diselamatkan dengan ekspresi memecah ER (Orso et al., 2009), Rtnl1 knockdown oleh RNAi (O ' Sullivan et al., 2012)
UAS-atl + didorong oleh yang lemah di mana-mana Gal4 sopir arm-Gal4 mengubah tabung ER menjadi lembaran. Kami menemukan penekanan timbal balik dari
(Gambar 5D). Sebaliknya, file Rtnl1 1 fenotipe pelepasan pemancar diselamatkan hanya fenotipe pelepasan pemancar yang ditimbulkan di
sebagian oleh lengan-Gal4- didorong UAS-Rtnl1 +; penyelamatan parsial ini kemungkinan Rtnl 1; atl 2 mutan ganda (Gbr. 5C, E), yang mendukung kemungkinan
besar mencerminkan ekspresi lemah dari Rtnl1 + transgene karena, seperti yang bahwa atlastin dan retikulon memiliki efek antagonis pada morfologi.
Kami memeriksa arsitektur sinaps di atl 2 dan Rtnl1 1 mutan dengan
ditunjukkan di bawah, mengemudi UAS-Rtnl1 + ekspresi dengan yang lebih kuat Da-Gal4 pengemudi
mendapatkan penyelamatan total (lihat Gbr. 7B). melakukan imunositokimia dengan antibodi yang diarahkan ke
Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa ER terminal saraf mampu protein zona aktif presinaptik Bruchpilot dan reseptor neurotransmitter
mengontrol pelepasan pemancar dengan mempengaruhi [Ca 2+] postsynaptic GluRII. Kami tidak menemukan cacat struktural atau
(Emptage et al., 2001; Liang et al., 2002; Llano et al., 2000). Kami organisasi yang jelas dalam jumlah atau ukuran zona aktif atau di
bertanya-tanya apakah penurunan rilis pemancar yang ditimbulkan dalam atl 2
pola imunoreaktivitas GluRII (data tidak ditampilkan).
dan Rtnl1 1 mungkin mencerminkan atenuasi dari peningkatan sitoplasma [Ca 2+] disebabkan
oleh stimulasi saraf. Jika demikian, maka kami memperkirakan bahwa pelepasan atl bekerja di neuron motorik untuk mengontrol pelepasan pemancar
pemancar yang menurun ini akan diselamatkan oleh rendaman tinggi [Ca 2+], di Selanjutnya, kami ingin mengidentifikasi jaringan di mana Atl dan Rtnl1 diperlukan
untuk mengontrol pelepasan neurotransmitter. Karena atl 2 dan Rtnl1 1
mana Ca 2+ kurang membatasi untuk pelepasan pemancar (Wong et al., 2014).
Untuk berdua atl 2 dan Rtnl1 1, kami menemukan bahwa saat kami meningkatkan menunjukkan defisit terbesar dalam pelepasan neurotransmitter pada
mandi [Ca 2+], pelepasan pemancar menjadi semakin mirip dengan tipe liar (Gbr. 5E, mandi terendah [Ca 2+] ( Gbr. 5), kami melakukan set pengukuran
yang menunjukkan kandungan kuantitatif, dikoreksi untuk penjumlahan nonlinier berikutnya pada bath rendah [Ca 2+] 0,1 mM, dalam larutan (HL3.1)
dan dinormalisasi ke tipe liar). Bak mandi tinggi [Ca 2+] sepenuhnya menyelamatkan kondusif untuk [Ca 2+] rekaman.
Rtnl1 1 pemancar melepaskan fenotipe, tetapi menyelamatkan atl 2 fenotipe hanya Menghambat atl dengan mengemudi atl Ekspresi RNAi dengan motor
sebagian. Selain itu, kami menemukan bahwa knockdown yang dimediasi RNAi pengemudi neuron D42-Gal4 ( Gbr. 6A, kiri, berlian hijau) atau driver
dari keduanya atl atau Rtnl1 di neuron juga gagal untuk menurunkan pelepasan panneuronal elav-Gal4 ( Gambar 6A, kiri, kotak hijau) secara signifikan
transmitter saat mandi tinggi [Ca 2+] ( Gambar 5F; kemanjuran atl dan Rtnl1 RNA menurunkan amplitudo EJP. Begitu pula dengan penghambat atl dengan
mengekspresikan dominan-negatif atl K51A dengan baik D42-Gal4 ( Gbr. 6A,
Jurnal Ilmu Sel

ditunjukkan dalam eksperimen yang dijelaskan di bawah). Tidak diketahui

mengapa mandi tinggi [Ca 2+] menyelamatkan atl RNAi merobohkan fenotipe
sepenuhnya, tetapi
atl 2 hanya sebagian. Namun, mungkin saja itu atl bekerja di jaringan nonneuronal
untuk mempengaruhi pelepasan transmitter saat mandi tinggi [Ca 2+].
Berbeda dengan efek kuat yang diubah atl dan Rtnl1 pada
amplitudo EJP, amplitudo ' mini ' EJP, dihasilkan secara spontan
kiri, segitiga terbalik hijau) atau driver pan-neuronal nSyb-Gal4
(Gbr. 6A, kiri, segitiga hijau) juga secara signifikan menurunkan
amplitudo EJP. Hasil ini menunjukkan bahwa atl aktivitas diperlukan di
neuron motorik untuk pelepasan pemancar tipe liar.
Kami mengkonfirmasi bahwa penurunan amplitudo EJP menunjukkan
penurunan pelepasan pemancar daripada penurunan otot

1638
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

Gambar 3. Kehilangan atl mengganggu jaringan ER tubular di akson motorik dan terminal saraf motorik larva instar ketiga. ( A) Skema wilayah
motor neuron tempat pengambilan gambar. (B) Irisan confocal sentral representatif dari badan sel neuron motorik dalam kendali [ OK371> BiP - sfGFP - HDEL]
(Bi) dan atl 2 [ atl 2, OK371> BiP - sfGFP - HDEL] ( Bii) larva. z- proyeksi akson motorik dalam korda saraf ventral dalam tipe liar (kontrol) (Biii) dan atl 2 ( Biv) larva. (C) z- proyeksi
persimpangan neuromuskuler dari otot 4 di segmen A6 di tipe liar (Ci) dan atl 2 ( Cii) larva. Histogram frekuensi rata-rata dari intensitas piksel yang diambil dari wilayah
yang diminati di sekitar pertarungan untuk kontrol (Ciii) dan atl 2 ( Civ) ( w 1118 n = 5, atl 2 n = 6; garis putus-putus merah dan biru mewakili mode dan median, masing-masing,
dari histogram dan diberi kode warna dengan analisis di D). Wilayah kotak di Ci dan Cii diperluas di Ci ′ dan Cii ′, masing-masing. Garis putus-putus di Ci ′ dan Cii ′ mewakili
posisi yang digunakan untuk garis-garis intensitas piksel untuk tipe liar (Cv) dan atl 2 ( Cvi). (D) Mode dan median histogram intensitas frekuensi piksel (mean ± sem)
ditampilkan untuk lima kontrol dan enam atl 2 gambar-gambar. P- nilai yang ditampilkan mewakili Siswa yang tidak berpasangan ' s t- tes dilakukan dengan KaleidaGraph.
Batang skala: 5 µm, kecuali Ci ′ dan Cii ′ ( 2 µm).

responsivitas terhadap pemancar dengan menganalisis frekuensi Ekspresi berlebih dari atl di neuron motorik merusak
kegagalan transmisi sinaptik. Di rendah [Ca 2+] Pada Gambar 6, neuron pelepasan neurotransmitter
motorik merespons rangsangan saraf dengan melepaskan baik tanpa Ekspresi dari UAS-atl + di Drosophila neuron motorik menyebabkan
pemancar, yang disebut kegagalan, atau satu atau dua vesikula fusi yang berlebihan dan perluasan selubung nukleus dan
pemancar, yang disebut sukses. Pelepasan pemancar yang menurun di atl membran ER, dan kerusakan pada jalur sekretori di badan sel
knockdown larva disertai dengan penurunan frekuensi keberhasilan neuron dan terminal presinaptik (Orso et al., 2009). Menggunakan
(Gbr. 6A, kanan), yang menunjukkan hal itu BiP - sfGFP - Reagen pencitraan HDEL dijelaskan di atas,
Jurnal Ilmu Sel

atl knockdown menurunkan pelepasan pemancar.
Rilis pemancar di Drosophila persimpangan neuromuskuler dapat dipengaruhi
oleh otot target atau glia perifer tetangga (Huang dan Stern, 2002; Kerr et al.,
2014; McCabe et al., 2003; Schmidt et al., 2012). Dimediasi RNAi atl knockdown di
otot atau glia tidak mempengaruhi pelepasan pemancar atau frekuensi kegagalan
sinaptik (Gbr. 6B, kiri, kotak hijau; Gbr. 6B, kiri, berlian hijau).
kami menemukan itu atl + overekspresi menyebabkan penumpukan yang besar
ER punctae di badan sel neuron motorik dan akson (Gbr. S1A). Untuk menentukan
apakah atl + ekspresi berlebih mempengaruhi pelepasan pemancar, kami
membandingkan amplitudo EJP dalam atl + Mengekspresikan dan mengontrol
larva secara berlebihan pada penangas rendah (0,1 mM) dan tinggi (1,5 mM) [Ca 2+].
Kami menemukan itu atl + ekspresi berlebih secara signifikan menurunkan
amplitudo EJP dan frekuensi keberhasilan sinaptik rendah

1639
ARTIKEL PENELITIAN
mandi [Ca 2+] ( Gambar. S1B), dan penurunan kandungan kuantal terkoreksi pada
bak tinggi [Ca 2+] ( Gambar. S1C). Rtnl1 + ekspresi berlebih juga menurunkan
pelepasan pemancar tetapi pada tingkat yang lebih rendah dari atl +. Kami
menyimpulkan bahwa tingkat maksimum pelepasan pemancar yang dibangkitkan
membutuhkan rasio spesifik dari protein Atl dan Rtnl1.
Rtnl1 mengatur pelepasan pemancar dari beberapa jaringan di NMJ
Kami menggunakan penyelamatan transgenik spesifik jaringan dan knockdown yang
dimediasi RNA untuk mengidentifikasi jaringan di dalamnya
Rtnl1 berfungsi untuk mengontrol pelepasan pemancar. Pertama, kami
menemukan mengemudi itu Rtnl1 Ekspresi RNAi dengan driver pan-neuronal elav-Gal4baik amplitudo EJP yang ditimbulkan (Gbr. 7B, kiri) dan frekuensi
( Gbr. 7A, kiri, kotak biru) secara signifikan menurunkan amplitudo EJP dan
persentase keberhasilan sinaptik (Gbr. 7A, kanan). Hasil ini menunjukkan bahwa diharapkan dari hasil RNAi yang dijelaskan di atas, ekspresi Rtnl1 + didorong
Rtnl1 diperlukan di neuron motorik untuk mempengaruhi pelepasan transmitter.
Kami kemudian menentukan apakah Rtnl1 diperlukan dalam tipe sel lain dari
sinaps tripartit dan menemukan bahwa RNAi-
1640
Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
Gambar 4. Ekspresi UAS-atl RNAi atau UASatl K51A mengganggu
jaringan ER tubular di akson motorik dan
serangan presinaptik.
(SEBUAH - C) ER di badan sel neuron motorik (MN) untuk
kontrol [ nSyb> BiP-sfGFP-HDEL] ( SEBUAH), atl RNAi
[ nSyb> BiP-sfGFP-HDEL, atl RNAi] ( Pita
Atl dominan-negatif [ nSyb> BiP-sfGFP-
HDEL, atl K51A] ( C). (D - F) ER dalam akson motor untuk
kontrol (D), atl RNAi (E) dan dominan-negatif (DN) atl
K51A ( F). (G - I) ER dalam pertarungan presinaptik
untuk kontrol (G), atl RNAi (H) dan dominan-negatif
atl K51A ( SAYA). (G ′ - saya ′) Perbesaran bidang kotak
untuk jenis liar (G ′), atl RNAi (H. ′), dan
dominan-negatif
atl K51A ( saya ′). Batang skala: 5 µm, kecuali G ′, H ′
dan saya ′ ( 2 µm).
dimediasi Rtnl1 knockdown di salah satu otot (Gbr. 7A, kiri,
berlian biru) atau glia (Gbr. 7A, kiri, segitiga biru) juga secara
signifikan menurunkan amplitudo EJP dan tingkat keberhasilan
sinaptik (Gbr. 7A, kanan). Jadi, aktivitas Rtnl1 diperlukan di
ketiga jenis sel sinaps tripartit untuk pelepasan pemancar yang
tepat.
Kami selanjutnya menentukan apakah aktivitas Rtnl1 dalam tiga
jenis sel ini cukup untuk pelepasan pemancar yang tepat.
Pertama, kami memverifikasi keefektifan Rtnl1 + penyelamatan
dengan menentukan ekspresi di mana-mana dari Rtnl1 + transgene,
digerakkan oleh Da-Gal4 pengemudi, cukup untuk menyelamatkan
Jurnal Ilmu Sel
keberhasilan sinaptik Rtnl1 1 ( Gambar 7B, kanan). Seperti yang
panneuronally, di neuron motorik saja, otot saja, atau neuron
motorik dan otot, tidak cukup untuk menyelamatkan amplitudo EJP
atau fenotipe keberhasilan sinaptik Rtnl1 1
(Gambar 7B dan data tidak ditampilkan). Namun, ekspresi serentak
ARTIKEL PENELITIAN
dari Rtnl1 + di neuron motorik, otot dan glia perifer cukup untuk secara
signifikan mengembalikan amplitudo EJP yang tepat dan frekuensi
keberhasilan sinaptik Rtnl1 1 ( Gambar 7B). Kami menyimpulkan bahwa
aktivitas Rtnl1 di neuron motorik, otot target, dan glia perifer di
sekitarnya sudah cukup serta diperlukan untuk mempertahankan
transmisi sinaptik yang tepat.
Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
Gambar 5. atl 2 dan Rtnl1 1 penurunan pelepasan neurotransmitter yang
ditimbulkan. Jejak EJP rata-rata untuk wild-
Tipe ( w 1118) ( A) dan atl 2 ( B) larva pada 0,4, 0,6, 1,0, dan
1,5 mM Ca 2+. Dalam menaik [Ca 2+], untuk w 1118 n = 7, 17, 7, dan 7 dan
untuk atl 2 n = 7, 23, 7, dan 7. (C) Rata-rata ± sem EJP amplitudo
untuk w 1118, atl 2, Rtnl1 1, dan Rtnl1 1; atl 2. P- nilai yang ditampilkan
mewakili ANOVA satu arah menggunakan Fisher ' s LSD post hoc
test dilakukan dengan KaleidaGraph. (D) Rata-rata ±
sem EJP amplitudo untuk atl 2; lengan> UAS-atl +, Rtnl1 1;
lengan> UAS-Rtnl1 +, dan kontrolnya masing-masing menggunakan di
mana-mana arm-Gal4 sopir. P- nilai yang ditampilkan mewakili Siswa
yang tidak berpasangan ' s t- tes dilakukan dengan KaleidaGraph.
Rekaman untuk C dan D dilakukan pada 0,6 mM Ca 2+.
(E) Berarti ± sem dikoreksi konten kuantitatif untuk w 1118,
Rtnl1 1, atl 2, dan Rtnl1 1; atl 2. Dalam menaik [Ca 2+], w 1118
n = 7, 17, 7, dan 7; atl 2 n = 7, 23, 7, dan 7; Rtnl1 1 n = 7, 10, 7, dan
7; Rtnl1 1; atl 2 n = 7, 7, 7, dan 7. Potensi membran istirahat
(RMP) tidak berbeda secara signifikan di antara empat
genotipe saat mandi [Ca 2+] 0,4 mM atau 1,5 mM. Saat mandi
[Ca 2+] 0,6 mM atau 1,0 mM, RMP tipe liar dan
atl 2 berbeda secara signifikan ( P = 0,0266, tipe liar lebih
hiperpolarisasi, pada 0,6 mM [Ca 2+], dan P = 0,0316, atl 2
lebih hiperpolarisasi, pada 1,0 mM [Ca 2+]). RMP dari Rtnl1 1;
atl 2 secara signifikan berbeda dari genotipe lain di bak mandi
[Ca 2+] dari 1,0 mM, Rtnl1 1; atl 2 lebih hiperpolarisasi. (F)
Rata-rata ± sem dikoreksi konten kuantitatif untuk elav> dcr,
elav> dcr, atl RNAi, dan elav> dcr, Rtnl1 RNAi pada 1,5 mM
[Ca 2+]. ( G) Rata-rata ± sem mEJP amplitudo untuk w 1118, atl 2,
Rtnl1 1, dan Rtnl1 1; atl 2, dikumpulkan dari keempat [Ca 2+].
(H) Rata-rata ± sem mEJP amplitudo untuk genotipe yang
ditunjukkan dikumpulkan pada 1,5 mMbath [Ca 2+]. P- nilai di D,
F, G mewakili Siswa yang tidak berpasangan ' s t- tes dilakukan
dengan KaleidaGraph. Rekaman dilakukan di HL3 dari otot 6
di segmen A6. Setiap titik data scattergram adalah rata-rata
dari 20 respons EJP pertama (keberhasilan dan kegagalan)
yang dicatat untuk setiap larva.
Jurnal Ilmu Sel
atl 2 meningkatkan pensinyalan BMP pada neuron motorik larva
BMP adalah keluarga ligan yang disekresikan yang mengontrol
berbagai fungsi organisme. Setelah mengikat reseptor membran, BMP
memicu fosforilasi dan aktivasi faktor transkripsi Mad (Miyazono et al.,
2010), yang diuji dengan antibodi khusus untuk Mad terfosforilasi aktif
(p). Tambahan lagi
1641
ARTIKEL PENELITIAN
untuk fungsi perkembangan, Drosophila Ligan BMP yang dilepaskan
dari otot, glia perifer atau neuron motorik itu sendiri mengatur
pelepasan transmitter dan pertumbuhan sinaptik pada neuron motorik
(Fuentes-Medel et al., 2012; McCabe et al., 2003). Banyak protein HSP,
termasuk Drosophila Spichthyin dan Spartin, spastin mamalia dan
atlastin ikan zebra, menghambat pensinyalan BMP (Fassier et al., 2010;
Nahm et al., 2013; Wang et al., 2007), kemungkinan melalui
perdagangan reseptor BMP yang diubah. Untuk menentukan apakah
Atl mungkin juga menghambat pensinyalan BMP, kami mengukur
pMad nuklir di dalam inti neuron motorik atl 2 larva instar ketiga. Kami
mengamati peningkatan signifikan dalam pMad nuklir atl 2, yang
diselamatkan oleh lemah di mana-mana (Gbr. 8C, kotak hijau) atau
ekspresi neuronspesifik motorik atl + ( Gambar 8C, berlian hijau).
Dengan demikian, Atl berperilaku mirip dengan protein HSP lainnya
sebagai penghambat pensinyalan BMP.
Hilangnya saraf atl dan Rtnl1 menyebabkan pertumbuhan berlebih
terminal akson
Mutasi di Drosophila Ortolog HSP dijelaskan di atas kecepatan. Kami mengamati defisit lokomotor yang bergantung pada usia dengan setiap
peningkatan jumlah bouton sinaptik pada NMJ larva instar ketiga. Dalam pengujian (Gbr. S3). Tidak mungkin defisit lokomotor ini mengakibatkan
penambahan, Lee et al. (2009) telah melaporkan bahwa bouton number juga langsung dari defisit transmisi sinaptik larva yang kita miliki
1642
Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
Gambar. 6. Ekspresi neuronal UASatl RNAi dan
UAS-atl K51A menurunkan pelepasan
neurotransmitter.
(A) Rata-rata ± sem EJP amplitudo dan persentase
keberhasilan yang sesuai untuk wild-
Tipe ( w 1118), atl 2, UAS-atl RNAi dan UAS-
atl K51A. Driver termasuk pan-neuronal
elav-Gal4 dan nSyb-Gal4 dan motornya
saraf D42-Gal4. ( B) Rata-rata ± sem EJP
amplitudo dan persentase keberhasilan otot ( Mef2-Gal4)
dan glial ( Gli-Gal4)
ekspresi dari UAS-atl RNAi dan UAS-atl K51A.
Rekaman untuk A dan B dibuat di HL3.1 pada 0,1
mM Ca 2+ dari otot 6 di segmen A6. Setiap titik data
scattergram adalah rata-rata dari 20 respons EJP
pertama (keberhasilan dan kegagalan) yang
dicatat untuk setiap larva. P- nilai yang ditampilkan
mewakili Siswa yang tidak berpasangan ' s t- tes
dilakukan dengan KaleidaGraph.
meningkat atl 2 NMJs, dan peningkatan ini diselamatkan oleh otot tetapi
tidak oleh neuronal atl + ekspresi. Kami menemukan bahwa knockdown
pan-neuronal dari keduanya atl atau Rtnl1 bouton meningkat secara
signifikan, dan peningkatan ini ditekan ketika kedua gen dirobohkan
secara bersamaan (Gbr. S2). Hasil ini menunjukkan bahwa Atl dan Rtnl1
diperlukan dalam neuron motorik untuk menahan pertumbuhan akson.
Knockdown neuronal atl menyebabkan defisit alat gerak
tergantung usia
Pasien HSP memiliki karakteristik peningkatan spastisitas dan melemahnya
ekstremitas bawah seiring bertambahnya usia. Drosophila mutan untuk
salah satu dari beberapa ortolog HSP juga menunjukkan defisit perilaku (Lee
et al., 2008; Nahm et al., 2013; Sherwood et al., 2004). Kita
Jurnal Ilmu Sel
menggunakan dua tes untuk menentukan apakah pan-neuronal atl penghambatan
menghasilkan defisit lokomotor. Pertama, kami mengukur waktu yang dibutuhkan
untuk elav> Dcr, atl RNAi orang dewasa untuk memanjat 6 cm, dan kedua, kami
menggunakan sistem pelacakan iFly (Kohlhoff et al., 2011) untuk mengukur
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

Gambar 7. Rtnl1 mempengaruhi pelepasan neurotransmitter dari beberapa jaringan di NMJ. ( A) Rata-rata ± sem EJP amplitudo dan persentase keberhasilan yang sesuai
tipe liar ( w 1118), Rtnl1 1, dan UAS-Rtnl1 RNAi ekspresi di neuron, otot dan glia menggunakan elav-Gal4, Mef2-Gal4 dan Gli-Gal4, masing-masing. (B) Rata-rata ± sem EJP
amplitudo dan persentase keberhasilan yang sesuai w 1118, Rtnl1 1 dan ekspresi UAS-Rtnl1 + di Rtnl1 1 mutan. UAS-Rtnl1 + diekspresikan di mana-mana, menggunakan
neuron motorik dan otot inmotor da-Gal4, D42-Gal4 dan Mef2-Gal4, masing-masing. OK371, Mef2 dan Gli-Gal4 menunjukkan ekspresi bersamaan dari
UAS-Rtnl1 + dari neuron motorik, otot dan glia. Rekaman untuk A dan B dibuat di HL3.1 pada 0,1 mMCa 2+ dari otot 6 di segmen A6. Setiap titik data scattergram adalah rata-rata dari 20
respons EJP pertama (keberhasilan dan kegagalan) yang dicatat untuk setiap larva. P- nilai yang ditampilkan mewakili Siswa yang tidak berpasangan ' s t- tes dilakukan dengan
KaleidaGraph.

didokumentasikan. Sebaliknya, defisit alat gerak ini mungkin mencerminkan penggunaan usia Drosophila untuk mengevaluasi defisit sistem saraf yang disebabkan oleh
degenerasi dependen populasi neuron tertentu seperti yang telah diubah atl dan Rtnl1 aktivitas. Menggunakan pencitraan ER fluoresen baru telah dilaporkan
sebelumnya untuk sebuah atl hypomorph (Lee et al., 2008). reagen, kami menunjukkan bahwa ER di terminal saraf motorik tipe liar hadir
sebagai jaringan tubulus, disebut ' keranjang ', yang mendasari membran
DISKUSI plasma, dan keranjang ini dieliminasi pada larva yang kurang atau terlalu
Peran morfologi ER dalam fungsi sistem saraf dan anatomi banyak berekspresi atl. Kami juga menunjukkan kerugian itu atl atau
Rtnl1 meningkatkan arborisasi dan mengurangi pemancar yang ditimbulkan
Mutasi pada dua gen yang mempengaruhi morfologi ER, atlastin ( ATL1) rilis, dan pelepasan yang ditimbulkan dikembalikan ke normal dengan mandi
Jurnal Ilmu Sel

dan reticulon 2 ( RTN2), menyebabkan dua bentuk paraplegia spastik herediter
(HSP), yang mengakibatkan kelemahan tungkai yang progresif, spastisitas dan
degenerasi akson motorik terpanjang (Blackstone et al., 2010). Pengamatan ini
menunjukkan bahwa perubahan morfologi ER merupakan penyebab disfungsi
akson motorik, tetapi mekanisme yang mendasari disfungsi ini masih belum jelas.
Disini kita
tinggi [Ca 2+]. Akhirnya, kami tunjukkan itu atl kehilangan meningkatkan sinyal
melalui jalur tulang morphogenetic protein (BMP) dan menyebabkan
penurunan tergantung usia pada penggerak orang dewasa. Kumpulan
fenotipe ini juga ditunjukkan oleh Drosophila mutan untuk ortolog HSP dari
spartin, spastin dan spichthyin, serta untuk perawan tua dan kecelakaan
gugup, yang mengkodekan regulator perdagangan reseptor melalui

1643
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

Gambar 8. atl 2 meningkatkan pensinyalan BMP di neuron motorik. Gambar confocal representatif dari w 1118 ( A) dan atl 2 ( B) inti neuron motorik dari larva instar ketiga yang diberi label
antibodi anti-pMad. Batang skala: 10 µm. (C) Rata-rata ± sem pMad level untuk w 1118, atl 2, atl 2; lengan> +, atl 2; lengan> atl +, atl 2; OK6> +, dan atl 2; OK6> atl + di inti neuron motorik. Setiap
titik data scattergram adalah intensitas sinyal inti rata-rata per area untuk satu larva. P- nilai yang ditampilkan mewakili Siswa yang tidak berpasangan ' s t- tes dilakukan dengan
KaleidaGraph.

endosom (Nahm et al., 2013; O ' Connor-Giles dkk., 2008; Mengingat peran atlastin dan retikulon sebagai ER-membentuk Ozdowski et al.,
2011; Sherwood dkk., 2004; Sweeney dan Davis, molekul, efek pada ER Ca 2+ rilis akan menjadi tahun 2002 yang paling langsung; Wang et
al., 2007). Kemungkinan keterlibatan UGD dalam penjelasan untuk Ca ini 2+ fenotipe. Ca yang terlokalisasi ER 2+ jalur perdagangan reseptor
pelepasliaran akan dibahas. saluran seperti inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) reseptor, reseptor
ryanodine dan saluran TRPV1 memainkan peran kunci dalam
Efek dari atl kehilangan atau ekspresi berlebih pada morfologi ER di pelepasan neurotransmitter (Emptage et al., 2001; Liang et al.,
neuron motorik 2002; Llano et al. , 2000; Wong et al., 2014). Selain itu, dominan-
Kami membuat dua penyesuaian untuk meningkatkan visualisasi ER. mutasi negatif di Drosophila Ca yang terlokalisasi ER 2+ pompa SERCA
Pertama, kami memperkenalkan pada lalat transgen yang menyandikan GFP menurun memicu pelepasan pemancar sebesar ∼ 50% (Sanyal et al.,
superfolder terlokalisasi ER, yang dioptimalkan untuk pelipatan yang efisien 2005), yang konsisten dengan kemungkinan bahwa ER menurunkan Ca 2+
di ER. Kedua, berdasarkan hasil sebelumnya menunjukkan bahwa ER serta berkontribusi secara signifikan terhadap Ca 2+ diperlukan untuk memicu pelepasan
jaringan tubulus lisosom labil terhadap fiksasi (Johnson et al., pemancar.
2015), kami mencitrakan ER di jaringan hidup. Menggunakan
pendekatan ini, kami menunjukkan bahwa ER hadir dalam segmen awal Rtnl1 mempengaruhi pelepasan neurotransmitter yang dibangkitkan dari beberapa
akson neuron motorik sebagai struktur poligonal dengan banyak jaringan
jembatan silang (persimpangan tiga arah), dan di terminal saraf Tidak seperti Atl, yang tampaknya mempengaruhi pelepasan pemancar yang
motorik sebagai jaringan tubulus yang kami sebut. ' keranjang ', yang ditimbulkan dari neuron saja, Rtnl1 diperlukan dalam neuron, otot, dan glia
mendasari membran plasma. Kami juga menunjukkan bahwa struktur perifer untuk pelepasan pemancar yang dibangkitkan dengan benar.
ini terganggu oleh kehilangan atau ekspresi berlebih atl. Khususnya, atl Temuan ini konsisten dengan data sebelumnya yang menunjukkan bahwa
ekspresi berlebih menyebabkan munculnya punctae besar yang menyimpang di badan transmisi sinaptik yang tepat membutuhkan pensinyalan antar sel di antara
sel neuron motorik atau segmen awal akson. Sebaliknya, atl ketiga jenis sel ini. Secara khusus, hilangnya aktivitas dalam glia perifer dari
kerugian menurunkan jumlah jembatan silang di segmen awal akson, gen rantai berat kinesin atau mabuk- Pengubah neurotransmitter yang
menyebabkan tubulus yang terlalu panjang. Penampilan serupa telah dikodekan menimbulkan pelepasan pemancar (Huang dan Stern, 2002;
dicatat sebelumnya (Hu et al., 2009; Orso et al., 2009) dan dikaitkan Schmidt et al., 2012). Selain itu, glia perifer mengeluarkan setidaknya dua
dengan defisit dalam fusi membran ER ortogonal. Hilangnya protein, TGF- β ligand Maverick dan Wingless / Wnt, yang mengatur fungsi
atl juga mengganggu keranjang terminal saraf dan tampaknya sinaptik (Fuentes-Medel et al., 2012; Kerr et al., 2014). Otot, pada gilirannya,
menyebabkan fragmentasi RE. Ada kemungkinan bahwa transisi dari tubulus mengeluarkan ligan BMP Gbb untuk mengatur pelepasan pemancar yang
ke keranjang saat ER bergerak dari wilayah interbouton ke bouton terjadi ditimbulkan dan arborisasi neuron motorik (McCabe et al., 2003). Mungkin
melalui fragmentasi ER diikuti oleh pemasangan kembali bergantung Atl. saja kerugian itu Rtnl1
Dalam pandangan ini, kehilangan atl akan mencegah perakitan ulang ini, mempengaruhi pelepasan pemancar dari glia atau otot dengan mengganggu
sehingga menyebabkan ER terfragmentasi yang kami amati. sekresi regulator ini atau lainnya.

Kekurangan dalam pelepasan pemancar yang ditimbulkan pada larva kurang atl atau Pan-neuronal atl knockdown menyebabkan defisit lokomotor orang
Rtnl1 diselamatkan dengan mandi tinggi [Ca 2+] dewasa yang progresif selama penuaan
Membangkitkan defisit pelepasan pemancar di keduanya atl 2 dan Rtnl1 1 mutan, Gejala klinis yang paling menonjol pada pasien HSP adalah
dan di pan-neuronal atl atau Rtnl1 knockdown larva, diselamatkan sebagian kesulitan lokomotor yang progresif dan tergantung usia. Drosophila
atau seluruhnya dengan bak mandi [Ca 2+]. Hasil ini menunjukkan bahwa mutan untuk salah satu dari beberapa ortolog HSP, termasuk spartin,
Jurnal Ilmu Sel

kerugian atl atau Rtnl1 mengurangi pelepasan pemancar yang ditimbulkan spastin, atl dan Rtnl1, sebaik perawan tua, menunjukkan defisit lokomotor
pada bak rendah [Ca 2+] melalui penyebab defisit dalam peningkatan yang bergantung pada usia atau defisit umur yang sama (Dermaut et al.,
sitoplasma [Ca 2+]. Ca tidak mencukupi 2+ masuknya bisa dihasilkan dari 2005; Lee et al., 2008; Nahm et al., 2013; O ' Sullivan dkk., 2012; Orso dkk.,
potensial aksi yang dilemahkan, yang akan menurunkan bukaan Ca dengan 2009; Sweeney dan Davis, 2002). Di sini, kami menunjukkan gangguan
gerbang tegangan 2+ saluran, penurunan jumlah membran plasma Ca 2+ saluran lokomotor pada orang dewasa dengan neuronal-spesifik atl
atau penurunan Ca 2+ rilis dari UGD. memukul jatuh. Hasil ini menunjukkan persyaratan untuk atl di

1644
ARTIKEL PENELITIAN Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929

neuron untuk penggerak yang tepat tetapi tidak mengesampingkan peran penting untuk
atl di jaringan lain juga.
Peran potensial ER dalam perdagangan reseptor endositik
Mutan di Drosophila ortolog dari beberapa gen HSP, termasuk
spartin, spastin dan spichthyin, dan gen terkait tambahan
perawan tua dan kecelakaan gugup berbagi satu set umum fenotipe
sistem saraf, termasuk peningkatan arborisasi dan pensinyalan BMP
jalur pengemudi disediakan oleh Drosophila Pusat Sumber Daya Genetik. UASRtnl1
RNAi (#7866) diperoleh dari Wina Drosophila Pusat Sumber Daya. OK6-Gal4 ( Aberle
et al., 2002) disediakan oleh Hermann Aberle (Universitas Heinrich Heine,
Düsseldorf, Jerman). D42-Gal4 ( Yeh dkk.,
1995) disediakan oleh Thomas Schwarz (Children ' s Rumah Sakit Boston, FM
Kirby Neurobiology Center, Boston, MA). Gli-Gal4 ( Sepp dan Auld, 1999)
disediakan oleh Vanessa Auld (Universitas British Columbia, Departemen
Zoologi, Vancouver, British Columbia, Kanada). UAS-atl +, UAS-atl K51A, dan UAS-atl
RNAi seperti yang dijelaskan sebelumnya (Orso et al.,

pada larva NMJ, penurunan pelepasan pemancar yang ditimbulkan dan 2009). atl 2 ( Lee et al., 2009) dan Rtnl1 1 ( Wakefield dan Tear, 2006) seperti yang
defisit lokomotor (Nahm et al., 2013; O ' Connor-Giles dkk., 2008; dijelaskan sebelumnya. UAS-Rtnl1 + disediakan oleh Andrea Daga.

Ozdowski dkk., 2011; Sherwood dkk., 2004; Sweeney dan Davis, 2002; Semua stok lalat dipertahankan pada tepung jagung dan media agar-agar
(dekstrosa 6%, tepung jagung 6,8%, ragi 1,2%, agar 0,72%, 2% metil
Wang et al., 2007) (perhatikan bahwa tidak semua fenotipe telah
4hidroksibenzoat) pada suhu kamar ( ∼ 23 ° C) atau 25 ° C.
dilaporkan untuk setiap mutan). Protein yang dikodekan melokalisasi ke
berbagai kompartemen dalam jalur perdagangan reseptor endositik
Konstruksi plasmid
(Allison et al., 2013; Edwards et al., 2009; O ' Connor-Giles dkk., 2008;
Untuk membangun pJM952 (pAc5 / BiP-sfGFP-HDEL), Superfolder GFP
Sweeney dan Davis, 2002; Wang et al., 2007). Faktanya, peningkatan
(sfGFP) di pEGFP-N1 (Aronson et al., 2011)] disediakan oleh Erik Snapp
sinyal BMP di beberapa mutan ini telah dikaitkan dengan cacat (Albert Einstein College of Medicine, Department of Anatomy &
perdagangan dari Wishful thinking reseptor BMP (Wit). Kami telah Structural Biology, Bronx, NY). Itu Drosophila Urutan sinyal BiP
menunjukkan itu atl kerugian memberikan fenotipe yang sama ini, (MKLCILLAVVAFVGLSLG-RS) kemudian digabungkan ke sfGFP dengan
meningkatkan kemungkinan itu atl bertindak dalam jalur perdagangan sinyal retensi ER Cterminal (-HDEL) dari Drosophila Calreticulin (Smith,
reseptor endositik juga. Meskipun ER tidak diketahui memainkan peran 1992) di pAc5.1 / V5-His A (Invitrogen). Untuk membangun pJM1033 ( UAS-BiPsfGFP-H
penting dalam jalur ini, sebuah laporan terbaru telah menunjukkan pUASTattB (Bischof et al., 2007) disediakan oleh Konrad Basler
bahwa ER diperlukan untuk fisi endosom dalam sel COS, dan, pada (Universitas Zürich, Institut Ilmu Kehidupan Molekuler, Zürich, Swiss).
kenyataannya, ER memilih lokasi fisi (Rowland et al., 2014 ). Selain itu, Kaset BiP-sfGFP-HDEL dari pJM952 kemudian dipindahkan ke
pUASTattB. Untuk membangun pJM1072 (UAS-tdTomato-dSec61 β),
telah ditemukan bahwa proses ini terhambat oleh ekspresi berlebih Rtn4a,
tdTomatowas menyatu dengan Drosophila Sec61 β ( Drosophila Klon cDNA Pusat
yang mirip dengan atl kehilangan, memperpanjang tubulus ER dan
Sumber Daya Genomik # RE18615) dalam vektor 20X-UAS-IVS yang diturunkan dari
menghambat pembentukan jembatan silang (Rowland et al., 2014). Jadi, pJFRC7 (Addgene # 26220).
kehilangan atl dapat berdampak pada jalur perdagangan reseptor
masuk Drosophila terminal saraf dengan cara yang sama mencegah fisi
Drosophila konstruksi stok
endosom.
pJM1033 dan pJM1072 disuntikkan ke embrio attP2 dan VK37 oleh
Keragaman fenotipe yang ditunjukkan oleh mutan yang dijelaskan di atas Genetivision (Houston, TX). Lalat yang diinjeksi disilangkan dua kali w 1118
meningkatkan kemungkinan bahwa fenotipe tertentu mungkin memiliki lalat dan ternak yang membawa sisipan pada kromosom dua (VK37)
hubungan sebab akibat dengan yang lain. Lokasi subseluler dari protein ini dan tiga (attP2) didirikan. Garis UAS-Rtnl1 diproduksi dengan cDNA
menunjukkan bahwa mereka mungkin secara langsung mempengaruhi isoform Rtnl1PB (LD14068). CDNA disubkloning dalam bingkai dengan
perdagangan reseptor. Jika demikian, maka peningkatan pensinyalan BMP, tag HA dalam vektor pUAST, dan garis transgenik dibuat dengan injeksi
sebagai konsekuensi dari perdagangan Wit yang diubah, mungkin menjadi mikro standar.
penyebab langsung dari peningkatan arborisasi dan defisit lokomotor.
Fenotipe yang diberikan oleh aktivasi langsung jalur BMP di neuron Pencitraan larva hidup
konsisten dengan kemungkinan ini (McCabe et al., 2003; Nahm et al., Larva instar ketiga yang berkeliaran, dipelihara pada suhu 25 ° C, dibedah dalam buffer
HL6 (Macleod et al., 2002), buffer kompleks yang dirancang untuk pencitraan
2013). Namun, peningkatan pensinyalan BMP tidak mungkin menyebabkan
larva lalat aktif, dengan 0 mM CaCl 2 dan 7 mM monosodium glutamat pada
penurunan pelepasan pemancar, karena penurunan pensinyalan BMP, daripada
tutup cawan petri 35-mm yang terisi penuh dengan Sylgard 184 (Electron
peningkatan pensinyalan BMP, menurunkan pelepasan pemancar yang
Ilmu Mikroskopi). Pin Minutien (diameter 0,1 mm, Peralatan Ilmu Pengetahuan Murni), ditekuk
ditimbulkan (McCabe et al., 2003). Kami menyarankan agar perdagangan reseptor
hingga 90 ° dan dipotong, digunakan untuk mengamankan larva ke Sylgard. Penutup bulat
selain Wit diubah pada mutan yang dijelaskan di atas, dan perubahan pensinyalan 25-mm (ketebalan # 1) dipotong menjadi dua dengan pisau berlian dan dipasang pada Sylgard di
dari reseptor tambahan inilah yang setidaknya sebagian bertanggung jawab atas kedua sisi larva yang dibedah untuk membentuk saluran. Tutup penutup persegi 22-mm
fenotipe pelepasan pemancar. Drosophila Terminal saraf motorik (ketebalan # 1.5) ditempatkan di atas larva dan diamankan ke penutup bawah penutup dengan
mengekspresikan reseptor seperti kolesistokinin (CCKLR), reseptor seperti tol, cat kuku. Larva dicitrakan pada mikroskop confocal terbalik Zeiss LSM 710 menggunakan tujuan

reseptor glutamat metabotropik (mGluRA) dan kemungkinan reseptor insulin pencelupan minyak PlanApochromat 63 × (1,40 NA). GFP bersemangat dengan laser argon

(Ballard et al., 2014; Bogdanik et al., 2004; Chen dan Ganetzky, 2012; Howlett et al.,
2008). Kehilangan mGluRA meningkatkan pelepasan pemancar yang ditimbulkan
(Bogdanik et al., 2004; Howlett et al., 2008), meningkatkan kemungkinan bahwa
peningkatan pensinyalan mGluRA dapat menurunkan pelepasan pemancar, yang
dapat menjelaskan penurunan pelepasan pemancar yang diamati pada mutan
perdagangan reseptor ini.
488-nm dan cahaya yang dipancarkan antara 493 dan 522 nm dikumpulkan. tdTomato
bersemangat dengan laser neon helium 543-nm dan cahaya yang dipancarkan antara 552 dan
691 nm dikumpulkan. Gambar disesuaikan untuk kecerahan dan kontras di ImageJ. Wilayah minat
(ROI) digambar secara manual di sekitar pertarungan di ImageJ. Intensitas piksel ROI diekstraksi
dan diproses dengan skrip Python khusus (tersedia atas permintaan). Intensitas piksel diskalakan
dengan membagi setiap nilai dengan intensitas piksel rata-rata. Data ini digabungkan ke dalam
50 tempat sampah dengan jarak yang sama mulai dari 0 hingga 8 untuk menghasilkan histogram
frekuensi. Tema dan mode intensitas piksel dihitung untuk setiap gambar dan dibuat grafik
Jurnal Ilmu Sel

BAHAN DAN METODE dengan KaleidaGraph.

Drosophila saham dan media

Baris berikut diperoleh dari Bloomington Drosophila Stock Center di
Indiana University: w 1118 (# 3605), arm-Gal4 (# 1560), elav-Gal4
(# 458), elav-Gal4; UAS-Dcr-2 (# 25750), nSyb-Gal4 (# 51635), OK371Gal4
(# 26160), Mef2-Gal4 (# 27390), UAS-Dcr-2 (# 24650), UAS-Dcr-2
(# 24651), dan UAS-myr :: tdTomato (# 32221). Itu da G32 (# 108252) Gal4
Pencitraan larva tetap
Larva instar ketiga yang berkeliaran dipelihara dan dibedah seperti yang dijelaskan untuk
pencitraan langsung. Larva kemudian difiksasi dengan formaldehida 4% dalam buffer HL6

1645
ARTIKEL PENELITIAN
5 menit, dicuci dengan HL6 dan dipasang di Vectashield (Vector Labs). Slide dicitrakan
seperti yang dijelaskan untuk larva hidup.
Pencitraan sel S2
pJM952 ditransfeksi menjadi sel S2R + ( Drosophila Genomics Resource Center)
menggunakan Fugene HD (Promega) menurut pabrikannya ' protokol. Sel-sel
ditempelkan ke piring berbahan dasar kaca Concanavalin-A (Mat-tek) semalaman.
Sel tetap terkena 4% formaldehida dalam HL3 selama 5 menit dan dicuci dengan
PBS. Sel dicitrakan pada mikroskop confocal pemindaian laser Nikon A1-Rsi
menggunakan obyektif pencelupan minyak CFI Plan Apo VC 60 × (1.4 NA). GFP
bersemangat dengan laser argon 488-nm dan cahaya yang dipancarkan antara
500 dan 550 nm dikumpulkan.
Elektrofisiologi
Larva instar ketiga yang berkeliaran dibedah di HL3 (Stewart et al., 1994) untuk
data yang dikumpulkan pada 0,4 mM, 0,6 mM, 1,0 mM dan 1,5 mM [Ca 2+], atau
HL3.1 (Feng et al., 2004) untuk data yang dikumpulkan pada 0,1 mM [Ca 2+]. Rekaman
dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Howlett et al., 2008). Jejak respons
yang muncul untuk larva dicatat setidaknya selama 20 detik. Jejak diam selama 60
detik direkam untuk frekuensi mEJP dan analisis amplitudo. Analisis EJP dan mEJP
dilakukan dengan menggunakan Program Analisis Mini Synaptosoft. Frekuensi
dan amplitudo mEJP dianalisis menggunakan
' analisis non-stop ' fungsi. Untuk analisis ini, ambang amplitudo mEJP ditetapkan
pada 0,7 mV dengan filter LoPass Butterworth dan frekuensi cut-off 200 Hz.
Amplitudo EJP ditentukan dengan memilih puncak secara manual, yang sesuai
dengan 20 stimulasi pertama dalam satu jejak. Kegagalan dalam 20 stimulasi
pertama dari suatu jejak dilambangkan sebagai nol dan berkontribusi terhadap
data EJP rata-rata. Tidak ada ambang batas minimum yang digunakan
untuk EJP. Konten kuantitatif yang dikoreksi dihitung dengan menggunakan m = ν / ν 1 ( 1- ν / V. 0) - 1,
dimana ν = Amplitudo EJP, ν 1 = mEJP amplitudo dan V. 0 = potensi istirahat
dikurangi faktor koreksi 15 mV (Martin, 1955).
Kuantifikasi pMad
Larva instar ketiga yang berkeliaran, dipelihara pada suhu kamar, dibedah dalam
medium S2 (Invitrogen) dan segera difiksasi (formaldehida 4% dalam medium S2)
selama 15 menit. Larva dicuci dengan PBS-T (PBS plus 0,1% Triton X-100) dan
dipindahkan ke pelat 24 sumur berlapis Sylgard. Larva diinkubasi dengan antibodi
monoklonal kelinci anti-p-Smad1 / 5 (Ser463 / 465) (Cell Signaling, 41D10, 1:50
dalam PBS-T) semalaman (4 ° C) dengan pengocokan orbital lembut, dicuci dengan
PBS-T, diinkubasi dengan antibodi IgG anti-kelinci terkonjugasi Alexa-Fluor-488
kambing (Invitrogen, A-11008, 1: 1000 dalam PBS-T) selama 90 menit pada suhu
kamar, dicuci dengan PBS, dan dipasang di vectashield. Untuk setiap percobaan,
setidaknya tiga w 1118 larva dimasukkan, dan semua larva terkena pengenceran
antibodi yang sama. Ganglia ventral dari setidaknya delapan larva dari dua
percobaan independen dianalisis. Larva dicitrakan seperti yang dijelaskan untuk
larva hidup. ROI ditarik di sekitar inti motoneuronal di ganglia ventral
menggunakan ImageJ. Intensitas piksel rata-rata dibagi berdasarkan area. ROI
Allison, R., Lumb, JH, Fassier, C., Connell, JW, Ten Martin, D., Seaman,
dijumlahkan dan dirata-ratakan untuk setiap larva, dan dinormalisasi ke w 1118 pengendalian
internal.
Arborisasi
Larva instar ketiga pengembara yang dipelihara pada suhu 25 ° C dibedah dengan
HL3, difiksasi dalam formaldehida 4% (dalam HL3) dan dicuci dengan PBS-T. Pelt
ditempatkan di pelat 24-sumur berlapis sylgard dan terkena kambing
AlexaFluor-488-terkonjugasi antibodi anti-lobak-peroksidase (Jackson
ImmunoResearch, 123-545-021, 1: 500) semalaman pada suhu 4 ° C dengan
getaran orbital yang lembut, dicuci di PBS, dan dipasang di Vectashield. Bouton di
otot 6 dan 7 di segmen A3 dicitrakan seperti yang dijelaskan untuk larva hidup.
Bouton dihitung di ImageJ.
Tes pendakian
Persilangan dibuat dengan sepuluh pasang kawin dalam botol setengah pint pada suhu 25 ° C.
Progeni dikumpulkan 2 hari setelah eklosi, dan lalat diberi umur 0 dan 2 hari pasca eklosi.
Laki-laki ditempatkan ke dalam botol dalam kelompok 10 orang - 12 ekor lalat dan berumur pada
suhu 25 ° C. Lalat jantan dewasa dipisahkan menjadi botol kosong individu, diketuk ke bawah dan
diberi waktu untuk melihat berapa lama mereka memanjat 6 cm secara vertikal. Lalat mengalami
tiga kali percobaan dengan 5 menit istirahat di antaranya
1646
Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
percobaan. Jika seekor lalat gagal melewati batas 6 cm dalam 60 detik, waktu dicatat
sebagai 60 detik. Waktu minimum untuk setiap lalat dikompilasi dan dirata-ratakan
sebagai waktu untuk hari itu. Hasil mewakili minimal sepuluh lalat.
Tes kecepatan
Lalat dewasa yang berumur 0 - Umur 2 hari dipelihara pada suhu 25 ° C dan dibius dengan
karbondioksida. Rombongan 6 orang - 10 ekor jantan berumur sampai 3, 10, 15, 25 dan 30
hari (± 1 hari). Lalat dipindahkan, tanpa anestesi, ke dalam vial dengan 10 ml agar 1% dan
didiamkan selama 10 menit. Lalat ditempatkan di ruang Plexiglas putih tembus pandang
dengan kamera video digital yang difokuskan pada vial. Dua cermin yang ditempatkan di
belakang vial pada sudut 40 ° menghasilkan dua pantulan yang terlihat dalam video.
Botol dibanting untuk menjatuhkan lalat ke permukaan agar-agar dan video perilaku
memanjat direkam. Tiga percobaan 30 detik masing-masing dicatat berturut-turut untuk
setiap kelompok. Kecepatan rata-rata untuk setiap vial diukur menggunakan sistem iFly
(Jahn et al., 2011; Kohlhoff et al.,
2011).
Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai anggota Drosophila komunitas serta
Bloomington Stock Center untuk menyediakan jalur terbang. Damian Crowther dan Eleonora
Khabirova menyediakan perangkat lunak dan bantuan dengan sistem iFly. Enrique Martinez
membantu pencitraan S2, Justin Lee membantu menentukan amplitudo EJP dengan Synaptosoft,
Zach Wright membantu pencitraan protein zona aktif, Miguel Betancourt-Solis membantu
konstruksi sfGFP dan Justin Vincent membantu analisis bilangan bouton sinaptik.
Minat yang bersaing
Para penulis menyatakan tidak ada persaingan atau kepentingan finansial.
Kontribusi penulis
JAM, MS, JBS dan JEF merancang eksperimen. MS, JBS dan JEF menghasilkan reagen, DP
membangun jalur UAS-Rtnl1 saat berada di lab AD,
JBS dan JEF melakukan percobaan. JBS, JEF, EF dan JF menganalisis data. JAM, MS, JBS dan JF yang
menulis naskah.
Pendanaan
EF didukung oleh Beasiswa Musim Panas Sarjana George J. Schroepfer, Jr.; MS didukung oleh
dana dari Hamill Foundation; JAM didukung oleh National Institutes of Health [nomor hibah
GM101377]; Yayasan Keluarga Simmons; dan Yayasan Hamill. Disimpan di PMC untuk dirilis
setelah 12 bulan.
Informasi tambahan
Informasi tambahan tersedia secara online di
http://jcs.biologists.org/lookup/suppl/doi:10.1242/jcs.184929/-/DC1
Referensi
Aberle, H., Haghighi, AP, Fetter, RD, McCabe, BD, Magalhaẽ ̃ s, TR dan
Goodman, CS ( 2002). angan-angan mengkodekan reseptor BMP tipe II itu
mengatur pertumbuhan sinaptik di Drosophila. Neuron 33, 545-558.
MNJ, Hazan, J. dan Reid, E. ( 2013). Interaksi ESCRT-spastin mendorong fisi tubulus daur ulang
dari endosom. J. Sel berbagai. 202, 527-543.
Aronson, DE, Costantini, LM dan Snapp, EL ( 2011). Superfolder GFP berpendar di lingkungan
pengoksidasi saat ditargetkan melalui translocon Sec.
Lalu lintas 12, 543-548.
Bakowska, JC, Jupille, H., Fatheddin, P., Puertollano, R. dan Blackstone, C.
(2007). Protein spartin sindrom Troyer mono-ubiquitinated dan berfungsi dalam perdagangan
reseptor EGF. Mol. Biol. Sel 18, 1683-1692.
Ballard, SL, Miller, DL dan Ganetzky, B. ( 2014). Retrograde neurotrophin pensinyalan melalui Tollo
mengatur pertumbuhan sinaptik di Drosophila. J. Sel berbagai. 204,
1157-1172.
Bischof, J., Maeda, RK, Hediger, M., Karch, F. dan Basler, K. ( 2007). Sistem transgenesis yang
dioptimalkan untuk Drosophila menggunakan integrases phiC31 yang spesifik untuk
germ-line. Proc. Natl. Acad. Sci. Amerika Serikat 104, 3312-3317.
Jurnal Ilmu Sel
Blackstone, C., O ' Kane, CJ dan Reid, E. ( 2010). Paraplegia spastik herediter: lalu lintas membran
dan jalur motorik. Nat. Pdt. Neurosci. 1, 31-42.
Bogdanik, L., Mohrmann, R., Ramaekers, A., Bockaert, J., Grau, Y., Broadie, K.
dan Parmentier, M.-L. ( 2004). Reseptor glutamat Drosophila metabotropic DmGluRA mengatur
fasilitasi sinaptik yang bergantung pada aktivitas dan morfologi sinaptik halus. J. Neurosci. 24, 9105-9116.
Chen, X. dan Ganetzky, B. ( 2012). Jalur pensinyalan neuropeptida mengatur pertumbuhan sinaptik
di Drosophila. J. Sel berbagai. 196, 529-543.
ARTIKEL PENELITIAN
Costantini, LM, Baloban, M., Markwardt, ML, Rizzo, M., Guo, F., Verkhusha,
VV dan Snapp, EL ( 2015). Palet protein fluoresen yang dioptimalkan untuk lingkungan seluler
yang beragam. Nat. Komun. 6, 7670.
Dermaut, B., Norga, KK, Kania, A., Verstreken, P., Pan, H., Zhou, Y., Callaerts,
P. dan Bellen, HJ ( 2005). Penyimpanan karbohidrat lisosom yang menyimpang menyertai cacat
endositik dan neurodegenerasi pada penghangat bangku Drosophila. J. Sel berbagai. 170, 127-139.
Di Sano, F., Bernardoni, P. dan Piacentini, M. ( 2012). Retikulon: penjaga struktur dan fungsi
retikulum endoplasma. Exp. Res sel. 318,
1201-1207.
Edwards, TL, Clowes, VE, Tsang, HTH, Connell, JW, Sanderson, CM,
Luzio, JP dan Reid, E. ( 2009). Spartin endogen (SPG20) direkrut ke endosom dan tetesan lipid
dan berinteraksi dengan ubiquitin E3 ligase AIP4 dan AIP5. Biochem. J. 423, 31-39.
Emptage, NJ, Reid, CA dan Fine, A. ( 2001). Penyimpanan kalsium dalam serangan sinaptik
hipokampus memediasi plastisitas jangka pendek, entri Ca2 + yang dioperasikan di toko, dan
pelepasan pemancar spontan. Neuron 29, 197-208.
Inggris, AR dan Voeltz, GK ( 2013). Struktur retikulum endoplasma dan interkoneksi dengan
organel lain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5,
a013227.
Fassier, C., Hutt, JA, Scholpp, S., Lumsden, A., Giros, B., Nothias, F.,
Schneider-Maunoury, S., Houart, C. dan Hazan, J. ( 2010). Atlastin ikan zebra mengontrol
motilitas dan arsitektur akson motorik tulang belakang melalui penghambatan jalur BMP. Nat.
Neurosci. 13, 1380-1387.
Feng, Y., Ueda, A. dan Wu, C.-F. ( 2004). Larutan seperti hemolimfa minimal yang dimodifikasi,
HL3.1, untuk rekaman fisiologis pada sambungan neuromuskuler larva Drosophila normal dan
mutan. J. Neurogenet. 18, 377-402.
Ferna ́ ńdez-Busnadiego, R., Saheki, Y. dan De Camilli, P. ( 2015). Arsitektur tiga dimensi dari situs
kontak membran plasma retikulum-plasma yang dimediasi sinaptotagmin diperpanjang. Proc.
Natl. Acad. Sci. Amerika Serikat 112,
E2004-E2013.
Fuentes-Medel, Y., Ashley, J., Barria, R., Maloney, R., Freeman, M. dan Budnik,
V. ( 2012). Integrasi sinyal retrograde selama pembentukan sinaps oleh ligan TGF-beta yang
disekresi glias. Curr. Biol. 22, 1831-1838.
Giordano, F., Saheki, Y., Idevall-Hagren, O., Colombo, SF, Pirruccello, M.,
Milosevic, I., Gracheva, EO, Bagriantsev, SN, Borgese, N. dan De Camilli,
P. ( 2013). PI (4,5) P (2) -dependent dan Ca (2 +) - interaksi ER-PM yang diatur dimediasi oleh
sinaptotagmin yang diperluas. Sel 153, 1494-1509.
Helle, SCJ, Kanfer, G., Kolar, K., Lang, A., Michel, AH dan Kornmann, B.
(2013). Organisasi dan fungsi situs kontak membran. Biochim. Biofis. Acta 1833, 2526-2541.
Howlett, E., Lin, CC-J., Lavery, W. dan Stern, M. ( 2008). Umpan balik negatif yang dimediasi
PI3-kinase mengatur rangsangan saraf. PLoS Genet. 4, e1000277.
Hu, J., Shibata, Y., Voss, C., Shemesh, T., Li, Z., Coughlin, M., Kozlov, MM,
Rapoport, TA dan Prinz, WA ( 2008). Protein membran retikulum endoplasma menginduksi
tubulus kelengkungan tinggi. Ilmu 319, 1247-1250.
Hu, J., Shibata, Y., Zhu, P.-P., Voss, C., Rismanchi, N., Prinz, WA, Rapoport,
TA dan Blackstone, C. ( 2009). Kelas GTPase mirip dinamin yang terlibat dalam pembuatan
jaringan ER tubular. Sel 138, 549-561.
Hu, J., Prinz, WA dan Rapoport, TA ( 2011). Menenun Jaringan Tubulus ER.
Sel 147, 1226-1231.
Huang, Y. dan Stern, M. ( 2002). Sifat in vivo dari transporter neurotransmitter inebriated-encoded
Drosophila. J. Neurosci. 22, 1698-1708.
Jahn, TR, Kohlhoff, KJ, Scott, M., Tartaglia, GG, Lomas, DA, Dobson,
CM, Vendruscolo, M. dan Crowther, DC ( 2011). Deteksi kelainan lokomotor dini pada model
Drosophilamodel Alzheimer ' penyakit. J. Neurosci. Metode
197, 186-189.
Jan, LY dan Jan, YN ( 1976). Properti persimpangan neuromuskuler larva di Drosophila
melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214.
Johnson, AE, Shu, H., Hauswirth, AG, Tong, A. dan Davis, GW ( 2015). Degenerasi otot yang
bergantung pada VCP dikaitkan dengan cacat pada jaringan lisosom tubular dinamis in vivo. Elife
4, e07366.
Jozsef, L., Tashiro, K., Kuo, A., Park, EJ, Skoura, A., Albinsson, S., Rivera-
Molina, F., Harrison, KD, Iwakiri, Y., Toomre, D. dkk. ( 2014). Reticulon 4 diperlukan untuk
tubulasi retikulum endoplasma, sambungan STIM1-Orai1, dan pemasukan kalsium yang
dioperasi. J. Biol. Chem. 289, 9380-9395.
Kerr, KS, Fuentes-Medel, Y., Brewer, C., Barria, R., Ashley, J., Abruzzi, KC,
Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, OE, Freeman, MR dan Budnik, V. ( 2014). Glial wingless / Wnt
mengatur pengelompokan reseptor glutamat dan fisiologi sinaptik pada sambungan
neuromuskuler Drosophila. J. Neurosci. 34, 2910-2920.
Kohlhoff, KJ, Jahn, TR, Lomas, DA, Dobson, CM, Crowther, DC dan
Vendruscolo, M. ( 2011). Sistem pelacakan iFly untuk lokomotor otomatis dan analisis perilaku
Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760.
Lee, Y., Paik, D., Bang, S., Kang, J., Chun, B., Lee, S., Bae, E., Chung, J. dan
Kim, J. ( 2008). Hilangnya atlastin gen paraplegia spastik menyebabkan kematian neuron
dopaminergik yang bergantung pada usia di Drosophila. Neurobiol. Penuaan 29, 84-94.
Lee, M., Paik, SK, Lee, M.-J., Kim, Y.-J., Kim, S., Nahm, M., Oh, S.-J., Kim, H.-
M., Yim, J., Lee, CJ dkk. ( 2009). Drosophila Atlastin mengatur stabilitas mikrotubulus otot dan
diperlukan untuk pengembangan sinaps. Dev. Biol. 330,
250-262.
Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
Liang, Y., Yuan, LL, Johnston, D. dan Gray, R. ( 2002). Kalsium memberi sinyal pada terminal
presinaptik serat berlumut tunggal di hipokampus tikus. J. Neurophysiol.
87, 1132-1137.
Llano, I., Gonza ́ ĺez, J., Caputo, C., Lai, FA, Blayney, LM, Tan, YP dan Marty,
SEBUAH. ( 2000). Penyimpanan kalsium presinaptik mendasari IPSC miniatur amplitudo besar
dan transien kalsium spontan. Nat. Neurosci. 3, 1256-1265.
Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, FM, Kawarai, T. dan Orlacchio, A.
(2014). Paraplegia spastik herediter: karakteristik klinis-genetik dan mekanisme molekuler yang
berkembang. Exp. Neurol. 261, 518-539.
Macleod, GT, Hegström-Wojtowicz, M., Charlton, MP dan Atwood, HL
(2002). Sinyal kalsium cepat di terminal neuron motorik Drosophila.
J. Neurophysiol. 88, 2659-2663.
Martin, AR ( 1955). Studi lebih lanjut tentang komposisi statistik dari potensi pelat-ujung. J. Physiol. 130,
114-122.
McCabe, BD, Marque ́ ś, G., Haghighi, AP, Fetter, RD, Crotty, ML, Haerry,
TE, Goodman, CS dan O ' Connor, MB ( 2003). Homolog BMP Gbb memberikan sinyal retrograde
yang mengatur pertumbuhan sinaptik di persimpangan neuromuskuler Drosophila. Neuron 39,
241-254.
McNew, JA, Sondermann, H., Lee, T., Stern, M. dan Brandizzi, F. ( 2013). Fusi membran yang
bergantung pada GTP. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 529-550.
Miyazono, K., Kamiya, Y. dan Morikawa, M. ( 2010). Reseptor protein morfogenetik tulang dan
transduksi sinyal. J. Biochem. 147, 35-51.
Moss, TJ, Daga, A. dan McNew, JA ( 2011). Menggabungkan hubungan yang langgeng antara
tubulus ER. Tren Biol Sel. 21, 416-423.
Nahm, M., Lee, M.-J., Parkinson, W., Lee, M., Kim, H., Kim, Y.-J., Kim, S., Cho,
YS, Min, B.-M., Bae, YC dkk. ( 2013). Spartin mengatur pertumbuhan sinaptik dan kelangsungan
hidup saraf dengan menghambat stabilisasi mikrotubulus yang dimediasi BMP. Neuron
77, 680-695.
Noreau, A., Dion, PA dan Rouleau, GA ( 2014). Aspek molekuler paraplegia spastik herediter. Exp.
Res sel. 325, 18-26.
HAI ' Connor-Giles, KM, Ho, LL dan Ganetzky, B. ( 2008). Bangkai saraf berinteraksi dengan
pembuluh darah tebal dan mesin endositik untuk melemahkan sinyal BMP retrograde selama
pertumbuhan sinaptik. Neuron 58, 507-518.
Orso, G., Pendin, D., Liu, S., Tosetto, J., Moss, TJ, Faust, JE, Micaroni, M.,
Egorova, A., Martinuzzi, A., McNew, JA dkk. ( 2009). Fusi homotipe membran ER membutuhkan
GTPase Atlastin seperti dinamin. Alam 460,
978-983.
HAI ' Sullivan, NC, Jahn, TR, Reid, E. dan O ' Kane, CJ ( 2012). Reticulon-like-1, theDrosophila
orthologue of the Heritary Spastic Paraplegia gene reticulon 2, diperlukan untuk organisasi
retikulum endoplasma dan akson motorik distal.
Bersenandung. Mol. Genet. 21, 3356-3365.
Ozdowski, EF, Gayle, S., Bao, H., Zhang, B. dan Sherwood, NT ( 2011). Hilangnya Drosophila
melanogaster p21-activated kinase 3 menekan kerusakan pada struktur sinaps dan fungsi yang
disebabkan oleh mutasi spastin. Genetika 189,
123-135.
Pe ́ d́elacq, JD, Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, TC dan Waldo, GS
(2006). Rekayasa dan karakterisasi protein fluoresen hijau superfolder. Nat. Biotechnol. 24, 79-88.
Pendin, D., McNew, JA dan Daga, A. ( 2011). Menyeimbangkan dinamika ER: membentuk,
membengkokkan, memutuskan, dan memperbaiki membran. Curr. Opin. Biol Sel. 23, 435-442.
Raiborg, C., Wenzel, EM, Pedersen, NM, Olsvik, H., Schink, KO, Schultz,
SW, Vietri, M., Nisi, V., Bucci, C., Brech, A. dkk. ( 2015a). Kontak ERendosom berulang
mempromosikan translokasi endosom dan hasil neurit.
Alam 520, 234-238.
Raiborg, C., Wenzel, EM dan Stenmark, H. ( 2015b). Kontak ER-endosom
situs: komposisi dan fungsi molekuler. EMBO J. 34, 1848-1858.
Rowland, AA, Chitwood, PJ, Phillips, MJ dan Voeltz, GK ( 2014). Situs kontak ER menentukan posisi
dan waktu fisi endosom. Sel 159,
1027-1041.
Sanyal, S., Consoulas, C., Kuromi, H., Basole, A., Mukai, L., Kidokoro, Y.,
Krishnan, KS dan Ramaswami, M. ( 2005). Analisis mutan paralitik bersyarat di Drosophila
sarco-endoplasmic reticulum kalsium ATPase mengungkapkan mekanisme baru untuk
mengatur rangsangan membran. Genetika 169,
737-750.
Schauder, CM, Wu, X., Saheki, Y., Narayanaswamy, P., Torta, F., Wenk, MR,
De Camilli, P. dan Reinisch, KM ( 2014). Struktur sinaptotagmin diperpanjang terikat lipid
menunjukkan peran dalam transfer lipid. Alam 510, 552-555.
Schmidt, I., Thomas, S., Kain, P., Risse, B., Naffin, E. dan Klambt, C. ( 2012). Fungsi rantai berat
Kinesin dalam sel glial Drosophila mengontrol aktivitas neuronal.
J. Neurosci. 32, 7466-7476.
Jurnal Ilmu Sel
Sepp, KJ dan Auld, VJ ( 1999). Konversi jalur perangkap penambah lacZ menjadi jalur GAL4
menggunakan transposisi tertarget pada Drosophila melanogaster. Genetika 151,
1093-1101.
Sherwood, NT, Sun, Q., Xue, M., Zhang, B. dan Zinn, K. ( 2004). Drosophila spastin mengatur
jaringan mikrotubulus sinaptik dan diperlukan untuk fungsi motorik normal. PLoS Berbagai. 2, e429.
Shibata, Y., Voeltz, GK dan Rapoport, TA ( 2006). Lembaran kasar dan tubulus halus. Sel 126, 435-439.
1647
ARTIKEL PENELITIAN
Shibata, Y., Hu, J., Kozlov, MM dan Rapoport, TA ( 2009). Mekanisme pembentuk membran organel
seluler. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25,
329-354.
Smith, MJ ( 1992). Urutan nukleotida dari gen Drosophila melanogaster yang mengkode homolog
calreticulin. Urutan DNA 3, 247-250.
Soboloff, J., Rothberg, BS, Madesh, M. dan Gill, DL ( 2012). Protein STIM: transduser sinyal kalsium
dinamis. Nat. Rev. Mol. Biol Sel. 13,
549-565.
Stefan, CJ, Manford, AG dan Emr, SD ( 2013). Koneksi ER-PM: situs transfer informasi dan
komunikasi antar-organel. Curr. Opin. Biol Sel. 25,
434-442.
Stewart, BA, Atwood, HL, Renger, JJ, Wang, J. dan Wu, C.-F.
(1994). Peningkatan stabilitas preparat neuromuskuler larva Drosophila dalam larutan
fisiologis mirip hemolimf. J. Comp. Physiol. SEBUAH 175, 179-191.
Sweeney, ST dan Davis, GW ( 2002). Pertumbuhan sinaptik tak terbatas pada spinster-protein
endosom akhir yang terlibat dalam regulasi pertumbuhan sinaptik yang dimediasi TGF-beta. Neuron sinaptik. Neuron 84, 764-777.
36, 403-416.
Terasaki, M., Shemesh, T., Kasthuri, N., Klemm, RW, Schalek, R., Hayworth,
KJ, Hand, AR, Yankova, M., Huber, G., Lichtman, JW dkk. ( 2013). Lembaran retikulum
endoplasma bertumpuk dihubungkan oleh motif membran helicoidal. Sel 154, 285-296.
Tsang, HTH, Edwards, TL, Wang, X., Connell, JW, Davies, RJ,
Durrington, HJ, O ' Kane, CJ, Luzio, JP dan Reid, E. ( 2009). Protein paraplegia spastik herediter
NIPA1, spastin dan spartin adalah penghambat pensinyalan BMP mamalia. Bersenandung. Mol.
Genet. 18, 3805-3821.
1648
Journal of Cell Science (2016) 129, 1635-1648 doi: 10.1242 / jcs.184929
Voeltz, GK, Prinz, WA, Shibata, Y., Rist, JM dan Rapoport, TA ( 2006). Kelas protein membran yang
membentuk retikulum endoplasma tubular. Sel 124,
573-586.
Wakefield, S. dan Tear, G. ( 2006). Retikulon Drosophila, Rtnl-1, memiliki beberapa isoform yang
diekspresikan secara berbeda yang terkait dengan sub-kompartemen retikulum endoplasma. Sel.
Mol. Life Sci. 63, 2027-2038.
Wang, X., Shaw, WR, Tsang, HTH, Reid, E. dan O ' Kane, CJ ( 2007). Drosophila spichthyin
menghambat pensinyalan BMP dan mengatur pertumbuhan sinaptik dan mikrotubulus
aksonal. Nat. Neurosci. 10, 177-185.
Westrate, LM, Lee, JE, Prinz, WA dan Voeltz, GK ( 2015). Bentuk mengikuti fungsi: pentingnya
bentuk retikulum endoplasma. Annu. Rev Biochem.
84, 791-811.
Wong, C.-O., Chen, K., Lin, YQ, Chao, Y., Duraine, L., Lu, Z., Yoon, WH,
Sullivan, JM, Broadhead, GT, Sumner, CJ dkk. ( 2014). Saluran ATRPV dalam neuron motorik
Drosophila mengatur tingkat Ca (2+) istirahat prasinaps, pertumbuhan sinapsis, dan transmisi
Xiong, NX, Pu, JZ, Zhao, HY dan Zhang, FC ( 2008). Pengaruh penghambatan gen Nogo-A pada
pelepasan dopamin di sel PC12. Neuro. Endokrinol. Lett. 29, 884-888.
Yang, YS dan Strittmatter, SM ( 2007). Retikulon: keluarga protein dengan fungsi yang beragam. Genome
Biol. 8, 234.
Yeh, E., Gustafson, K. dan Boulianne, GL ( 1995). Protein fluoresen hijau sebagai penanda vital dan
pelapor ekspresi gen di Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. Amerika Serikat 92, 7036-7040.
Zurek, N., Sparks, L. danVoeltz, G. ( 2011). Reticulon short hairpin transmembrane domain
digunakan untuk membentuk tubulus ER. Lalu lintas 12, 28-41.
Jurnal Ilmu Sel
J. Sel Sci. 129: doi: 10.1242 / jcs.184929: Informasi tambahan

Jurnal Ilmu Sel • Informasi tambahan

J. Sel Sci. 129: doi: 10.1242 / jcs.184929: Informasi tambahan

Gambar Tambahan 1. Ekspresi saraf motorik UAS-atl + menyebabkan agregasi

BiP-sfGFP-HDEL dan mengganggu pelepasan neurotransmitter. ( SEBUAH) Irisan confocal

sentral representatif dari badan sel neuron motorik dalam wt ( Ai) dan atl + ( B) Amplitudo EJP

rata-rata dan persentase keberhasilan yang sesuai untuk ekspresi saraf motorik UASatl +,

UAS-Rtnl1 +, atau UAS-atl +, Rtnl1 +. Rekaman dibuat di HL3.1 pada 0,1 mM Ca 2+

dari otot 6 di segmen A6. ( C) Rata-rata konten kuantitatif yang dikoreksi untuk genotipe yang ditunjukkan.

Rekaman dibuat di HL3 pada 1,5 mM Ca 2+ dari otot 6 di segmen A6. Untuk SEBUAH dan B, bar dan bar

kesalahan untuk masing-masing mewakili rata-rata dan kesalahan standar. Setiap titik data scattergram

adalah rata-rata dari 20 respons EJP pertama (keberhasilan dan kegagalan) yang dicatat untuk setiap larva.

nilai-p yang ditampilkan mewakili uji-t Siswa yang tidak berpasangan yang dilakukan dengan KaleidaGraph.

Jurnal Ilmu Sel • Informasi tambahan

J. Sel Sci. 129: doi: 10.1242 / jcs.184929: Informasi tambahan

Gambar Tambahan 2. Knockdown neuronal atl dan Rtnl1 meningkatkan arborisasi terminal saraf

motorik. ( SEBUAH) Z-proyeksi persimpangan neuromuskuler dari otot 6/7 di segmen A3. ( B) Bar

dan bar kesalahan masing-masing mewakili rata-rata dan kesalahan standar. Setiap titik data

scattergram adalah angka rata-rata pertandingan untuk satu larva. nilai-p yang ditampilkan

mewakili uji-t Siswa yang tidak berpasangan yang dilakukan dengan KaleidaGraph.

Jurnal Ilmu Sel • Informasi tambahan

 J. Sel Sci. 129: doi: 10.1242 / jcs.184929: Informasi tambahan

Gambar Tambahan 3. Ekspresi neuronal UAS-atl RNAi merusak penggerak dengan cara yang

bergantung pada usia. ( SEBUAH) Waktu rata-rata pejantan dewasa memanjat jarak vertikal 6

cm. Lalat yang tidak dapat memanjat 6 cm dalam waktu 60 detik diberi nilai 60.

(B) Kecepatan rata-rata pria dewasa setelah rangsangan bang. Berarti +/- SEM

diindikasikan.

Jurnal Ilmu Sel • Informasi tambahan

Viie
V. ew
wppu
ubblliicca.dlldin ssttaattss
attiio