Anda di halaman 1dari 22

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

ISOLASI DNA BAKTERI ASAM LAKTAT DAN ELEKTROFORESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian tugas mata kuliah Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Disusun oleh :

Tri Purwa Ningrum (18308141064)

Biologi F 2018

PROGRAM STUDI BIOLOGI


JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2021
BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Biologi sel dan molekuler merupakan bidang ilmu yang terus menerus
berkembang. Berbagai disiplin ilmu bergerak bersama dalam proses pengembangan
teknik yang digunakan dalam penelitian biologi molekuler. Ilmu ini bermanfaat hampir
di semua bidang. Sejalan dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi,
seluruh unit kegiatan manusia tidak bisa terlepas dari analisis tingkat molekuler yang
melibatkan asam nukleat (DNA). DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi
genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologi seluruh bentuk kehidupan
secara seluler.
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi
atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi
atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008). DNA pada makhluk
hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pada prinsipnya isolasi DNA dapat dilakukan
dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, serangga,
kalus, akar, batang, daging dan sisik ikan. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan
DNA dari partikel-partikel lainnya seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya.
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-
akhir ini semakin maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Isolasi DNA
merupakan langkah mempelajari DNA. Isolasi DNA merupakan teknik dasar dari
bioteknologi dan biomolekular yang harus dikuasai di laboratorium. Isolasi DNA
berguna untuk beberapa analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti genom editing,
transformasi dan PCR. Selain itu pengujian secara visual melalui elektroforesis juga
penting untuk dipelajari.
Melihat begitu banyak teknik dan metode untuk isolasi DNA, praktikum ini
dianggap penting untuk memahami sekaligus dapat menentukan dengan tepat metode
isolasi dengan hasil maksimal untuk memperolah substansi genetik pada Bakteri Asam
Laktat dan hasil visualisasi elektroforesisnya.
A. Tujuan
1. Mengetahui tahapan-tahapan dan bahan yang digunakan dalam proses isolasi
DNA Bakteri
2. Mengetahui tahapan-tahapan dan bahan yang digunakan dalam proses
elektroforesis
3. Mengetahui cara membaca visualisasi DNA Bakteri
BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Bakteri Asam Laktat (BAL)


Bakteri asam laktat (BAL) adalah kelompok bakteri Gram–positif berbentuk
batang atau bulat yang tidak membentuk spora, bersifat katalase negatif dan dapat
memfermentasikan karbohidrat dengan hasil utamanya adalah asam laktat (Axelsson,
1998 dalam Suryani et al., 2010). Bakteri asam laktat dapat ditemukan di lingkungan
yang bervariasi seperti tanah, berbagai jenis makanan (susu, daging, sayuran), dan
tubuh manusia (Surono, 2004). Organisme ini bersifat heterotropik dan umumnya
membutuhkan nutrisi yang kompleks selama pertumbuhan dan perkembangannya
(Reddy, 2008). BAL merupakan bakteri yang biasa digunakan sebagai probiotik karena
bersifat nonpatogenik dan nontoksigenik. BAL biasanya memproduksi bakteriosin
yang merupakan peptida dengan sifat sebagai antibakteri (Marnila 2016). Selain
kemampuannya dalam menghambat bakteri patogen, bakteriosin tidak membahayakan
flora normal usus karena mudah dicerna oleh enzim-enzim pencernaan (Rustan 2013).
B. Definisi DNA
Secara Bahasa, Deoxyribo nucleic Acid (DNA) tersusun dari kata-kata
“deocyribosa” yang berarti gula pentosa, “nucleic” yang lebih dikenal dengan nukleat
berasal dari kata “nucleus” yang berarti inti serta “acid” yang berarti zat asam. Secara
terminologi DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting, yang
membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam
keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya.

Gambar 1. Struktur dan Komponen Untai Ganda DNA


Sumber : http://eprints.undip.ac.id/
Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah polimer asam nukleat yang tersusun
secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada
keturunannya. Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang
basa nukelotida. Secara struktural, DNA merupakan polimer nukleotida, di mana setiap
nukelotida tersusun atas gula deoksiribosa, fosfat, dan basa. Polimer tersebut
membentuk struktur dua untai heliks ganda yang disatukan oleh ikatan hidrogen antara
basa-basa yang ada. Terdapat empat basa dalam DNA, yaitu adenin (A), sitosin (C),
guanin (G), dan timin (T). Adenin akan membentuk dua ikatan hidrogen dengan timin,
sedangkan guanin akan membentuk tiga ikatan hidrogen dengan sitosin.
DNA pada makhluk hidup dapat ditemukan pada inti sel (nukleus), mitokondria,
dan klorofil. DNA pada nukleus berbentuk linear dan memiliki jumlah pasang basa
sekitar tiga milyar, sedangkan DNA yang berada di mitokondria (mtDNA) berbentuk
sirkuler dan memiliki jumlah pasang basa lebih sedikit yaitu sekitar 160.000. Namun,
apabila terjadi mutasi pada DNA mitokondria, dapat terjadi kerusakan pada sistem yang
peka terhadap kebutuhan energi seperti sistem saraf dan otot.
C. Definisi Isolasi DNA
DNA dari berbagai organisme dapat diisolasi. Isolasi DNA dilakukan dengan
tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Ekstrak tersebut kemudian dipurifikasi dan menghasilkan pelet sel yang mengandung
DNA/RNA. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan
akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin
yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.
D. Tahapan Isolasi DNA
Tahapan-tahapan dalam isolasi DNA diantaranya, yaitu :
1. Preparasi Sampel
Preparasi sampel dapat diawali dengan proses isolasi bakteri dari lingkungan
(alam sekitar) menjadi kultur murni dalam media penelitian. Dalam hal ini,
preparasi sampel yang dilakukan yaitu isolasi bakteri asam laktat yang
ditumbuhkan pada media MRS cair. Preparasi DNA yang panjang dan murni
merupakan sesuatu yang sangat diharapkan. Tekanan yang dibutuhkan untuk
membuka dinding sel juga dapat memotong DNA, sehingga diperlukan
tindakan yang harus sungguh-sungguh menjaga DNA yang dihasilkan dan
panjangnya.
2. Lisis (ekstraksi)
Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang
bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan
memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel
dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan
menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan
menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan
kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada
membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel.
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan
sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen
tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan
dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim
pendegradasi DNA. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase
K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein
globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Holt, 1994).
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent
seperti Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) yang berperan
menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi,
EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium
dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse. DNA yang telah
diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan
komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA
yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
Perlakuan sentrifugasi akan membentuk 2 fase yang terpisah yakni fase
organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan
DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan
protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada
fase organik. Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform
atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi
protein.
3. Presipitasi DNA
Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi
protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan.
Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan
dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan
lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Pada tahapan
presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA
dan protein yang masih tersisa.
4. DNA Binding
Tahapan DNA binding diartikan sebagai proses pengikatan DNA. Tahapan ini
dilakukan ketika tube sampel mulai dimasukkan ke dalam CB3 Coloumn
(tabung penyaring). Kemudian CB3 Coloumn disentrifuge selama 2 menit
(12.000 rpm), cairan yang tertampung dalam collection tube dibuang.
5. Pencucian (Purifikasi)
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat
lainnya. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA
sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian
RNAse. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat
dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk
menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
6. Elusi DNA
Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan
fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal
ini penting dalam rekayasa genetika karena fragmen tersebut dapat digunakan
untuk melacak atau mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke
fragmen DNA lainnya. Fragmen ini diperoleh melalui beberapa tahap. Tahap
pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya
dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR yang
dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya
adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang
mengandung fragmen tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen
DNA dari gel agarose. Teknik isolasi atau disebut juga teknik preparasi gel
elektroforesis merupakan teknik isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa
(Brown, 1991).
E. Elektroforesis
Elektroforesis merupakan metode yang digunakan dalam praktikum ini untuk
memaparkan uji kualitas DNA yang diisolasikan dengan memvisualisasikannya
menggunakan elektroforesis kit beserta aplikasi Gel Documenter. Teknik elektroforesis
adalah teknik pemisahan senyawa berdasarkan kecepatan migrasi dari senyawa yang
bermuatan listrik di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel merupakan salah
satu teknik utama dalam biologi molekular dan merupakan metode standar untuk
pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen DNA.
Prinsip dasar teknik ini adalah Deoxyribonucleotid Acid (DNA), Ribonucleotid
Acid (RNA), atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-
molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di
dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan, konsentrasi gel agarosa, tegangan listrik yang diberikan, dan konformasi
DNA. DNA bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan
bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif.
Gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan
konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan
silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga
berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari
beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang
sudah dimurnikan. Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam elektroforesis
bervariasi antara 0,7 % - 1.5%. Biasanya konsentrasi gel 0,8% - 1% sangat baik untuk
memisahkan fragmen DNA berukuran 1- 20.000 pasang basa. Konsentrasi gel kurang
dari 0,5% dapat meningkatkan daya pisah elektroforesis namun sangat rapuh dan sulit
ditangani. Etidium bromida dapat ditambahkan ke suspensi DNA untuk tujuan
visualisasi hasil elektroforesis (pita-pita DNA dapat dideteksi di bawah sinar UV).
Perlengkapan alat elektroforesis terdiri dari :
1. Cetakan gel yang digunakan untuk membuat gel agarosa.
2. Alat pencetak sumur yang digunakan untuk membuat sumur-sumur pada sisi
atas dari gel agarosa, yaitu tempat memasukkan DNA ke dalam gel.
3. Tangki elektroforesis.
4. Sumber arus.
Gambar 2. Perangkat Elektroforesis
Sumber : http://biologi.fmipa.unand.ac.id/
Prosedur Kerja Pemakaian alat elektroforesis yaitu :
1) Letakkan gel ke dalam elektroforesis chamber.
2) Tuangkan larutan TBE 1X sampai gel terbenam.
3) Rentangkan parafilm
4) Teteskan 1μL loading dey dengan menggunakan mikropipet ke atas parafilm
kemudian campurkan dengan 3μL DNA
5) Kemudian masukkan dengan hati-hati ke dalam “well”/sumur gel. Catat posisi
dan urutan sampel
6) Pasang tutup alat elektroforesis dan pasang katoda dan anoda pada power
supply.
7) Nyalakan mesin elektroforesis dengan menekan tombol ON.
8) Selanjutnya Tekan SET ENTER untuk mengatur voltage dan timer
berdasarkan tingkat resolusi yang diinginkan.
9) Setelah selesai ambil gel dan matikan mesin elektroforesis secara sempurna.
BAB III

METODE

A. Alat dan Bahan


1. Isolasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL)
Alat dan bahan yang digunakan dalam proses isolasi DNA diantaranya yaitu
mikropipet (100 – 1000 µl, 2 - 20 µl, dan 0,5 – 10 µl), tip kuning (20 – 200 µl),
tip biru (100 -1000 µl), Tabung eppendorf 1,5 ml, Sarung tangan, Masker, DNA
Bacteria Kit (Prestomini gDNA Bacteria Kit) beserta Buffer yang diantara
terdiri atas GT Buffer, GB Buffer, W1 Buffer, Wash Buffer dan Elution Buffer),
Collection tube, GD Coloumn, Proteinase K, RNAse, Ethanol Absolute dan
Isolat Bakteri Asam Laktat.
2. Elektroforesis
Alat dan bahan yang digunakan dalam proses eletroforesis diantaranya yaitu
Agarose (0,25 gram), Akuades, Gelas beaker (250 mL), TBE Buffer 0,5 ,
Microwave, Loading dye, DNA ledder, Kertas Parafilm, Mikropipet,
Elektroforesis Kit, UV Transiluminator, dan Aplikasi Gel Documenter.

B. Cara Kerja
1. Isolasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL)
Prosedur kerja isolasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL) dimulai dengan
kode isolat bakteri ditulis pada test tube, bakteri yang ditumbuhkan di media
MRS cair dihomogenkan terlebih dahulu setelah dihomogenkan lalu diambil 1,5
ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml. Isolat bakteri yang
telah dihomogenkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml kemudian disentrifuge
menggunakan microcentrifuge selama 1 menit (12.000 rpm), setelah
disentrifuge maka akan terbentuk supernatan dan pelet. Supernatan dibuang
sedangkan pelet di dalam tabung eppendorf dilarutkan dengan ditambahkan GT
Buffer sebanyak 180 µl. Pelet yang sudah ditambahkan GT Buffer kemudian
dihomogenkan menggunakan vortex lalu larutan pelet dan GT Buffer tersebut
ditambahkan 20 µl Proteinase K selanjutnya diinkubasi dalam waterbath dengan
suhu 60 oC selama 10 menit, tabung dispin down setiap tiga menit sekali selama
inkubasi.
Tube sampel kemudian ditambahkan 200 µl GB Buffer lalu
dihomogenkan menggunakan vortex. Setelah homogen, tube sampel diinkubasi
dalam waterbath dengan suhu 70 oC selama 10 menit. Sementara itu 400 µl
Elution Buffer dipanaskan bersamaan dengan tube sampel dalam waterbath
untuk digunakan dalam proses selanjutnya. Selama inkubasi, tabung dispin
down setiap tiga menit. Sampel yang telah diinkubasi ditambahkan dengan
RNAse yang berfungsi untuk mendegradasi RNA, kemudian sampel
dihomogenkan menggunakan vortex lalu diinkubasi lagi pada suhu ruang
selama lima menit. Setelah itu tube sampel ditambahkan 200 µl ethanol absolute
lalu dispin down. Sampel yang ada di dalam tube diambil lalu dipindahkan ke
dalam CB3 (Collection tube – GD Coloumn). Tabung CB3 disentrifuge selama
dua menit (12.000 rpm), cairan yang tertampung dalam collection tube dibuang.
Setelahnya sampel yang masih berada di GD Coloumn ditambahkan W1
Buffer sebanyak 400 µl kemudian disentrifuge selama 30 detik (12.000 rpm),
flow through atau cairan yang tertampung di dalam tabung penampung dibuang
lalu GD Coloumn ditempatkan ke tabung penampung yang baru. Selanjutnya
ditambahkan Wash Buffer sebanyak 600 µl lalu disentrifuge selama 30 detik
(12.000 rpm), kemudian flow through dibuang. Setelah itu sampel dalam tabung
CB3 dipindahkan ke tabung eppendorf 1,5 ml kemudian ditambahkan Elution
Buffer/TE Buffer/ddH2O sebanyak 100 µl lalu disentrifuge selama 30 detik
(12.000 rpm), terakhir sampel hasil isolasi DNA disimpan di dalam freezer.

2. Elektroforesis
Prosedur kerja dalam tahapan elektroforesis dimulai dengan agarose
sebanyak 0,25 gram ditimbang menggunakan timbangan analitik kemudian
dipindahkan ke dalam gelas beaker 250 ml. Sementara itu TBE Buffer 0,5
disiapkan sebanyak 25 ml, agarose yang telah ditimbang kemudian dilarutkan
ke dalam TBE Buffer 0,5 sebanyak 25 ml. Setelah dilarutkan kemudian
dipanaskan menggunakan microwave selama satu menit. Cetakan gel agarose
disiapkan, gel agarose diambil kemudian ditambahkan DNA (FloroSafe DNA
Stain) sebanyak 1 µl, lalu dihomogenkan dengan cara digoyangkan. Setelah
homogen kemudian dimasukkan ke dalam cetakan, pastikan agarose tersebar
rata ke seluruh cetakan dan tidak ada gelembung udara. Setelah gel agarose
memadat, lepaskan dari cetakan dan letakkan pada horizontal submarine tank
electrophoresis. Pastikan meletakkannya dengan benar yaitu dari kutub negatif
kutub positif dan dibiarkan selama 45 menit. Setelah gel agarose memadat, TBE
Buffer 0,5 ditambahkan hingga gel agarose dalam cetakan tenggelam.
Sementara itu Loading dye, DNA Ledder dan kertas parafil disiapkan.
Loading dye sebanyak 2 µl dan DNA Ledder sebanyak 2 µl dicampurkan di atas
kertas parafilm, kemudian dimasukkan ke sumuran gel agarose dengan
komposisi 4 µl (sampel hasil isolasi) + 2 µl loading dye menggunakan
mikropipet. Selanjutnya DNA Ledder 100 bp dimasukkan dengan komposisi 2
µl DNA Ledder ditambah 2 µl Loading dye. Tank elektroforesis kemudian
ditutup dan disambungkan ke power supply, lalu diatur dengan voltase 75 dan
waktu 45 menit. Setelah selesai, alat elektroforesis dimatikan dan gel agarose
dibawa ke UV Transiluminator.
Agar hasil visualisasi lebih jelas, gel agarose divisualisasikan
menggunakan gel Documenter. Uv Tray dibersihkan menggunakan aquades,
setelah itu gel agarose diletakkan pada UV Tray lalu dimasukkan ke dalam
perangkat Gel Documenter dan aplikasi “Image Lab” pada komputer klik New
 Select Nucleic Acid  Ethidium Bromide  Klik Run kemudia hasil
visualisasi isolasi DNA Bakteri Asam Laktat akan terlihat.
BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Tabel 1. Hasil Visualisasi Elektroforesis


Kode Isolat
Hasil
(Dibaca dari kiri  kanan)

 Sumuran 1 : Marker
 Sumuran 2 : J15
 Sumuran 3 : B21
 Sumuran 4 : B25
 Sumuran 5 : B26
 Sumuran 6 : J6
 Sumuran 7 : J18
 Sumuran 8 : Marker
Tampilan visualisasi elektroforesis
8 sumuran : 2 marker, 6 isolat

B. Pembahasan
1. Kegiatan 1 : Isolasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL)
Kegiatan dalam praktikum ini yaitu isolasi DNA Bakteri Asam Laktat
(BAL). Secara umum, isolasi DNA genom bakteri melibatkan tiga tahapan yaitu
perusakan sel, ekstraksi DNA, dan purifikasi DNA (Ahmed, et al., 2014).
Prokariot memiliki DNA inti yang terkonsentrasi di wilayah yang tidak
diselubungi oleh membran ganda (nukleus) seperti pada sel eukariot (Campbell
& Reece, 2008). Pada kebanyakan bakteria, molekul DNA berukuran besar
terorganisasi dalam bentuk kromosom sirkular (Ahmed et al., 2014). Proses
pengeluaran DNA dengan cara diekstraksi atau dilisiskan biasanya dilakukan
dengan homogenasi dengan penambahan bufer ekstrasi atau bufer lisis untuk
mencegah rusaknya DNA (Fatchiyah et al., 2011).
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemurnian DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein,
serta pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi
DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada
di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik
sentrifugasi tersebut dilakukan menggunakan microcentrifuge yang memiliki
kecepatan bervariasi.
Tahapan-tahapan dalam isolasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam
praktikum ini meliputi :
i. Tahapan Preparasi Sampel
Preparasi sampel diawali dengan proses isolasi bakteri dari
lingkungan (alam sekitar) menjadi kultur murni dalam media penelitian.
Dalam praktikum ini, preparasi sampel yang dilakukan yaitu isolasi
bakteri asam laktat yang ditumbuhkan pada media MRS cair kemudian
dihomogenkan menggunakan vortex. Apabila pada awalnya isolat
bakteri ditumbuhkan pada media agar, maka isolat bakteri harus dikultur
ke media cair terlebih dahulu.
ii. Tahapan Lisis (Ekstraksi)
Proses ini sangat penting untuk penghancuran struktur protein
dan memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat. Di dalam protokol
yang dikeluarkan Presto Mini gDNA Bacteria Kit, penambahan GT
Buffer berperan sebagai buffer yang berfungsi memecah dinding sel
bakteri (lisis), setelah itu ditambahkan pula Proteinase K yang berfungsi
untuk memecah membran bakteri (lisis lebih lanjut). Proteinase K
merupakan enzim hidrolitik yang bekerja memutus ikatan-ikatan
peptida pada protein (Cabral et al., 2000). Proteinase K digunakan untuk
melisiskan sel dan menurunkan protein, sehingga DNA akan mudah
terikat dengan matriks serat gelas dari kolom putaran DNA genom.
Larutan lain yang digunakan pada tahapan lisis yaitu GB Buffer,
yang memiliki melisiskan bagian-bagian bakteri lainnya (lisis lebih
lanjut lagi) dan mempertahankan pH agar DNA tidak rusak. Dalam
tahapan ini ditambahkan pula RNAse yang berfungsi untuk
mendegradasi RNA yang mengotori DNA (Utami et al, 2012).
Ribonuklease atau RNAse merupakan jenis nuklease yang
mengkatalisis degradasi RNA menjadi komponen-komponen yang lebih
kecil. Apabila DNA masih mengandung kontaminan RNA maka dapat
menyebabkan smear pada saat elektroforesis.
iii. Tahapan Presipitasi DNA
Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan
presipitasi DNA dengan menggunakan etanol absolut atau isopropanol
(Fatchiyah et al., 2011). Ethanol absolute disebut juga etanol anhidrat,
berupa cairan tidak berwarna, titik didih 16,6oC, bersifat mudah terbakar
dan menguap. Bersifat bahaya karena menyebabkan iritasi kulit dan
saluran pernafasan, kerusakan ginjal dan jantung, gangguan fertilitas,
dan depresi system saraf pusat, juga menyebabkan efek mutagenik
(karsinogenik).
Ethanol absolute fungsinya untuk presipitasi atau pengendapan
DNA (Safrini, 2009). Penambahan ini bertujuan untuk mempermudah
terjadinya presipitasi pada benang-benang DNA. Ethanol tersebut
mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke
permukaan, untuk kemudian diendapkan.Setelah ditambahkan ethanol
larutan kemudian kembali dihomogenkan pada mesin vortex. Ethanol
akan melarutkan bahan-bahan lain selain DNA sehingga ketika
dilakukan sentrifugasi DNA akan terpisah dengan bahan-bahan lain
tersebut.
iv. Tahapan DNA Binding
Tahapan ini dilakukan ketika tube sampel mulai dimasukkan ke
dalam CB3 Coloumn (tabung penyaring). Kemudian CB3 Coloumn
disentrifuge selama 2 menit (12.000 rpm). Tahapan DNA binding
diartikan sebagai proses pengikatan DNA.
v. Tahapan Purifikasi (Pencucian/Pemurnian)
Pada tahapan ini, penggunaan W1 Buffer dimaksudkan untuk
menghilangkan residu protein dan RNA residu terdegradasi pada
membran, selain itu ditambahkan pula Wash Buffer yang berfungsi
untuk menghilangkan residu garam pada membran (pencucian lebih
lanjut).
vi. Tahapan Elusi DNA
Tahapan yang terakhir yaitu Elusi DNA. Pada tahapan ini,
sampel ditambahkan dengan Elution Buffer yang berfungsi untuk
memurnikan DNA. Elution Buffer akan mengikat pengotor selain DNA
agar DNA terpisah sempurna dari pengotor. Larutan yang dapat
digunakan untuk tahapan elusi DNA adalah TE Buffer atau ddH2O. TE
Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada
konsentrasi tertentu. TE Buffer dalam praktikum biologi molekuler
berfungsi untuk menstabilkan DNA atau RNA karena pH nya dijaga
sekitar 8. Karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (DNA=
Asam deoksiribonukleat, RNA = Asam ribonukleat), yang dalam waktu
lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, sehingga dibuatlah TE
Buffer tersebut.

Setelah melalui semua tahapan-tahapan tersebut, hasil isolasi DNA yang


didapatkan ditempatkan dalam tabung eppendorf 1,5 ml kemudian disimpan di
dalam freezer dan selanjutnya akan diuji secara kualitatif melalui metode
elektroforesis.

2. Kegiatan 2 : Elektroforesis
Elektroforesis merupakan metode yang digunakan dalam praktikum ini
untuk memaparkan uji kualitas DNA yang diisolasikan dengan
memvisualisasikannya menggunakan elektroforesis kit beserta aplikasi Gel
Documenter. Teknik elektroforesis adalah teknik pemisahan senyawa
berdasarkan kecepatan migrasi dari senyawa yang bermuatan listrik di bawah
pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama
dalam biologi molekular dan merupakan metode standar untuk pemisahan,
identifikasi dan pemurnian fragmen DNA.
Prinsip dasar teknik ini adalah Deoxyribonucleotid Acid (DNA),
Ribonucleotid Acid (RNA), atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan, konsentrasi gel agarosa,
tegangan listrik yang diberikan, dan konformasi DNA. DNA bermuatan negatif,
sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub
negatif ke kutub positif. Pemisahan protein atau asam nukleat berukuran kecil
(DNA, RNA, atau oligonukleotida).
Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari
beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput
laut) yang sudah dimurnikan. Konsentrasi gel agarosa yang digunakan dalam
elektroforesis bervariasi antara 0,7 % - 1.5%. Etidium bromida dapat
ditambahkan ke suspensi DNA untuk tujuan visualisasi hasil elektroforesis
(pita-pita DNA dapat dideteksi di bawah sinar UV).
Hasil elektroforesis menunjukkan adanya garis pita yang panjang dan
garis pita yang pendek. Semakin panjang jarak garis pita yang terbentuk pada
gel agarosa dengan sumur, maka panjang DNA pada genom tersebut semakin
pendek. Sedangkan, semakin pendek jarak garis pita yang terbentuk pada gel
agarosa dengan sumur, maka panjang DNA pada genom semakin panjang. Hal
ini dikarenakan fungsi agarosa sebagai benteng pengambat gerakan DNA ketika
dialiri oleh tegangan listrik.
Berdasarkan studi praktikum online (kajian video elektroforesis),
didapatkan hasil bahwa :
i. Sumuran 1 dan 8 : Pada tampilan hasil visualisasi elektroforesis gel
agarose, nilai tertinggi marker (sumuran 1) sebelah kiri yaitu 10000 bp
dan nilai terendah (paling bawah) yaitu 1000 bp. Marker ini berasal dari
DNA ledder dan fungsinya sebagai tolak ukur/pengukuran. Begitu pula
dengan sumuran ke-8 yang juga berfungsi sebagai marker dengan nilai
tertinggi 3000 bp dan nilai terendah 500 bp.
ii. Sumuran 2 : Kode isolat J-15, berdasarkan analisis elektroforesis tidak
terlihat hasil panjang nukleotidanya. Hal ini dapat terjadi dikarenakan
beberapa hal yaitu diantaranya waktu inkubasi yang kurang lama,
sampelnya kurang dan konsentrasi bakteri yang kurang.
iii. Sumuran 3-7 : Kode isolat B-21, B-25, B-26, J-6, J-18, memiliki
panjang nukleotida lebih dari 10000 bp. Hasil tersebut ditunjukkan oleh
pendaran pita DNA pada gel agarose yang berada di atas DNA marker
di sebelah kirinya (>10000 bp) dan sebelah kanannya (>3000 bp). Pada
bagian ini (isolat B-21, B-25, B-26, J-6, J-18) masih terlihat arsiran
kabur berwarna putih yang terbentuk secara vertical (smear) hal ini
dapat terjadi dikarenakan masih ada kontaminasi RNA.
BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil studi praktikum online (kajian video isolasi DNA Bakteri dan
elektroforesis), dapat disimpulkan bahwa :
1. Tahapan-tahapan proses isolasi DNA Bakteri terdiri dari preparasi sampel, lisis
(ekstraksi), DNA Binding, presipitasi DNA, pencucian (purifikasi), dan elusi
DNA. Bahan bahan yang diperlukan dalam proses isolasi DNA Bakteri Asam
Laktat diantaranya yaitu isolat bakteri asam laktat, GT Buffer, GB Buffer, W1
Buffer, Wash Buffer Elution Buffer, RNAse, Proteinase K, dan Ethanol
Absolute.
2. Tahapan-tahapan dalam proses elektroforesis yaitu diantaranya persiapan bahan
seperti agarose (0,25 gram), TBE Buffer 0,5 sebanyak 25 ml, Florosafe DNA
Stain, Loading dye, DNA Ledder, kertas parafilm, pembuatan gel agarose,
pewarnaan gel agarose dan visualisasi menggunakan Gel Documenter.
3. Cara pembacaan hasil visualisasi elektroforesis yaitu dilihat berdasarkan
pendaran pita DNA pada gel agarose dibandingkan dengan markernya. Semakin
panjang jarak garis pita yang terbentuk pada gel agarosa dengan sumur, maka
panjang DNA pada genom tersebut semakin pendek. Sedangkan, semakin
pendek jarak garis pita yang terbentuk pada gel agarosa dengan sumur, maka
panjang DNA pada genom semakin panjang. Hal ini dikarenakan fungsi agarosa
sebagai benteng pengambat gerakan DNA ketika dialiri oleh tegangan listrik.
B. Saran
Diharapkan topik praktikum selanjutnya menggunakan objek selain bakteri sehingga
pembelajaran mengenai isolasi DNA dapat lebih dipahami secara meluas.
DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, O. B., Atif H. A. & Mogahid M. E. (2014). Comparison of three DNA

extraction methods for polymerase chain reaction (PCR) analysis of bacterial

genomic DNA. African Journal of Microbiology Research, 8(6), 598-602.

DOI: 10.5897/AJMR2013.6459.

Azmi, WA. 2019. Keragaman Genetik Daun Wungu Dari 11 Etnis Di Indonesia

Bagian Timur Berdasarkan Marka Molekuler Srap. Skripsi. Institut Pertanian

Bogor.

Brown, T.A., 1991. Pengantar Kloning Gena. Yogyakarta. Yayasan Essensia


Edica
Cabral, H., M.T. Ruiz, C.M.A. Carareto & G.O. Bonilla-Rodriguez. 2000. A plant

proteinase, extracted from Bromelia fastuosa, as an alternative to proteinase K

for DNA extraction. Dros. Inf. Serv, 83, 178-185.

Campbell, Neil A. & Jane B. Reece. (2008). Biologi: Edisi 8 Jilid 1. Terjemahan

Damaring Tyas Wulandari. 2008. Jakarta: Erlangga.

Fatchiyah, Estri L. Arumingtyas, Sri Widyarti, & Sri Rahayu. (2011). Biologi

Molekuler: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Guenni K, Aouadi M, Chatti K, Salhi-Hannachi A. 2016. Analysis of genetic diversity

og Tunisian pistachio (Pistacia vera L.) using sequence-related amplified

polymorphism (SRAP) markers. GMR. 15(4): 1-15.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha

Muda.

Prahaditya, Deffy. 2012. Analisis Keragaman Genetika Tanaman Kunyit dan

Temulawak secara Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain

Reaction (RAPD-PCR) Menggunakan Primer OPA-OPD 6-10. Skripsi.


Institut Pertanian Bogor

Reddy G, Altaf, MD, Naveena, BJ, Ven Kateshwar, M, Kumar, EV. (2008).

Amylolytic bacterial lactic acid fermentation – A review. Biotechnol Adv 26:

22 – 34. DOI: 10. 1016/j.biotechadv. 2007. 07. 004.

Rustan, I. R. 2013. Studi Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi

Cabai Rawit (Capsicum frutencens L.). Universitas Hasanuddin, Makassar.

[SKRIPSI].

Safitri, Fenthy Marlina; Ningsih Dwi Ratna; Ismail, Elza dan Waluyo. 2016.

“Pengembangan Getuk Kacang Tolo Sebagai Makanan Selingan Alternatif

Kaya Serat”. Jurnal Gizi dan Dietetik Indonesia. Vol 4. No 2.

Sambrook J, Russel D.W. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third

Edition. New York: Cold-Spring Harbor Laboratory Pr.

Surono. 2004. Yoghurt Untuk Kesehatan. Yogyakarta : Penebar Swadaya.

Suryani Y, Oktavia AB, Umniyati S. 2010. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam

laktat dari limbah kotoran ayam sebagai agensi probiotik dan enzim kolesterol

reduktase. J. Biota. 12 (3):177-185

Utami A, R. Meryalita, N.A. Prihatin, L. Ambarsari, P.A. Kurniatin, and W.

Nurcholis. 2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (Curcuma

xanthorrhiza Roxb). Prosiding Seminar Nasional Unesa. Surabaya

https://biologi.uinmalang.ac.id/wpcontent/uploads/2020/07/PRAKTIK
MTABM.pdf // diakses 24 Maret 2021 Pukul 13. 28 WIB
http://vlm.ub.ac.id/pluginfile.php/43984/mod_resource/content/1/3.%2
REPLIKAS%20DNA%20DAN%20OKAZAKI%20FRAGMENT.pdf //
diakses 24 Maret 2021 Pukul 13. 51 WIB
http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/files/2012/08/Praktikum-TABM-S1
Biologi-MIPAUB.pdf // diakses 24 Maret 2021 Pukul 14.22 WIB
http://research.unissula.ac.id/file/publikasi/210109143/2795Buku_petunju
_praktikm_instrumentasi.pdf // diakses 24 Maret 2021 Pukul 14.37
WIB
https://publikasiilmiah.ums.ac.id/bitstream/handle/11617/7565/14%20-%
0Agung.pf?sequence=1&isAllowed=y // diakses 24 Maret 2021 Pukul
15.32 WIB
https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_dir/f5b44ea268d18827
a58b60bf2f7362.pdf // diakses 24 Maret 2021 Pukul 15.49 WIB
https://media.neliti.com/media/publications/150849-ID-none.pdf //
diakses 24 Maret 2021 Pukul 15.56 WIB
https://jurnal.unimus.ac.id/index.php/psn12012010/article/viewFile/4249
3940 //diakses 24 Maret 2021 Pukul 17.11 WIB
http://repository.unika.ac.id/9134/8/12.70.0074%20Elim%20Yuyana%20DAFTAR

20PUSTAKA.pdf // diakses 16 April 2021 Pukul 20.37 WIB

https://media.neliti.com/media/publications/232312-peranan-bakteri-asam-laktat

dalam-mengha-6b4b0fbc.pdf // diakses 16 April 2021 Pukul 20.37 WIB

http://etheses.uin-malang.ac.id/2599/6/06520062_Bab_2.pdf// // diakses 16 April

2021 Pukul 20.42 WIB

http://jurnal.unpad.ac.id/jurnalilmuternak/article/download/19771/10164 // diakses 16

April 2021 Pukul 20.47 WIB

http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra/article/download/1996/1613//

diakses 16 April 2021 Pukul 20.51 WIB

https://publikasiilmiah.ums.ac.id/bitstream/handle/11617/7565/14%20-%20Agung.p

f?sequence=1&isAllowed=y// diakses 16 April 2021 Pukul 21.12 WIB

https://jurnal.unimus.ac.id/index.php/psn12012010/article/viewFile/4249/3940 //

diakses 16 April 2021 Pukul 21.12 WIB

http://ojs.uho.ac.id/index.php/JPK/article/view/3733/2806 // diakses 16 April 2021

Pukul 21.12 WIB


https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_pendidikan_dir/f5b44ea268d188279a58b60bf

2f7362.pdf// diakses 16 April 2021 Pukul 21.19 WIB

http://ejournal.uin-suka.ac.id/pusat/integratedlab/article/download/1539/1242//

diakses 16 April 2021 Pukul 21.23 WIB

https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/pharmacon/article/download/19509/19058 //

diakses 16 April 2021 Pukul 21.37 WIB

http://eprints.undip.ac.id/50857/3/VALENSA_YOSEPHI_22010112140176_Lap.KT

_BAB_2.pdf// diakses 16 April 2021 Pukul 21.39 WIB

http://digilib.uinsby.ac.id/21190/6/Bab%203.pdf // diakses 16 April 2021 Pukul 22.08

WIB

Anda mungkin juga menyukai