Anda di halaman 1dari 15

16

2. METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi cawan petri, tabung

reaksi, rak tabung reaksi, clay triangle, autoklaf, inkubator, pH-meter, timbangan

digital, neraca analitik, cawan petri, mikro pipet, jarum ose, pengaduk magnet

(stirer), vortex, lemari pendingin, freezer, mortar dan alu, spatula bahan, pipet

volume, pipet serologis, bola hisap, tabung reaksi, rak tabung reaksi, bunsen, loop

ose, corong kaca, botol kaca, sprayer, washing bottle, kompor, dan panci,

spektrofotometer UV-VIS, LAF (Laminar Air Flow), erlenmayer 250 ml, pinset.

3.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahan utama

yaitu sedimen yang didapatkan dari kawasan pantai Buncaran, Malang Jawa

Timur. Media pertumbuhan yang digunakan adalah LBA (yeast extract 0,5%,

pepton 1%, Nacl 1%, agar bakteriologi 1,5%). NaCl, aquades, gelatin, beef

ekstrak, Agar bakteriologi, alkohol 70%, safranin, benang tali, kapas, spirtus, tisu,

kertas label, tusuk gigi, masker, sarung tangan, aluminium foil, plastik wrap, kertas.

3.2 Desain Penelitian

Desain Penelitian ini bersifat deskriptif eksploratif, dengan cara mengambil

isolat dari sedimen pantai yang diisolasi dengan media selektif LBA. Isolat bakteri

yang ditemukan selanjutnya diidentifikasi karakter morfologi dan karakter

biokimianya berdasarkan uji Microbact system. data hasil pengujian akan

dipaparkan secara deskriptif, juga data disiapkan dalam bentuk tabel.

Penelitian ini menggunakan metode penelitian deskriptif eksploratif.

Penelitian deskriptif melakukan analisis hanya sampai taraf deskripsi yaitu


17

menganalisis dan menyajikan data secara sistemik, sehingga dapat lebih mudah

dipahami dan disimpulkan sedangkan penelitian eksploratif adalah jenis penelitian

yang bertujuan untuk menemukan sesuatu yang baru berupa pengelompokan

suatu gejala, fakta dan penyakit tertentu. Penelitian deskriptif eksploratif bertujuan

untuk menggambarkan keadaan suatu fenomena, dalam penelitian ini tidak

dimaksudkan untuk menguji hipotesis tertentu tetapi hanya menggambarkan apa

adanya suatu variabel, gejala atau keadaan (Arikunto, 2010).

Pada metode deskriptif eksploratif ini sendiri digunakan untuk

mendapatkan data dan mengolah hasil yang didapatkan. Metode eksploratif yang

digunakan bertujuan untuk mengeksplor atau mendapatkan bakteri penghasil

enzim gelatinase terbaik pada sedimen pantai Buncaran dan jenis spesies bakteri

apa yang dapat menghasilkan enzim gelatinase. Sedangkan metode deskriptif

sendiri digunakan untuk mendeskripsikan hasil yang didapat secara deskriptif dan

sejelas-jelasnya. Hasil yang didapat digambarkan dengan kata-kata secara

deskriptif sehingga pembaca hasil penelitian ini dapat dengan mudah memahami

hasil dari penelitian ini.

3.3 Prosedur Penelitian

Pada penelitian ini terdapat beberapa tahapan prosedur penelitian yaitu

diantaranya adalah sampling dan tempat lokasi, preparasi sampel hingga analisa

protein gelatinase adalah penelitian tahap 1, dan pewarnaan gram hingga

identifikasi jenis bakteri menggunakan uji microbact system adalah penelitian

tahap 2.

3.3.1 Sampling dan Tempat Lokasi

Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel yang berasal

dari sedimen kawasan pantai Buncaran, Kabupaten Malang Jawa Timur dapat

dilihat pada gambar 10. Sampel sedimen diambil pada daerah muara yang
18

alirannya langsung menuju pantai dengan jarak 150 meter dari bibir pantai

sehingga sedimen berada dalam keadaan berair. Kemudian sedimen diambil

menggunakan sendok dengan kedalaman ±10cm kemudian dimasukan dalam

plastik lalu diikat dengan karet dan diberi label untuk kode sampel. Karakteristik

sampel sedimen yang diambil di Pantai Buncaran memiliki tekstur seperti lumpur

dan berwarna coklat, hal ini dapat disebabkan karena wilayah pengambilan

sampel adalah muara yang berlumpur. Setelah itu, sampel dimasukan kedalam

coolbox yang berisi bongkahan es dan kemudian ditutup rapat. Fungsi coolbox

yaitu untuk menjaga suhu didalam coolbox agar tetap dingin dan tidak terpengaruh

oleh suhu luar. Penggunaan es batu disini berfungsi untuk menghibernasi bakteri

agar tetap hidup sampai tiba dilaboratorium sehingga dapat diteliti. Setelah sampel

tiba dilaboratorium, sampel dipindahkan kedalam ruang pendingin dengan suhu

yang lebih konstan yaitu ± 40 C sampai sampel tersebut digunakan.

Gambar 1. Peta Lokasi Pengambilan Sampel

Pantai Buncaran adalah pantai di pesisir selatan pulau Jawa yang tepat di

berada di desa Sidurejo, Kecamatan Gedangan, Kabupaten Malang, Jawa Timur


19

dengan titik koordinat -8.416053, 112.594975. Pantai ini berjarak sekitar 63 km

dari Kota Malang. Sebelah timur berbatasan dengan Pantai Kletekan, sebelah

barat berbatasan dengan Pantai Gragalan, sebelah selatan berbatasan dengan

Samudera Hindia dan sebelah utara berbatasan langsung dengan Kabupaten

Malang.

3.3.2 Penelitian Tahap 1

a. Preparasi Sampel

Sampel sedimen yang akan digunakan dikeluarkan dari lemari pendingin

kemudian ditimbang sebanyak 1 gram sebagai sampel dan diangin-anginkan di

atas kertas saring dengan tujuan mengurangi kandungan air dan agar sampel

sedimen dapat lebih terpisah dan tidak bergerombol padat, karena jika sampel

tetap padat bergerombol akan membuat sampel susah homogen saat proses

pengenceran.

b. Sterilisasi Alat

Proses sterilisasi alat menurut Dwidjoseputro (1998), sterilisasi alat

menggunakan autoklaf, yaitu alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan

uap. Medium yang akan disterilkan di tempatkan di dalam tangki autoklaf ini

selama 15 sampai 20 menit, hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya barang

yang perlu disterilkan. Jika medium yang akan di sterilisasi banyak ditempatkan

dalam beberapa botol yang agak kecil daripada disatukan dalam botol yang agak

besar. Setelah itu pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka,

dan temperatur akan terus-menerus naik sampai 121oC. Biasanya autoklaf sudah

diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan ada sebesar 15 lbs

(pounds) per inch persegi yang berarti 1 atmosfer 1 cm2.. perhitungan waktu 15-20

menit dimulai semenjak autoklaf menunjukkan 121oC. Setelah waktu cukup maka

kran uap ditutup dan suhu akan turun bertahap begitu juga tekanannya. Autoklaf
20

tidak boleh dibuka langsung agar isi dalam botol tidak keluar. Maka harus

menunggu hingga suhu dan tekanan menunujukkan angka nol. Setelah suhu dan

tekanan nol kita dapat membuka autoklaf dan mengeluarkan media beserta alat

yang di sterilisasi. Jika media yang di sterilisasi mengandung vitamin, gelatin dan

turunan gula harus segera di dinginkan untuk menghindari terurainya zat-zat

tersebut. Peralatan yang perlu disterilisasi adalah cawan petri, tabung reaksi,

erlenmeyer, bluetip, kapas.

c. Pembuatan Media LBA

Pertama semua bahan disiapkan termasuk untuk membuat media LBA,

komposisi media tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 1. Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA)

Komposisi
Bahan Kimia
media
Yeast extract 5gr/l
Pepton 10gr/l
NaCl 10gr/l
Agar 15 gr/l
Aquades 1l
Sumber : Miller (2012)

Bakteri yang akan diisolasi membutuhkan medium untuk kelangsungan

hidupnya. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri adalah Luria

Bertani Agar (LBA) . Berikut merupakan komposisi media per liter akuades, yang

akan digunakan sebagai isolasi bakteri. Pembuatan media LBA sebagai berikut:

komposisi LBA per liter akuades terdiri dari 5 gram , pepton 10 gram, NaCl 10

gram dan agar 15 gram, yang dilarutkan dengan akuades dalam gelas erlenmayer,

kemudian distirer hingga homogen dan direbus dengan air mendidih selama 15

menit agar media lebih homogen. Setelah itu, media disterilkan dengan autoklaf

pada suhu 121ºC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit (Miller, 2012).
21

d. Pembuatan NaFis

Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan NaFis.

Larutkan NaCl 9 gram dalam 1 liter aquadest dan dihomogenkan sehingga larutan

NaCl larut dalam aquadest. Selanjutnya diambil sebanyak 9 ml dengan

menggunakan pipet volume masukan kedalam tabung reaksi, ditutup dengan

menggunakan kapas dan alumunium foil dan terakhir disterilisasi menggunakan

autoklaf dengan suhu 121 oC tekanan 1 atm selama 15 menit.

e. Pengenceran dan Penanaman

Proses pengenceran pada media LBA ini dilakukan di LAF (Laminar Air

Flow) aseptis. Semua peralatan yang sudah disterilisasi dimasukkan kedalam

LAF, kemudian sinar UV pada LAF dinyalakan selama 30 menit dengan tujuan

untuk pengkondisian aseptis, kemudian dilakukan pengenceran bertingkat.

Pengenceran dilakukan dengan menggunakan larutan Nafis dari 10-1 hingga 10-5.

Pengenceran dilakukan pada tabung reaksi yang berisi larutan Nafis sebanyak 9

ml. Setelah itu, masing-masing sampel sedimen ditimbang sebanyak 1 g.

Kemudian dilakukan pengenceran dari 10-1 hingga 10-5. Tujuan dari pengenceran

adalah supaya diperoleh isolat yang tidak begitu padat dan mewakili semua jenis

bakteri yang terdapat pada sampel. Pengenceran dilakukan dengan mengambil 1

g sampel sedimen lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 10 ml NaFis

(pengenceran 10-1) kemudian dihomogenkan dengan dipilin. Selanjutnya, pipet 1

ml sampel dari tabung pengenceran 10-1, lalu dimasukkan ke dalam tabung

pengenceran 10-2 , dan dihomogenkan dengan dipilin. Mengulangi prosedur

pengenceran hingga 10-5. Pipet yang digunakan untuk mengambil dan

memindahkan 1 ml larutan harus berbeda, satu pipet untuk satu kali perlakuan

pengenceran (Romadhon et al., 2012).

Setelah proses pengenceran dilakukan, selanjutnya proses penanaman

(plating). Penanaman pada sampel dari pengenceran 10-3 sampai 10-5 pada media
22

Luria Bertani Agar (LBA). dengan metode sebar (spread plate) yaitu dengan

menuangkan sampel pada media yang sudah memadat. Selanjutnya, cawan petri

steril yang sudah disiapkan diberi label sesuai dengan tingkat pengenceran. Media

yang masih hangat dituang kedalam masing-masing cawan petri sebanyak ± 20

ml untuk masing-masing cawan sesuai label yang diberikan, dan ditunggu sampai

mengejel. Setelah itu, dari pengenceran 10-3 sampai 10-5, larutan sampel diambil

menggunakan pipet tetes masing-masing sebanyak 1 ml, lalu diteteskan pada

media sesuai tingkat pengenceran. Larutan sampel dihomogenkan dengan

menggunakan clay triangle. Kemudian tepian dari cawan petri dibungkus dengan

plastic wrap untuk menjaga tetap aseptis. Kemudian, dilakukan inkubasi pada

suhu 37 oC selama 18 – 72 jam. Kemudian dilakukan pengamatan pada setiap

cawan (Todorov dan Dicks, 2004).

Kemudian dilakukan pemisahan dan pemurnian isolat bakteri dilakukan

dengan metode gores kuadran (streak method) 3 kuadran. Menurut Rinto et al.,

(2010), prinsip utama goresan kuadran yaitu mengusahakan agar koloni satu

dengan yang lain terpisah menjadi koloni tunggal sehingga mudah untuk

diidentifikasi. Tahap ini dilakukan dengan cara membagi cawan menjadi 3 bagian.

Goresan dilakukan 3 kali membentuk pola zig-zag. Tentukan koloni bakteri yang

akan dipurifikasi, masing-masing cawan petri pada setiap pengenceran koloni

bakteri yang menampakkan morfologi dan warna yang berbeda. Siapkan cawan

petri dan nyalakan bunsen, kemudian sterilkan jarum ose yang digunakan untuk

memisahkan koloni dengan cara memijarkan langsung ke api di bunsen. Goreskan

jarum ose ke sumber koloni, buka sedikit media LBA lalu goreskan dengan metode

streak, sampai kuadran 3 dan tetap dekat dengan bunsen. Tutup kembali cawan

dan beri label. Kemudian, diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama 18 – 72 jam

dan diamati pertumbuhannya. Bakteri yang ditumbuhkan dengan metode streak


23

akan membentuk koloni tunggal. Setelah didapatkan kultur murni kemudian,

dilakukan pemeliharaan (Yulvizar, 2013).

Proses peremajaan isolat bakteri bertujuan untuk memperbanyak jumlah

biakan dan mencegah terjadinya kontaminasi pada biakan induk. Kultur murni dari

isolat bakteri tersebut dipindahkan ke dalam media agar miring LBA pada tabung

reaksi dengan teknik goresan. Penggunaan agar miring adalah untuk

mempermudah penggoresan isolat koloni. Dilakukan dengan cara memiringkan

media, mempunyai tujuan untuk memperluas permukaan pada media yang akan

ditumbuhi oleh koloni. Selain itu, memudahkan untuk melihat hasil penanaman

bakteri. Tahapan pembuatan media agar miring dapat dilakukan dengan cara

memasukkan media cair yang masih hangat ke dalam tabung reaksi. Kemudian,

tabung reaksi dimiringkan 45º, dan biarkan beberapa saat hingga memadat.

Kemudian ambil kultur bakteri, peremajaan bakteri dilakukan didalam LAF untuk

meminimalisir kontaminasi. Lalu hidupkan api bunsen di tempat peremajaan dan

bakar jarum ose sampai berpijar kemudian angin-anginkan. Lepaskan kapas pada

kultur bakteri di dekat nyala api, ambil kultur dengan jarum ose dan goreskan pada

agar miring secara zig-zag mulai dari bagian dasar tabung. Tutup kembali dengan

kapas dan lakukan di dekat api supaya tidak terkontaminasi. Jarum ose yang telah

dipakai, dipanaskan sampai membara untuk membunuh bakteri yang menempel

pada ose. Lakukan pada semua kultur bakteri dan diinkubasi ke dalam inkubator

pada suhu 37 oC selama 24 jam. Perlakuan harus dilakukan secara aseptik,

berada di dekat api (maksimum berjarak 20 cm dari api) agar tidak terjadi

kontaminasi. Setelah itu koloni yang tumbuh pada agar miring dipindah ke suhu 4
o
C, Pemindahan dan pemeliharaan kultur dilakukan tiap 4 minggu sekali dengan

cara mentransfer kultur murni tersebut ke dalam media agar miring yang baru.
24

f. Skrining Gelatinase

Menurut Dela Cruz dan Jeremy (2016), uji gelatinase dilakukan untuk

mengetahui bakteri dapat menghasilkan gelatinase atau tidak. Uji gelatinasi

diawali dengan pesiapan media dan peralatan. Media yang digunakan yaitu media

gelatin. Cara membuat media gelatin yaitu timbang pepton 5 gram/liter beef

ekstrak 3 gram/liter dan gelatin sebanyak 120 gram/liter, lalu dilarutkan dengan

aquades 1000 ml didalam erlenmeyer. Selanjutnya larutan dipanaskan diatas

hotplate dan diaduk dengan menggunakan spatula sampai homogen. Setelah

selesai media dituangkan kedalam tabung reaksi sebanyak 10 ml pada masing-

masing tabung dan kemudian ditutup dengan menggunakan kapas. Selanjutnya

media dalam tabung di sterilisasi menggunakan autoklaf suhu 1210 C dan tekanan

0,15 Mpa selama 15 menit. Seterilisasi bertujuan untuk membunuh semua

mikroorganisme yang tidak diinginkan pada media gelatin dan penutupan tabung

menggunakan kapas bertujuan agar tidak terjadi kontaminasi media oleh udara

luar.

Sebelum dilakukan uji gelatinase media yang sudah steril dalam tabung

reaksi ditunggu hingga dingin untuk mencegah bakteri mati ketika dimasukkan

dalam media gelatin. Kemudian media dan peralatan dimasukan kedalam LAF

selama 30 menit. Proses ini bertujuan untuk menghilankan mikroorganisme

dengan menggunakan sinar UV dalam media ataupun peralatan. Uji gelatinase

dilakukan dalam laminaran dan pengkondisian aseptis juga diterapkan seperti

penyalaan bunsen, penggunaan sarung tangan, penggunaan masker dan

penyemprotan alkohol pada tangan.

Setelah media dan peralatan siap, dilakukan pengambilan bakteri dalam

kultur murni dengan menggunakan jarum ose lop. Setelah bakteri didapat, lalu

dimasukan kedalam media gelatin dengan sedikit digoyangkan agar bakteri dapat

berpindah kemedia gelatin. Saat memasukkan bakteri ke media gelatin jangan


25

sampai jarum ose loop mengenai dinding dari tabung reaksi. Setelah itu diinkubasi

pada suhu ruang selama 18-24 jam. Untuk mengetahui hasil uji gelatinase

dilakukan pengujian setiap harinya hingga hari ketujuh karena setiap bakteri

memiliki titik pertumbuhan yang berbeda maka setiap hari harus di uji gelatinase.

Cara uji gelatinase yaitu dengan memasukkan ke dalam lemari es selama 30

menit, jika setelah keluar dari lemari es kondisi media gelatinase saat dimiringkan

mencair maka bakteri tersebut positif menghasilkan enzim gelatinase. Jika setelah

keluar dari lemari es media menjadi padat maka bakteri tersebut negatif

menghasilkan enzim gelatinase.

3.3.3 Penelitian Tahap 2

Penelitian pada tahap dua ini adalah proses identifikasi bakteri. Identifikasi

bakteri menggunakan uji microbact system.

a. Pewarnaan Gram

Kaca objek dibersihkan dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada

nyala api bunsen, kemudian diambil isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptik

dan dioleskan pada kaca objek. Isolat bakteri kemudian ditetesi ungu violet dan

dibiarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dianginkan

hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi lagi dengan larutan iodine dan

dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dianginkan

hingga kering. Selanjutnya isolat bakteri ditetesi alkohol 95% selama 30 detik,

kemudian dialiri air dan dianginkan hingga kering. Isolat bakteri kemudian ditetesi

safranin selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dengan

kertas penghisap dan dikering anginkan, kemudian dilakukan pengamatan dengan

menggunakan mikroskop. Bakteri gram positif ditandai dengan warna ungu yang

menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna kristal violet,

sedangkan bakteri gram negatif ditandai dengan warna merah muda yang
26

menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak mampu mengikat warna kristal violet

dan hanya terwarnai oleh safranin (pewarna tandingan) (Hadioetomo, 1993).

b. Uji Microbact system

Isolat bakteri yang akan diidentifikasi disiapkan terlebih dahulu. Sebelum

ditentukan menggunakan 12B/12E atau 24E, koloni bakteri dilakukan uji oksidase,

jika hasil oksidase negatif menggunakan Microbact system 12B/12E saja,

sedangkan jika hasil oksidasenya positif maka menggunakan 24E. Bakteri 44 gram

negatif menggunakan Microbact 12E, sedangkan bakteri gram positif

menggunakan Microbact 12B. Kemudian seluruh perangkat Mikrobact 12B

disiapkan, satu koloni bakteri yang telah diinkubasi selama 18-24 jam diambil

kemudian dilarutkan kedalam 3-6 ml garam fisiologis pada tabung reaksi steril

hingga homogen. Larutan bakteri yang telah homogen diteteskan kedalam sumur

Microbact sebanyak 100 UI (4 tetes), untuk sumur Lysin, Omitin, dan H2S

ditambah dengan tetesan mineral oil sebanyak 1-2 tetes. Setelah itu Microbact

diinkubasi pada suhu 37 C selama 18 -24 jam. Microbact yang telah diinkubasi

diambil kemudian diteteskan 2 tetes reagent Nitrat A dan B pada sumur 7, pada

sumur nomor 8 dengan Indol Kovact sebanyak 2 tetes, sumur nomor 10 dengan

VP I dan VP II masing - masing satu tetes, dan sumur 12 dengan TDA sebanyak

satu tetes. Perubahan warna tes pada tiap sumur yang berbeda dicatat

(Oxoid,2004).

1. Uji motilitas.

Isolat bakteri ditusukkan ke dalam media SIM semi padat pada tabung reaksi

menggunakan jarum ose tusuk steril. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada

suhu 37ºC. Uji positif ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka

bakteri tersebut bergerak (motil) dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebarkan
27

hanya berupa satu garis, maka bakteri tersebut tidak bergerak atau non motil

(Sudarsono, 2008).

2. Uji oksidase

Uji oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya sitokrom oksidase yang

dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Pertama, biakan ditumbuhkan

pada media NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 300C. Kemudian

ditambahkan reagen uji oksidase yang terdiri dari campuran 1 % larutan α-naftol

dan 1% larutan p-fenilendiamin oksalat pada koloni bakteri dan kemudian

didiamkan selama 30 menit. Hasil uji dinyatakan positif apabila berwarna hitam

(Lay, 1994)

3. Uji nitrat

Penggunaan uji nitrat adalah untuk menguji kemampuan mikroorganisme

yang dapat tumbuh pada media yang mengandung pepton sebagai sumber

nitrogen. Cara kerja dari pengujian ini adalah isolat ditumbuhkan pada media yang

mengandung KNO3. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.

Selanjutnya ditambahkan larutan asam sulfanilat dan larutan alfa-naftilamin, dan

dilihat reaksinya. Pada umumnya, pada medium agar milk, isolat akan tumbuh

berbentuk bulat dengan warna yang bermacam dan besar diameternya berdeda-

beda (Wedhastri, 2002).

4. Uji ornitin

Pada pengujian ini kita menggunakan media MIO untuk dapat mengetahui

reaksi terhadap ornitin, dapat juga digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya

pergerakan bakteri yang diuji serta kemampuan bakteri tersebut dalam penghasil

indol (Wahyunio, 2011).

5. Uji H2S

Uji H2S digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam

menghidrolisis logam berat yang terdapat pada media biakan. Hasil uji ini
28

dinyatakan positif apabila terjadinya pembentukan warna hitam pada media. Cara

kerja yang digunakan adalah dengan menanam isolat pada media TSIA (Tripe

Sugar Iron Agar) (Didje et al., 2006).

6. Uji urease

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah suatu bakteri dapat

menghidrolisis atau mendegradasi urea dengan enzim urasea. Isolat pertama

ditumbuhkan pada media yang mengandung urea. Beberapa bakteri mampu

menghasilkan enzim urease dengan menguraikan urea menjadi amonium dan

C02. Uji ini dinyatakan positif apabila terjadi perubahan warna dari warna merah

jingga menjadi merah ungu (Ramdany, 2008).

7. Uji indol

Diambil satu koloni terpisah dengan menggunakan jarum ose, kemudian

diinokulasi ke dalam media SIM dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC.

Setelah inkubasi ditambahkan 10-12 tetes reagen Kovac. Uji positif ditandai

dengan terbentuknya lapisan berwarna merah di bagian atas biakan (Hadioetomo,

1993).

8. Uji V-P

Uji V-P (Vogues-Proskauer) digunakan untuk menguji kemampuan bakteri

atau mikroorganisme untuk bereaksi dengan asetonin dan oksigen dan

menghasilkan fermetasi akhir berupa asetil metil karbinol. Cara kerja uji ini adalah

isolat ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa dan inkubasi selama

48 jam pada suhu 37 0C. Lalu dilakukan penambahan reagen KOH 40% dan 15

tetes larutan alpha naphtol (Ramdany, 2008).

9. Uji katalase

Diletakkan 2 tetes H2O2 pada kaca objek yang bersih. Isolat bakteri diambil

menggunakan jarum ose, kemudian dipindahkan ke atas kaca objek dan

dicampurkan. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung


29

oksigen yang menunjukkan bahwa organisme yang bersangkutan menghasilkan

enzim katalase yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen

(Hadioetomo, 1993).

10. Uji sitrat

Uji sitrat ini digunakan untuk mengetahui dan menguji apakah bakteri atau

mikroorganisme mampu memfermentasikan asam sitrat sebagai sumber karbon

satu-satunya pada media. Biasanya terjadinya fermentasi asam sitrat dengan

adanya perubahan warna pada media menjadi biru perusi yang dinyatakan dengan

hasil yang positif. Apabila tidak terjadi perubahan warna maka hasil yang

didapatkan adalah negatif. Bakteri yang mengalami perubahan warna

menandakan bahwa bakteri tersebut memiliki enzim sitrat yang merupakan enzim

yang spesifik pembawa sitrat menuju kedalam sel (Ramdany,2008).

11. Uji lisin

Uji lisin digunakan untuk mengetahui reaksi bakteri terhadap asal amini dan

selain itu pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri yang diperiksa

akan membentuk asam sulfida dan terjadi perubahan pH pada media (Wayan dan

Qomariah, 2007).

12. Uji arginin

Pada pengujian arginin cara kerja yang dilakukan hampir sama dengan kerja

uji lisin. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui reaksi apakah yang terjadi pada

bakteri terhadap asam amino yang lebih kompleks. Apabila uji ini dinyatakan positif

maka bakteri mampu bereaksi dengan asam amino dan apabila bakteri

mendapatkan hasil negatif maka bakteri tidak mampu bereaksi dengan asama

mino kompleks (Ramdany,2008).

13. Uji gula-gula

Uji gula-gula digunakan untuk mengetahui kemampuan suatu mikroorganisme

dalam mendegradasi dan memfermentasikan karbohidrat yang akan disertai


30

dengan adanya pembentukan asam maupun gas yang meliputi glukosa, sukrosa,

laktosa, manitol, galaktosa, dan maltose (Tedja, 2007)