Pemicu 3 LTM Nabila Najma 1806150124

Anda mungkin juga menyukai

Anda di halaman 1dari 15

Laporan Tugas Mandiri

Nama : Nabila Najma Tanggal : 16 November 2020

NPM : 1806150124 Paraf Asisten :

Kelompok :7

Topik : Pemicu 3 – Mutasi dan Mutagenesis

A. Outline
1. Jenis Modifikasi
a. Mutasi
b. Insersi
c. Delesi
d. Substitusi
2. Pemilihan Mutasi yang Tepat
3. Teknik Mutagenesis
a. Site-Directed Mutagenesis
b. Directed Mutagenesis
c. Random Mutagenesis
d. Insertional Mutagenesis
4. Protein Apoptin

B. Isi
1. Jenis Modifikasi
a. Mutasi
Mutasi merupakan perubahan materi genetic (genom) sel dari organisme hidup
atau virus yang lebih atau kurang permanen dan dapat diturunkan ke sel atau
virus (Griffiths, 2020). Organisme memiliki genom yang seluruhnya terdiri
dari DNA, sedangkan virus memiliki genom yang terdiri dari DNA dan RNA.
Mutasi pada DNA sel tubuh organisme multiseluler (mutase somatik) dapat
diturunkan ke sel turunan melalui replikasi DNA dan karenanya menghasilkan
sector atau tambalan sel yang memiliki fungsi abnormal, misalnya adalah
kanker (Griffiths, 2020). Mutasi dapat tercipta karena kecelakaan selama
proses transaksi kimiawi normal DNA, seringnya ditemukan selama replikasi,
atau dari paparan radiasi elektromagnetik berenergi tinggi (sinar ultraviolet
atau sinar-X) atau radiasi partikel atau bahan kimia yang sangat reaktif.

Mutasi yang mengubah urutan DNA dapat berdampak pada perubahan urutan
asam amino yang dapat menyebabkan protein kekurangan atau kehilangan
fungsinya. Perubahan pada urutan DNA pada area pengaturan gen dapat
memengaruhi waktu dan ketersediaan dari protein dan akan berdampak pada
malfungsi seluler. Pada sisi lain, banyak mutasi yang terjadi secara diam, tidak
menunjukkan efek yang jelas pada tingkat fungsional. Mutasi jenis ini tidak
menyebabkan perubahan asam amino yang signifikan.

b. Insersi
Insersi merupakan salah satu tipe mutasi yang melibatkan penambahan
material genetik. (Muenke of National Human Genome Research Institute).
Mutasi penyisipan dapat berupa penyisipan kecil yang melibatkan satu
pasangan basa DNA tambahan, atau berupa penyisipan besar melibatkan satu
potongan kromosom.
Gambar 2. Insersi (Sumber: genome.gov)
c. Delesi
Delesi merupakan salah satu jenis mutasi yang melibatkan kehilangan materi
genetik. Dapat kehilangan yang kecil melibatkan satu pasangan basa DNA
yang hilang, atau kehilangan yang besar melibatkan satu potongan kromosom.
Berdasarkan ukurannya, delesi dapat menyebabkan efek yang berbeda, serta
dapat memengaruhi perilaku, dan tampilan fisik.

Gambar 3. Delesi (Sumber: genome.gov)


d. Substitusi
Substitusi merupakan salah satu jenis mutasi di mana satu pasangan basa
digantikan dengan pasangan basa lain yang berbeda. Dapat juga diartikan
sebagai penggantian satu asam amino dalam protein dengan asam amino yang
berbeda.

Gambar 4. Substitusi (Sumber: genome.gov)

2. Pemilihan Mutasi yang Tepat


Dalam melaksanakan proyek mutagenesis, aspek terpenting yang perlu
diperhatikan adalah memutuskan mutase mana yang akan dibuat. Diperlukan
pertimbangan cermat yang perlu diberikan tidak hanya untuk nukleotida mana
yang akan bermutasi, namun untuk apa nukleotida tersebut harus dimutasi (Howe,
2007).

Untuk melakukan hal ini dengan benar, diperlukan pengetahuan yang dalam dan
rinci tentang fungsi urutan target. Jika urutan mengkodekan protein, maka
beberapa gagasan tentang struktur protein dan residu yang penting untuk fungsi
protein biasanya diperlukan. Idealnya, struktur tiga dimensi molekul perlu
diketahui.

Penting juga untuk mengetahui bahwa perubahan kecil dalam urutan asam amino
dapat menyebabkan efek yang besar pada struktur tiga dimensi secara
keseluruhan, bahkan terdapat kemungkinan menghilangkan aktivitas, meskipun
mungkin tidak ada perubahan dalam urutan primer di situs aktifnya. Sebagai
contoh, mutase kecil dapat mengganggu lipatan dan menyebabkan perubahan
structural berskala besar.

Pemodelan komputer memungkinkan prediksi efek mutasi tertentu pada struktur


tiga dimensi. Setelah protein mutan dibuat, perubahan juga dapat dideteksi dengan
analisis resonansi magnetic inti atau dichroisme sirkuler, atau dengan melihat
pengikatan antibodi dan resistensi protease yang mungkin berkurang pada protein
yang tidak terlipat dengan benar.

3. Teknik Mutagenesis
a. Site-Directed Mutagenesis
Site-directed mutagenesis merupakan alat yang ampuh dan banyak digunakan
di beberapa area biologi molekuler dan biokimia. Metode awal untuk
menggunakan mutagenesis yang diarahkan ke situs plasmid untai tunggal
(segmen plasmid) memberikan efisiensi yang rendah untuk mendapatkan
urutan mutan yang diinginkan (Hemsley et al., 1989). Kemudian diberikan
perbaikan yang menggunakan seleksi terhadap wild-type sequence, ternyata
memakan waktu dan usaha yang mahal untuk mengisolasi mutan.

Lalu dikembangkan PCR untuk menjadi pendekatan terbaru kepada site-


directed mutagenesis. Metode ini menggunakan primers yang mengandung
satu atau beberapa basa yang berbeda dari wild-type sequence yang
digabungkan ke dalam produk PCR setelah dilakukan PCR. Urutan yang
diubah ini kemudian dibelah dengan enzim restriksi dan disisipkan di tempat
wild-type sequence. Pendekatan ini relatif memakan waktu, dan bergantung
pada keberadaan lokasi pembatasan yang berlokasi strategis yang mengapit
wild-type sequence yang dimutasi.
1. Single-primer method
Metode ini dilakukan dengan melakukan reaksi PCR dengan menggunakan
forward dan reverse primers (Edelheit & Hanukoglu, 2009). Kemudian,
produknya ditransformasikan ke sel inang. Guideline untuk membuat
primer nya adalah sebagai berikut
- Urutan primer harus saling melengkapi.
- Panjang primer harus 10-20 nt urutan yang tidak dimodifikasi di kedua
sisi mutase.
- Basa yang bermutasi sebaiknya berada di tengah kedua primer.
- GC content: 40-70%
- Tm: 75-85°C untuk urutan yang tidak termasuk situs yang bermutasi.
- Primer harus dimulai dan diakhiri dengan setidaknya satu G atau C.
Gambar 5. Single-Primer Method (Sumber: Edelheit & Hanukoglu, 2009).
2. Cassette Mutagenesis
Merupakan sebuah metode untuk penyisipan kaset oligodeoksinukleotida
mutagenic yang efisien yang memungkinkan kejenuhan kodon asam amino
target dengan beberapa mutasi (Wells et al., 1985). Situs restriksi
kemudian diperkenalkan oleh prosedur mutagenesis yang diarahkan
oligonukleotida untuk mengapit kodon target di dalam plasmid yang
mengandung gen. situs restriksi yang akan dimasukkan dipilih berdasar
pada keunikannya terhadap plasmid, dan berdasarkan kedekatannya
dengan kodon target dan konservasi urutan kode asam amino akhir.

Situs restriksi yang mengapit di dalam plasmid kemudian dicerna dengan


enzim restriksi yang serumpun, dan kaset DNA dupleks sintetik pendek
(10-25 bp) dimasukkan. Kaset mutagenic dirancang untuk memulihkan
sepenuhnya wild-type coding sequence, kecuali pada kodon target. Selain
itu, dapat menghilangkan satu atau kedua situs pembatasan. Penghapusan
situs pembatasan memfasilitasi pemilihan klon yang mengandung kaset
oligodeoksinukleotida mutagenik.

Untuk membuat kaset, oligodeoksinukleotida untai tunggal dan


komplemennya disintesis di kolam terpisah yang berisi kodon berbeda di
atas target.

Gambar 6. Cassette Mutagenesis Method (Sumber: Wells et al.,


1985).
b. Directed Mutagenesis
Directed mutagenesis didefinisikan sebagai perubahan koding asam amino
pada tingkat DNA. Perubahan ini dapat dianalisis dengan mengkarakterisasi
struktur tiga dimensi dari protein menggunakan X-Ray crystallography.
Jenis-jenisnya adalah:
1. Oligonucleotide Directed Mutagenesis with M13 DNA.
2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis with Plasmid DNA.
3. PCR Amplified Oligonucleotide Directed Mutagenesis.
c. Random Mutagenesis
Random mutagenesis merupakan alat yang sangat banyak digunakan untuk
menghasilkan enzim dan protein dengan sifat tertentu yang diinginkan atau
ditingkatkan. Bukan hanya menghasilkan enzim dan protein saja, namun
seluruh jalur metabolisme dan seluruh genom dapat dihasilkan dengan sifat
tertentu yang diinginkan atau ditingkatkan. Terdapat banyak metode
pendekatan untuk menghasilkan keragaman genetik dengan random
mutagenesis dan menciptakan combinatorial libraries.
1. Error-prone PCR
Metode pendekatan ini menggunakan PCR yang ‘ceroboh’ di mana enzim
polimerase nya memiliki error rate yang tinggi (sampai 2%) untuk
mengamplifikasi wild-type sequence. PCR dapat dibuat untuk menjadi
rawan akan kesalahan dengan berbagai cara, termasuk meningkatkan
MgCl2 dalam reaksi, menambahkan MnCl2 atau menggunakan konsentrasi
yang tidak sama dari setiap nukleotida (Oswald, 2007). Setelah
diamplifikasi, pustaka urutan pengkodean mutan harus diklon ke dalam
plasmid yang sesuai. Kelemahan dari pendekatan ini adalah ukuran
pustaka nya dibatasi oleh efisiensi langkah kloning, kemudian terdapat
kemungkinan mutasi delesi dan frameshift terjadi.
2. Rolling circle error-prone PCR
Merupakan salah satu varian dari error-prone PCR di mana wild-type
sequence nya pertama-tama dikloningkan ke dalam plasmid, setelah itu
diamplifikasi dengan PCR di dalam kondisi error-prone (rawan
kesalahan). Hal ini menghilangkan langkah ligasi yang membatasi ukuran
perpustakaan dalam error-prone PCR, tetapi amplifikasi dari seluruh
plasmid dinilai kurang efisien dibandingkan mengamplifikasi urutan kode
itu sendiri.
3. Mutator srains
Pada metode pendekatan ini wild-type sequence dikloningkan ke dalam
plasmid dan ditransformasikan ke dalam strain mutator, contohnya adalah
XL1-Red. XL 1-Red adalah strain E.coli yang memiliki kekurangan akan
tiga jalur perbaikan DNA primer (mutS, mutD, dan mutT) yang dapat
menyebabkan kesalahan selama proses replikasi DNA, termasuk pada saat
kloning ke dalam plasmid yang menyebabkan plasmid yang direplikasi
memiliki perbedaan dengan wild-type sequence.
4. Temporary mutator strains
Temporary mutator strains dapat dibangun dengan mengekspresikan
mutator allele secara berlebihan seperti mutD5 yang dapat membatasi
kemampuan sel untuk memperbaiki lesi DNA (Oswald, 2007).
Mengekspresikan mutD5 dari promotor yang dapat diinduksi
memungkinkan sel untuk berputar di antara mutagenik (ekspresi mutD5
aktif) dan normal (ekspresi mutD5 nonaktif). Periode pertumbuhan
normal memungkinkan sel untuk pulih dari mutagenesis, yang
memungkinkan strain ini tumbuh lebih lama daripada strain mutator
konvensional.
5. Insertion mutagenesis
Menggunakan sistem yang didasarkan pada transposon untuk secara acak
menginsersi urutan pasangan 15 basa ke seluruh urutan yang diinginkan,
baik itu sisipan terisolasi atau plasmid. Memasukkan 5 kodon ke dalam
urutan memungkinkan gen apa pun dengan penyisipan untuk diekspresikan
(tidak ada pergeseran bingkai atau kodon berhenti yang disebabkan).
Karena penyisipannya acak, setiap salinan urutan nya akan mempunyai
penyisipan yang berbeda-beda sehingga menjadikannya sebuah library.
6. Ethyl methanesulfonate (EMS)
Merupakan sebuah mutagen kimia, EMS ini meningkatkan residu guanidin
yang menyebabkannya disalin secara tidak tepat selama replikasi DNA.
EMS dapat secara langsung mengubah DNA secara kimiawi, sehingga
mutagenesis EMS dapat dilakukan baik secara in vivo atau in vitro
(Labrou, 2010).
7. Nitrous acid
Merupakan sebuah mutagen kimia selain EMS yang dapat menghilangkan
residu adenin dan sitosin yan menyebabkan mutase titik transversi (A/T ke
G/C dan sebaliknya). Keuntungan memakai mutagen kimia adalah
sederhana dan ekonomis. Namun kekurangannya adalah tidak efisiennya
pengendalian laju mutase dan substitusi asam amino yang terbatas.
Mutagen kimia yang sering digunakan masih ada banyak lagi, salah
satunya adalah EMS dan nitrous acid.
8. DNA Shuffling
Merupakan metode yang ampuh di mana sebuah salinan dari gen yang
sama dengan jenis mutasi yang berbeda dikocok secara acak. Hal ini
dilakukan dengan mencerna library secara acak dengan DNAsel,
kemudian secara acak menggabungkan kembali fragmen menggunakan
self-priming PCR. Pengacakan dapat diterapkan ke pustaka yang
dihasilkan oleh salah satu metode di atas dan memungkinkan efek
kombinasi mutase yang berbeda untuk diuji (Oswald, 2007).

d. Insertional Mutagenesis
Insertional mutagenesis merupakan alat genetik yang penting untuk penemuan
gen menggunakan T-DNA, retrotransposon, penyisipan aktivator/disosiasi
(Ac/Ds), dan transposon (Ram, 2019). Transposon dikenal juga sebagai
jumping genes, merupakan urutan DNA seluler kecil yang dapat berpindah ke
posisi yang berbeda di dalam genom. Insertional mutagenesis telah banyak
digunakan untuk membuat perpustakaan mutan yang memungkinkan
identifikasi yang mudah dari sebuah gen yang diberi tag dengan menggunakan
teknik berbasis PCR, salah satunya adalah thermal asymmetric interlaced
PCR (TAIL-PCR) atau Inverse PCR (Ram, 2019).
1. Retroviral Insertional Mutagenesis
Retroviral insertional mutagenesis pertama kali diidentifikasi pada viral
oncogenesis, di mana integrasi provirus pada sel inang genome
menyebabkan transformasi sel dan kemudian menyebabkan perkembangan
tumor. Metode ini disebabkan oleh replikasi jenis virus tertentu. Retrovirus
mampu mengatur ekspresi gen seluler dalam jarak jauh, dan oleh karena
itu perubahan ekspresi gen terdekat ke lokasi integrasi mungkin bukan
yang terpenting dalam transformasi seluler (Knight, 2013).

Terdapat beberapa mekanisme di mana retrovirus dan vektor retroviral


dapat menyebabkan insertional mutagenesis. Mekanisme ini dapat dibagi
menjadi tiga kategori, yaitu aktivasi virus transkripsi gen seluler,
perubahan pemrosesan RNA dan inaktivasi gen penekan tumor.
2. Signature Tagged Mutagenesis
Signature tagged mutagenesis merupakan sebuah pendekatan genetik yang
dikembangan untuk mengidentifiksai faktor virulensi bakteri baru
(Cummins & Gahan, 2012). STM merupakan sebuah metode selektif
negatif yang menggunakan tag identifikasi unik untuk memungkinkan
analisis kumpulan mutan dalam populasi campuran.

STM berbasis pada random transposon mutagenesis, tapi memungkinkan


untuk melakukan analisis paralel dari strain mutan yang berasal dari bakter
pathogen yang diinginkan. Dalam STM setiap mutan ditandai dengan
urutan DNA yang unik yang diurutkan sedemikian rupa sehingga semua
tag dapat diamplifikasi bersama dari DNA populasi campuran mutan
dengan satu PCR.

Metode asli yang digunakan untuk mendeteksi signature tag adalah


dengan dot blot tetapai seiring berjalannya waktu, terdapat banyak metode
yang digunakan seperti PCR dan polyumorphic tag-length transposon
mutagenesis.

Kelebihan pendekatan STM ini adalah metode selektif negative yang


memungkinkan untuk penemuan gen virulensi tanpa pengetahuan
terdahulu tentang sifat atau fungsinya. Kemudian jumlah besar mutan
dapat disaring secara bersamaan, metode ini pada prinsipnya jauh lebih
cepat dan lebih lengkap dalam mengidentifikasi faktor virulensi
dibandingkan dengan sistem transposon standar.
Namun metode ini juga memiliki kelemahan,m yaitu terbatasnya untuk
menemukan gen yang tidak penting. Selain itu, beberapa tag DNA tidak
dapat diamplifikasi dari DNA kromosom bakteri setelah pemulihan dari
inang hewan. Kelemahan dari sistem ini juga ditunjukkan dengan adanya
bias yang dapat disebabkan oleh beberapa faktor, seperti pemilihan model
hewan, cara infeksi dan organ sasaran. Redundansi mungkin juga
disebabkan oleh fakta bahwa transposon tidak dimasukkan secara acak.

4. Protein Apoptin
Apoptin merupakan sebuah protein yang dapat menginduksi apoptosis kecil, dan
diturunkan dari chicken anemia virus (CAV) yang termasuk ke dalam genus
Gyrovirus dan family Circoviridae yang mengandung satu untai DNA sirkuler
minus (Los et al., 2009).

Gambar 7. Struktur primer apoptin (Sumber: Los et al., 2009).

Apoptin terdiri atas 121 asam amino dan tidak menunjukkan homologi urutan
yang signifikan dengan protein seluler yang diketahui. Ujung terminal C dari
apoptin mengandung bipartite nuclear localization sequence (NLS). NLS1
menjangkau asam amino 82-88, dan NLS2 pada asam amino 111-121.
Tambahannya, apoptin mengandung sebuah putative nuclear export sequence
(NES) pada asam amino 97-105. Apoptin juga memiliki peregangan pendek kaya
leusin hidrofobik pada asam amino 33-46 yang diperlukan untuk asosiasi diri serta
pengikatan protein leukemia promielositik dan interaksi lainnya.
Apoptin biasanya dimediasi oleh caspase, yaitu protease sistein intraseluler.
Caspase berfungsi sebagai inisiator dan eksekutor dalam proses apoptosis.
Aktivasi caspase dilakukan dengan dua rute pensinyalan yang utama: reseptor
kematian ekstrinsik dan jalur mitokondria intrinsik. Dalam jalur ekstrinsik, ligasi
reseptor kematian oleh ligan yang serumpun memicu perekrutan adaptor FADD
dan inisiator caspase-8 ke dalam kompleks pensinyalan yang menyebabkan
kematian (Los et al., 2009).

Sedangkan jalur mitokondria dimulai dengan pelepasan sitokrom c ke dalam


sitosol, yang merupakan sebuah proses yang diatur secara ketat oleh protein pro
dan antipoptosis dari keluarga Bcl-2. Setelah dilepaskan, sitokrom c mengikat
protein adaptor Apaf-1 yang memungkinkan aktivasi inisiator caspase-9 dalam
kompleks berbobot molekul tinggi yang disebut apoptosom. Kedua jalur
pensinyalan tersebut kemudian bertemu pada aktivasi caspase efektor hilir, yang
menyebabkan kematian sel melalui pembelahan beberapa substrat seluler (Los et
al., 2009).

C. Daftar Pustaka
Cummins, Joanne & Gahan, Cormac G. M.. 2012. Signature tagged mutagenesis in
the functional genetic analysis of gastrointestinal pathogens. Gut Microbes,
3(2): 93-103. doi: 10.4161/gmic.19578.
Edelheit, Oded., Hanukoglu, Aaron., Hanukoglu, Israel. 2009. Simple and efficient
site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to
generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnol 9,
61. https://doi.org/10.1186/1472-6750-9-61.
Griffiths, Anthony J. F.. 2020. Mutation. Britannica.com. [Online] Available at:
https://www.britannica.com/science/mutation-genetics. Accessed at November
15, 2020.
Hemsley, Anne, et al.. 1989. A simple method for site-directed mutagenesis using the
polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research: Vol. 12 No. 16.
Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation Second Edition. USA:
Cambridge University Press, New York.
Knight, Sean., Collins, Mary., & Takeuchi, Yasuhiro. 2013. Insertional Mutagenesis
by Retroviral Vectors: Current Concepts and Methods of Analysis. Current
Gene Therapy, 13: 211-227.
Labrou, N. 2010. Random Mutagenesis Methods for In Vitro Directed Enzyme
Evolution. Current Protein & Peptide Science, 11(1) 91-100. doi:
10.2174/138920310790274617.
Los, Marek., et al.. 2009. Apoptin, A Tumor-Selective Killer. Biochimia et BioPhysica
Acta 1793 (2009) 1335-1342.
Oswald, Nick. 2007. 8 Approces to Random Mutagenesis. New England Biolabs.
[Online] Available at: https://bitesizebio.com/252/8-approaches-to-random-
mutagenesis/. Accessed at 15 November, 2020.
Ram, Hasthi, et al.. 2019. Insertional Mutagenesis Approaches and Their Use in Rice
for Functional Genomics. Plants (Basel), 8(9): 310. doi:
10.3390/plants8090310.
Wells, James A., Vasser, Mark., Powers, David B. 1985. Cassette mutagenesis: an
efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Elsevier.
Gene, 34: 315-323.

Anda mungkin juga menyukai