Laporan Tugas Mandiri

Nama : Nabila Najma Tanggal : 16 November 2020

NPM : 1806150124 Paraf Asisten :

Kelompok :7

Topik : Pemicu 3 – Mutasi dan Mutagenesis

A. Outline
1. Jenis Modifikasi
a. Mutasi
b. Insersi
c. Delesi
d. Substitusi
2. Pemilihan Mutasi yang Tepat
3. Teknik Mutagenesis
a. Site-Directed Mutagenesis
b. Directed Mutagenesis
c. Random Mutagenesis
d. Insertional Mutagenesis
4. Protein Apoptin

B. Isi
1. Jenis Modifikasi
a. Mutasi
Mutasi merupakan perubahan materi genetic (genom) sel dari organisme hidup
atau virus yang lebih atau kurang permanen dan dapat diturunkan ke sel atau
virus (Griffiths, 2020). Organisme memiliki genom yang seluruhnya terdiri dari
DNA, sedangkan virus memiliki genom yang terdiri dari DNA dan RNA.
Mutasi pada DNA sel tubuh organisme multiseluler (mutase somatik) dapat
diturunkan ke sel turunan melalui replikasi DNA dan karenanya menghasilkan
sector atau tambalan sel yang memiliki fungsi abnormal, misalnya adalah
kanker (Griffiths, 2020). Mutasi dapat tercipta karena kecelakaan selama proses
transaksi kimiawi normal DNA, seringnya ditemukan selama replikasi, atau dari
 paparan radiasi elektromagnetik berenergi tinggi (sinar ultraviolet atau sinar-X)
atau radiasi partikel atau bahan kimia yang sangat reaktif.

Gambar 1. Mutasi (Sumber: genome.gov)

Mutasi yang mengubah urutan DNA dapat berdampak pada perubahan urutan
asam amino yang dapat menyebabkan protein kekurangan atau kehilangan
fungsinya. Perubahan pada urutan DNA pada area pengaturan gen dapat
memengaruhi waktu dan ketersediaan dari protein dan akan berdampak pada
malfungsi seluler. Pada sisi lain, banyak mutasi yang terjadi secara diam, tidak
menunjukkan efek yang jelas pada tingkat fungsional. Mutasi jenis ini tidak
menyebabkan perubahan asam amino yang signifikan.

b. Insersi
Insersi merupakan salah satu tipe mutasi yang melibatkan penambahan material
genetik. (Muenke of National Human Genome Research Institute). Mutasi
penyisipan dapat berupa penyisipan kecil yang melibatkan satu pasangan basa
DNA tambahan, atau berupa penyisipan besar melibatkan satu potongan
kromosom.
 Gambar 2. Insersi (Sumber: genome.gov)

c. Delesi
Delesi merupakan salah satu jenis mutasi yang melibatkan kehilangan materi
genetik. Dapat kehilangan yang kecil melibatkan satu pasangan basa DNA yang
hilang, atau kehilangan yang besar melibatkan satu potongan kromosom.
Berdasarkan ukurannya, delesi dapat menyebabkan efek yang berbeda, serta
dapat memengaruhi perilaku, dan tampilan fisik.

Gambar 3. Delesi (Sumber: genome.gov)

 d. Substitusi
Substitusi merupakan salah satu jenis mutasi di mana satu pasangan basa
digantikan dengan pasangan basa lain yang berbeda. Dapat juga diartikan
sebagai penggantian satu asam amino dalam protein dengan asam amino yang
berbeda.

Gambar 4. Substitusi (Sumber: genome.gov)

2. Pemilihan Mutasi yang Tepat

Dalam melaksanakan proyek mutagenesis, aspek terpenting yang perlu
diperhatikan adalah memutuskan mutase mana yang akan dibuat. Diperlukan
pertimbangan cermat yang perlu diberikan tidak hanya untuk nukleotida mana yang
akan bermutasi, namun untuk apa nukleotida tersebut harus dimutasi (Howe, 2007).

Untuk melakukan hal ini dengan benar, diperlukan pengetahuan yang dalam dan
rinci tentang fungsi urutan target. Jika urutan mengkodekan protein, maka beberapa
gagasan tentang struktur protein dan residu yang penting untuk fungsi protein
biasanya diperlukan. Idealnya, struktur tiga dimensi molekul perlu diketahui.

Penting juga untuk mengetahui bahwa perubahan kecil dalam urutan asam amino
dapat menyebabkan efek yang besar pada struktur tiga dimensi secara keseluruhan,
bahkan terdapat kemungkinan menghilangkan aktivitas, meskipun mungkin tidak
ada perubahan dalam urutan primer di situs aktifnya. Sebagai contoh, mutase kecil
dapat mengganggu lipatan dan menyebabkan perubahan structural berskala besar.

Pemodelan komputer memungkinkan prediksi efek mutasi tertentu pada struktur

tiga dimensi. Setelah protein mutan dibuat, perubahan juga dapat dideteksi dengan
analisis resonansi magnetic inti atau dichroisme sirkuler, atau dengan melihat
pengikatan antibodi dan resistensi protease yang mungkin berkurang pada protein
yang tidak terlipat dengan benar.
3. Teknik Mutagenesis
a. Site-Directed Mutagenesis
Site-directed mutagenesis merupakan alat yang ampuh dan banyak digunakan
di beberapa area biologi molekuler dan biokimia. Metode awal untuk
menggunakan mutagenesis yang diarahkan ke situs plasmid untai tunggal
(segmen plasmid) memberikan efisiensi yang rendah untuk mendapatkan urutan
mutan yang diinginkan (Hemsley et al., 1989). Kemudian diberikan perbaikan
yang menggunakan seleksi terhadap wild-type sequence, ternyata memakan
waktu dan usaha yang mahal untuk mengisolasi mutan.

Lalu dikembangkan PCR untuk menjadi pendekatan terbaru kepada site-

directed mutagenesis. Metode ini menggunakan primers yang mengandung satu
atau beberapa basa yang berbeda dari wild-type sequence yang digabungkan ke
dalam produk PCR setelah dilakukan PCR. Urutan yang diubah ini kemudian
dibelah dengan enzim restriksi dan disisipkan di tempat wild-type sequence.
Pendekatan ini relatif memakan waktu, dan bergantung pada keberadaan lokasi
pembatasan yang berlokasi strategis yang mengapit wild-type sequence yang
dimutasi.
1. Single-primer method
Metode ini dilakukan dengan melakukan reaksi PCR dengan menggunakan
forward dan reverse primers (Edelheit & Hanukoglu, 2009). Kemudian,
produknya ditransformasikan ke sel inang. Guideline untuk membuat
primer nya adalah sebagai berikut
- Urutan primer harus saling melengkapi.
- Panjang primer harus 10-20 nt urutan yang tidak dimodifikasi di kedua
sisi mutase.
- Basa yang bermutasi sebaiknya berada di tengah kedua primer.
- GC content: 40-70%
- Tm: 75-85°C untuk urutan yang tidak termasuk situs yang bermutasi.
- Primer harus dimulai dan diakhiri dengan setidaknya satu G atau C.
Gambar 5. Single-Primer Method (Sumber: Edelheit & Hanukoglu, 2009).
2. Cassette Mutagenesis
Merupakan sebuah metode untuk penyisipan kaset oligodeoksinukleotida
mutagenic yang efisien yang memungkinkan kejenuhan kodon asam amino
target dengan beberapa mutasi (Wells et al., 1985). Situs restriksi kemudian
diperkenalkan oleh prosedur mutagenesis yang diarahkan oligonukleotida
untuk mengapit kodon target di dalam plasmid yang mengandung gen. situs
restriksi yang akan dimasukkan dipilih berdasar pada keunikannya terhadap
plasmid, dan berdasarkan kedekatannya dengan kodon target dan konservasi
urutan kode asam amino akhir.

Situs restriksi yang mengapit di dalam plasmid kemudian dicerna dengan

enzim restriksi yang serumpun, dan kaset DNA dupleks sintetik pendek (10-
25 bp) dimasukkan. Kaset mutagenic dirancang untuk memulihkan
sepenuhnya wild-type coding sequence, kecuali pada kodon target. Selain
itu, dapat menghilangkan satu atau kedua situs pembatasan. Penghapusan
situs pembatasan memfasilitasi pemilihan klon yang mengandung kaset
oligodeoksinukleotida mutagenik.

Untuk membuat kaset, oligodeoksinukleotida untai tunggal dan

komplemennya disintesis di kolam terpisah yang berisi kodon berbeda di
atas target.

Gambar 6. Cassette Mutagenesis Method (Sumber: Wells et al.,

1985).
b. Directed Mutagenesis
Directed mutagenesis didefinisikan sebagai perubahan koding asam amino pada
tingkat DNA. Perubahan ini dapat dianalisis dengan mengkarakterisasi struktur
tiga dimensi dari protein menggunakan X-Ray crystallography.
Jenis-jenisnya adalah:
1. Oligonucleotide Directed Mutagenesis with M13 DNA.
2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis with Plasmid DNA.
3. PCR Amplified Oligonucleotide Directed Mutagenesis.
c. Random Mutagenesis
Random mutagenesis merupakan alat yang sangat banyak digunakan untuk
menghasilkan enzim dan protein dengan sifat tertentu yang diinginkan atau
ditingkatkan. Bukan hanya menghasilkan enzim dan protein saja, namun
seluruh jalur metabolisme dan seluruh genom dapat dihasilkan dengan sifat
tertentu yang diinginkan atau ditingkatkan. Terdapat banyak metode
pendekatan untuk menghasilkan keragaman genetik dengan random
mutagenesis dan menciptakan combinatorial libraries.
1. Error-prone PCR
Metode pendekatan ini menggunakan PCR yang ‘ceroboh’ di mana enzim
polimerase nya memiliki error rate yang tinggi (sampai 2%) untuk
mengamplifikasi wild-type sequence. PCR dapat dibuat untuk menjadi
rawan akan kesalahan dengan berbagai cara, termasuk meningkatkan MgCl2
dalam reaksi, menambahkan MnCl2 atau menggunakan konsentrasi yang
tidak sama dari setiap nukleotida (Oswald, 2007). Setelah diamplifikasi,
pustaka urutan pengkodean mutan harus diklon ke dalam plasmid yang
sesuai. Kelemahan dari pendekatan ini adalah ukuran pustaka nya dibatasi
oleh efisiensi langkah kloning, kemudian terdapat kemungkinan mutasi
delesi dan frameshift terjadi.
2. Rolling circle error-prone PCR
Merupakan salah satu varian dari error-prone PCR di mana wild-type
sequence nya pertama-tama dikloningkan ke dalam plasmid, setelah itu
diamplifikasi dengan PCR di dalam kondisi error-prone (rawan kesalahan).
Hal ini menghilangkan langkah ligasi yang membatasi ukuran perpustakaan
 dalam error-prone PCR, tetapi amplifikasi dari seluruh plasmid dinilai
kurang efisien dibandingkan mengamplifikasi urutan kode itu sendiri.
3. Mutator srains
Pada metode pendekatan ini wild-type sequence dikloningkan ke dalam
plasmid dan ditransformasikan ke dalam strain mutator, contohnya adalah
XL1-Red. XL 1-Red adalah strain E.coli yang memiliki kekurangan akan
tiga jalur perbaikan DNA primer (mutS, mutD, dan mutT) yang dapat
menyebabkan kesalahan selama proses replikasi DNA, termasuk pada saat
kloning ke dalam plasmid yang menyebabkan plasmid yang direplikasi
memiliki perbedaan dengan wild-type sequence.
4. Temporary mutator strains
Temporary mutator strains dapat dibangun dengan mengekspresikan
mutator allele secara berlebihan seperti mutD5 yang dapat membatasi
kemampuan sel untuk memperbaiki lesi DNA (Oswald, 2007).
Mengekspresikan mutD5 dari promotor yang dapat diinduksi
memungkinkan sel untuk berputar di antara mutagenik (ekspresi mutD5
aktif) dan normal (ekspresi mutD5 nonaktif). Periode pertumbuhan normal
memungkinkan sel untuk pulih dari mutagenesis, yang memungkinkan
strain ini tumbuh lebih lama daripada strain mutator konvensional.
5. Insertion mutagenesis
Menggunakan sistem yang didasarkan pada transposon untuk secara acak
menginsersi urutan pasangan 15 basa ke seluruh urutan yang diinginkan,
baik itu sisipan terisolasi atau plasmid. Memasukkan 5 kodon ke dalam
urutan memungkinkan gen apa pun dengan penyisipan untuk diekspresikan
(tidak ada pergeseran bingkai atau kodon berhenti yang disebabkan). Karena
penyisipannya acak, setiap salinan urutan nya akan mempunyai penyisipan
yang berbeda-beda sehingga menjadikannya sebuah library.
6. Ethyl methanesulfonate (EMS)
Merupakan sebuah mutagen kimia, EMS ini meningkatkan residu guanidin
yang menyebabkannya disalin secara tidak tepat selama replikasi DNA.
EMS dapat secara langsung mengubah DNA secara kimiawi, sehingga
mutagenesis EMS dapat dilakukan baik secara in vivo atau in vitro (Labrou,
2010).
 7. Nitrous acid
Merupakan sebuah mutagen kimia selain EMS yang dapat menghilangkan
residu adenin dan sitosin yan menyebabkan mutase titik transversi (A/T ke
G/C dan sebaliknya). Keuntungan memakai mutagen kimia adalah
sederhana dan ekonomis. Namun kekurangannya adalah tidak efisiennya
pengendalian laju mutase dan substitusi asam amino yang terbatas. Mutagen
kimia yang sering digunakan masih ada banyak lagi, salah satunya adalah
EMS dan nitrous acid.
8. DNA Shuffling
Merupakan metode yang ampuh di mana sebuah salinan dari gen yang sama
dengan jenis mutasi yang berbeda dikocok secara acak. Hal ini dilakukan
dengan mencerna library secara acak dengan DNAsel, kemudian secara
acak menggabungkan kembali fragmen menggunakan self-priming PCR.
Pengacakan dapat diterapkan ke pustaka yang dihasilkan oleh salah satu
metode di atas dan memungkinkan efek kombinasi mutase yang berbeda
untuk diuji (Oswald, 2007).

d. Insertional Mutagenesis
Insertional mutagenesis merupakan alat genetik yang penting untuk penemuan
gen menggunakan T-DNA, retrotransposon, penyisipan aktivator/disosiasi
(Ac/Ds), dan transposon (Ram, 2019). Transposon dikenal juga sebagai jumping
genes, merupakan urutan DNA seluler kecil yang dapat berpindah ke posisi
yang berbeda di dalam genom. Insertional mutagenesis telah banyak digunakan
untuk membuat perpustakaan mutan yang memungkinkan identifikasi yang
mudah dari sebuah gen yang diberi tag dengan menggunakan teknik berbasis
PCR, salah satunya adalah thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)
atau Inverse PCR (Ram, 2019).
1. Retroviral Insertional Mutagenesis
Retroviral insertional mutagenesis pertama kali diidentifikasi pada viral
oncogenesis, di mana integrasi provirus pada sel inang genome
menyebabkan transformasi sel dan kemudian menyebabkan perkembangan
tumor. Metode ini disebabkan oleh replikasi jenis virus tertentu. Retrovirus
mampu mengatur ekspresi gen seluler dalam jarak jauh, dan oleh karena itu
 perubahan ekspresi gen terdekat ke lokasi integrasi mungkin bukan yang
terpenting dalam transformasi seluler (Knight, 2013).

Terdapat beberapa mekanisme di mana retrovirus dan vektor retroviral

dapat menyebabkan insertional mutagenesis. Mekanisme ini dapat dibagi
menjadi tiga kategori, yaitu aktivasi virus transkripsi gen seluler, perubahan
pemrosesan RNA dan inaktivasi gen penekan tumor.
2. Signature Tagged Mutagenesis
Signature tagged mutagenesis merupakan sebuah pendekatan genetik yang
dikembangan untuk mengidentifiksai faktor virulensi bakteri baru
(Cummins & Gahan, 2012). STM merupakan sebuah metode selektif negatif
yang menggunakan tag identifikasi unik untuk memungkinkan analisis
kumpulan mutan dalam populasi campuran.

STM berbasis pada random transposon mutagenesis, tapi memungkinkan

untuk melakukan analisis paralel dari strain mutan yang berasal dari bakter
pathogen yang diinginkan. Dalam STM setiap mutan ditandai dengan urutan
DNA yang unik yang diurutkan sedemikian rupa sehingga semua tag dapat
diamplifikasi bersama dari DNA populasi campuran mutan dengan satu
PCR.

Metode asli yang digunakan untuk mendeteksi signature tag adalah dengan
dot blot tetapai seiring berjalannya waktu, terdapat banyak metode yang
digunakan seperti PCR dan polyumorphic tag-length transposon
mutagenesis.

Kelebihan pendekatan STM ini adalah metode selektif negative yang

memungkinkan untuk penemuan gen virulensi tanpa pengetahuan terdahulu
tentang sifat atau fungsinya. Kemudian jumlah besar mutan dapat disaring
secara bersamaan, metode ini pada prinsipnya jauh lebih cepat dan lebih
lengkap dalam mengidentifikasi faktor virulensi dibandingkan dengan
sistem transposon standar.
 Namun metode ini juga memiliki kelemahan,m yaitu terbatasnya untuk
menemukan gen yang tidak penting. Selain itu, beberapa tag DNA tidak
dapat diamplifikasi dari DNA kromosom bakteri setelah pemulihan dari
inang hewan. Kelemahan dari sistem ini juga ditunjukkan dengan adanya
bias yang dapat disebabkan oleh beberapa faktor, seperti pemilihan model
hewan, cara infeksi dan organ sasaran. Redundansi mungkin juga
disebabkan oleh fakta bahwa transposon tidak dimasukkan secara acak.

4. Protein Apoptin
Apoptin merupakan sebuah protein yang dapat menginduksi apoptosis kecil, dan
diturunkan dari chicken anemia virus (CAV) yang termasuk ke dalam genus
Gyrovirus dan family Circoviridae yang mengandung satu untai DNA sirkuler
minus (Los et al., 2009).

Gambar 7. Struktur primer apoptin (Sumber: Los et al., 2009).

Apoptin terdiri atas 121 asam amino dan tidak menunjukkan homologi urutan yang
signifikan dengan protein seluler yang diketahui. Ujung terminal C dari apoptin
mengandung bipartite nuclear localization sequence (NLS). NLS1 menjangkau
asam amino 82-88, dan NLS2 pada asam amino 111-121. Tambahannya, apoptin
mengandung sebuah putative nuclear export sequence (NES) pada asam amino 97-
105. Apoptin juga memiliki peregangan pendek kaya leusin hidrofobik pada asam
amino 33-46 yang diperlukan untuk asosiasi diri serta pengikatan protein leukemia
promielositik dan interaksi lainnya.
 Apoptin biasanya dimediasi oleh caspase, yaitu protease sistein intraseluler.
Caspase berfungsi sebagai inisiator dan eksekutor dalam proses apoptosis. Aktivasi
caspase dilakukan dengan dua rute pensinyalan yang utama: reseptor kematian
ekstrinsik dan jalur mitokondria intrinsik. Dalam jalur ekstrinsik, ligasi reseptor
kematian oleh ligan yang serumpun memicu perekrutan adaptor FADD dan inisiator
caspase-8 ke dalam kompleks pensinyalan yang menyebabkan kematian (Los et al.,
2009).

Sedangkan jalur mitokondria dimulai dengan pelepasan sitokrom c ke dalam

sitosol, yang merupakan sebuah proses yang diatur secara ketat oleh protein pro dan
antipoptosis dari keluarga Bcl-2. Setelah dilepaskan, sitokrom c mengikat protein
adaptor Apaf-1 yang memungkinkan aktivasi inisiator caspase-9 dalam kompleks
berbobot molekul tinggi yang disebut apoptosom. Kedua jalur pensinyalan tersebut
kemudian bertemu pada aktivasi caspase efektor hilir, yang menyebabkan kematian
sel melalui pembelahan beberapa substrat seluler (Los et al., 2009).

C. Daftar Pustaka
Cummins, Joanne & Gahan, Cormac G. M.. 2012. Signature tagged mutagenesis in the
functional genetic analysis of gastrointestinal pathogens. Gut Microbes, 3(2):
93-103. doi: 10.4161/gmic.19578.
Edelheit, Oded., Hanukoglu, Aaron., Hanukoglu, Israel. 2009. Simple and efficient site-
directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate
mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnol 9, 61.
https://doi.org/10.1186/1472-6750-9-61.
Griffiths, Anthony J. F.. 2020. Mutation. Britannica.com. [Online] Available at:
https://www.britannica.com/science/mutation-genetics. Accessed at November
15, 2020.
Hemsley, Anne, et al.. 1989. A simple method for site-directed mutagenesis using the
polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research: Vol. 12 No. 16.
Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation Second Edition. USA:
Cambridge University Press, New York.
Knight, Sean., Collins, Mary., & Takeuchi, Yasuhiro. 2013. Insertional Mutagenesis
by Retroviral Vectors: Current Concepts and Methods of Analysis. Current
Gene Therapy, 13: 211-227.
Labrou, N. 2010. Random Mutagenesis Methods for In Vitro Directed Enzyme
Evolution. Current Protein & Peptide Science, 11(1) 91-100. doi:
10.2174/138920310790274617.
Los, Marek., et al.. 2009. Apoptin, A Tumor-Selective Killer. Biochimia et BioPhysica
Acta 1793 (2009) 1335-1342.
Oswald, Nick. 2007. 8 Approces to Random Mutagenesis. New England Biolabs.
[Online] Available at: https://bitesizebio.com/252/8-approaches-to-random-
mutagenesis/. Accessed at 15 November, 2020.
Ram, Hasthi, et al.. 2019. Insertional Mutagenesis Approaches and Their Use in Rice
for Functional Genomics. Plants (Basel), 8(9): 310. doi:
10.3390/plants8090310.
Wells, James A., Vasser, Mark., Powers, David B. 1985. Cassette mutagenesis: an
efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Elsevier.
Gene, 34: 315-323.