LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

SEL GENETIKA & BIOLOGI

MOLEKULER

Isolasi DNA dengan bantuan alat Genomic DNA Midi

Kit dan spektrofotometri DNA Murni

Kelompok 4
Nama / NPM :
Anisa Ferli Yolanda/H1A016043
Syaikhah Fathinah Ridwan/H1A016049
Rahmatun Zakiyah/H1A019021
Frans William Hutagalung/H1A019043
Amalia Safa’atun Qolbi/H1A019045

Program Studi Kedokteran

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Universitas Bengkulu
Februari 2020
ISOLASI DNA

0
Tujuan

 Mengetahui metode isolasi dna secara umum

 Mengetahui metode isolasi dna dari sampel darah manusia
 Untuk dilanjutkan menggunakan PCR guna menggandakan DNA

Dasar Teori

Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pada proses
isolasi DNA ini, digunakan cara mekanik dan enzimatis dalam menghancurkan sel
eukariotik, karena disebabkan membran sel dari membran inti sebagian besar
tersusun atas lipida. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan
kecepatan yang bervariasi.

Prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam

nukleat dalam air dengan kata lain untuk mengendapkan protein histon, sehingga
DNA menjadi terlihat. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi
dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan
kelarutan DNA dalam air.

Macam-macam metode isolasi DNA :

a. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan pada amplikasi
dari segmen-segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal yang
sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak. Primer tunggal ini biasanya
berukuran 10 basa. PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang
memungkinkan primer menempel pada beberapa lokus pada DNA.

1
b. Metode CTAB
Menghasilkam pita DNA dari polisakarida karena adanya
perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping
diperolej fragmen DNA, dengan metode CATB juga akan diperoleh RNA
dengan pita tipis yang terletak jauh berada dibawah pita DNA.

c. Phenol-chloroform
Menggunakan senyawa Phenol-Choloroform-isoamyl alcohol.
Metode standart untuk ekstraksi DNA, akhir-akhir ini ditinggalkan, karena
sifat toksik phenol.

d. Salting Out
Menggunakan garam konsesntrasi tunggi (NaCl 6 M), untuk
mendenaturasi protein menggunakan Proteinase K untuk denaturasi
protein.

e. Guanidine Isothiocyanate.
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode sebelumnya,
Thiocyanate bersifat toksik, untuk kisis dinding sel, memerlukan
chloroform untuk denaturasi protein.

f. Silica Gel Silica

Gel yang depat mengikat DNA dengan perantaraan garam/buffer
tertentu (NaI), cepat, tetapi recovery DNA kurang.

g. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in
vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligunukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang
diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen
dengan DNA templatnya.

2
Prinsip Kerja

Mendapatkan DNA murni yang berasal dari whole human blood, dimana
DNA tersebut tidak tercampur dengan kontaminan dan komponen sel lainnya
seperti protein dan karbohidrat dengan menggunakan tahapan melisiskan,
mengikat, mencuci, dan mengelusi DNA.

Alat dan Bahan :

Alat :
1. Spuit 3 ml 6. Kuvet
2. Tourniquet 7. Vortex
3. Gelas reaksi 8. Microcentrifugator
4. Centrifuge tube 9. Inkubator
5. Mikropipet ukuran lengkap 10. Kulkas
(0,5-10 ul, 10-100 ul, 100-
1000 ul.)
Bahan :
1. Whole human blood 2 ml
2. Phospat Buffer Saline (PBS)
3. Etanol Absolute
4. RNase A 10mg/ml
5. Genomic DNA Midi Kit , yang berisi
Nama GDI02 GDI25
GB Buffer 5 ml 60 ml
W1 Buffer 5 ml 60 ml
Wash Buffer* 5 ml 25 ml
(ditambah etanol) (20 ml) (100 ml)
Proteinase K** 5 mg 55 mg
(tambahan H2O) (0,5 ml) (5,5 ml)
Elution Buffer 1 ml 30 ml
GD Midi Column 2 pcs 25 pcs

Cara Kerja

3
Tahap 1. Lisis Sel

1. Masukkan 2 ml whole human blood kedalam centrifuge tube 15 ml.

Apabila volume sampel kurang dari 2 ml, ditambahkan PBS dengan
volume yang sesuai
2. Tambahkan 200 ul Proteinase K kedalam tabung dan diguncang secara
perlahan
3. Masukkan campuran ke dalam mesin iinkubasi dan atur suhu 60oC selama
15 menit.. Setiap 3 menit, keluarkan tabung dan goyangkan.
4. Tambahkan 2 ml GB Buffer kedalam tabung dan guncang secara perlahan
5. Inkubasi kembali campuran pada water bath bersuhu 70oC selama 10
menit untuk memastikan sampel jernih. Goyangkan tabung setiap 3-5
menit.
6. Masukkan RNase A sebanyak 20 ul dan letak pada suhu ruangan selama
10 menit

Tahap 2. Pengikatan DNA

1. Tambahkan 2 ml Etanol Absolut pada sampel dan vortex selama 10 detik.

Apabila setelah di vortex muncul presipitasi atau terdapat endapan
kontaminan maka pecahkan dengan pipetting
2. Susun GD Midi Column pada centrifuge tube 50 ml
3. Pindahkan semua campuran kedalam GD Midi Column
4. Sentrifugasi pada 3000 x g selama 5 menit dengan set suhu 25oC
5. Buang cairan yang bersisa di bawah

Tahap 3. Pencucian DNA

1. Tambahkan 2 ml W1 Buffer kedalam GD Midi Column

2. Sentrifugasi pada 3000 x g selama 3 menit
3. Buang cairan pada dasar centrifuge tube dan letakkan kembali GD Midi
Columni pada centrifuge tube 50 ml
4. Tambahkan 4 ml Wash Buffer (ditambah etanol) kedalam GD Midi
Column

4
 5. Sentrifugasi pada 3000 x g selama 3 menit untuk membilasnya kembali
6. Buang kembali cairan pada dasar centrifuge tube dan diletakkan GD Midi
Column kembali pada centrifuge tube 50 ml
7. Sentrifugasi kembali pada 3000 x g selama 2 menit untuk mengeringkan
matriks Column

Tahap 4. Elusi DNA

1. Pindahkan GD Midi Column yang telah dikeringkan kedalam centrifuge

tube 50 ml bersih
2. Tambahkan 500 ul Elution Buffer yang telah dipanaskan atau TE kedalam
matriks Column
3. Inkubasi pada suhu 60oC selama 3 menit
4. Sentrifugasi pada 3000 x g selama 2 menit pada suhu ruangan untuk
mengelusikan DNA murni
5. Simpan ke dalam lemari es

Tahap 5. Spektrofotometri

1. Ambil 10 ul DNA murni dari 250 ul DNA hasil yg sudah elusi dengan
menggunakan mikropipet dan dimasukkan kedalam kuvet
2. Campurkan dengan aquades sebanyak 990 ul.
3. Dimasukkan kuvet kedalam alat spektrofotometri
4. Dijalankan alat spektrofotometri, dicatat panjang gelombang dan
absorbansi DNA

5
Hasil

Panjang Gelombang (nm) Absorbansi

A230 0,058
A260 0,049
A280 0,045
A320 0,038
Table 1. Hasil spektofotometri DNA murni

 PURITY = 1,57
( A 260−A 320)  Konsentrasi DNA
=
( A 280−A 320)
= (A260-A320) x 50 x Faktor Delusi
(0,049−0,038)
= = (0,049−0,038) x 50 x 100
(0,045−0,038)
= 0,011 x 50 x 100
0,011
=
0,007 = 55 µg/ml

 DNA yield
= Kosentrasi DNA x total volume
= 55 µg/ml x 0,25ml

= 13,75 µg

6
Pembahasan

Pada praktikum ini, didapatkan hasil spektrofotometri yang

menunjukkan absorbansi DNA murni pada panjang gelombang 320, 280, 260, dan
230 yaitu sebesar 0.039, 0.045, 0.049, dan 0.062. Rentang kemurnian DNA
dikatakan baik apabila berkisar antara 1,7-2,0. Berdasarkan hasil perhitungan,
didapatkan kemurnian DNA sebesar 1,57 , konsentrasi DNA 55 µg/ml dan
jumlah DNA sebesar 13,75 μg. Kemurnian DNA yang tidak optimal ini bisa saja
disebabkan karena adanya kontaminan pada sampel DNA murni, terlalu banyak
sampel darah yang digunakan, alat dan bahan yang kurang steril, langkah elusi
yang kurang tepat, dan metode yang kurang tepat. Namun demikian, DNA yang
didapatkan dari hasil isolasi DNA ini masih bisa digunakan pada proses PCR dan
elektroforesis.

Kesimpulan

1. Kemurnian DNA sample 2 ml whole blood cell sebesar 1,57 (kemurniaan

tidak optimal).
2. Konsentrasi DNA pada sampel 2 ml whole blood cell sebesar 55 µg/ml.
3. Jumlah molekul DNA pada sampel 2 ml whole blood cell sebanyak 13,75 µg.
4. Terdapatnya kontaminan, alat dan bahan yang kurang steril, langkah elusi
yang kurang tepat, atau metode yang kurang tepat sehingga mengakibatkan
kemurniaan yang kurang optimal dalam isolasi DNA.

Daftar Pustaka

Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA :

Thomson Brooks/Cole