Evolusi dan Epidemiologi Multidrug-Resistant Klebsiella pneumoniae di Inggris dan Irlandia

Danesh Moradigaravand, a Veronique Martin, b Sharon J.Perak, a, c, d Julian Parkhilla

Klebsiella pneumoniae adalah lingkungan umum Gram-negatif yang terkait dengan manusia
dan hewan bakteri yang telah menjadi penyebab utama infeksi nosokomial di seluruh dunia
(1-4). Umumnya ditemukan sebagai bakteri komensal, K. pneumoniae
berpotensi menyebabkan berbagai macam infeksi, termasuk jaringan lunak, luka, dan infeksi
saluran pernapasan, khususnya pada pasien dengan gangguan sistem kekebalan (3).
Selain banyak laporan tentang infeksi nosokomial, K. pneumoniae telah diamati
menyebabkan infeksi yang didapat dari komunitas (1, 3). Infeksi K. pneumoniae sering
dideteksi sebagai wabah di rangkaian perawatan kesehatan, khususnya di unit neonatal (5).
K. pneumoniae dapat ditularkan melalui peralatan medis dan produk darah (6, 7) dan dapat
dibawa ke dalam saluran usus pasien dan di permukaan kulit personel rumah sakit (3, 8, 9).
K. pneumoniae juga dapat menyebabkan penyakit invasif pada berbagai spesies hewan (10,
11), dan hewan serta sumber makanan telah diusulkan untuk menjadi reservoir potensial
bagi K. pneumoniae (12). Sejalan dengan keragaman mikroba yang tinggi dari relung yang
ditempati K. pneumoniae, penelitian terbaru menunjukkan bahwa spesies ini memiliki
pangenome yang fleksibel dan beragam yang mengandung banyak gen aksesori yang
memungkinkan bakteri beradaptasi dengan berbagai habitat dan merespons tekanan
lingkungan seperti pengobatan antibiotik. (4). Holt dkk. (4) menghasilkan filogeni global
isolat K. pneumoniae dari sumber lingkungan dan rumah sakit dan menunjukkan bahwa
dalam terang bukti filogenetik rinci, kompleks spesies K. pneumoniae dapat dibagi menjadi
tiga spesies berbeda yang disebut K. pneumoniae (KpI) , K. quasipneumoniae (KpII), dan K.
variicola (KpIII) yang kesemuanya diketahui menyebabkan infeksi pada manusia (13, 14)
dan masing-masing mengandung keanekaragaman yang tinggi. Sejak itu, jumlah studi
genomik klinis K. pneumoniae meningkat. Sementara beberapa dari studi ini telah
melaporkan penyebaran cepat dari strain tertentu dari K. pneumoniae di suatu wilayah /
negara (15-17), yang lain berfokus pada wabah di satu rumah sakit (18, 19). Dalam kedua
kasus tersebut, penyelidikan biasanya mengidentifikasi strain yang resisten multidrug
(MDR), khususnya strain yang resisten terhadap karbapenem. Pengobatan infeksi K.
pneumoniae menjadi lebih sulit karena munculnya K. pneumoniae dari garis keturunan MDR
ini. Garis keturunan ini membawa berbagai macam gen resistensi antimikroba yang
membatasi pilihan yang tersedia untuk secara efektif mengobati infeksi K. pneumoniae.
Mekanisme resistensi yang diketahui termasuk produksi -laktamase seperti spektrum-luas
-laktamase (ESBLs), sefalosporinase, dan karbapenemase (20-24). Penyebaran resistensi
terkait dengan elemen genetik seluler yang juga dapat membawa determinan virulensi yang
meningkatkan kemampuan bakteri untuk berkoloni dan membentuk infeksi di dalam inang
(3, 25). Faktor-faktor ini termasuk kapsul, berbagai perekat yang diperlukan untuk
melekatnya bakteri ke jaringan inang, dan siderofor untuk penyerapan zat besi (26, 27).
Karena semakin pentingnya MDR K. pneumoniae, penting untuk memahami struktur
populasinya dan hubungan antara ini dan keragaman genetik dari resistensi antibiotik.
Namun, sementara kita sekarang memiliki pemahaman yang lebih baik tentang keragaman
global spesies ini dan wabah di satu rumah sakit, asal dan penularan nasional MDR K.
pneumoniae yang terlibat dalam infeksi rumah sakit sebagian besar masih belum diketahui.
Untuk mengatasi hal ini, kami menggunakan analisis genomik dan filogenetik untuk
menyelidiki koleksi sistematis dari isolat MDR K. pneumoniae yang diperoleh dari rumah
sakit di Inggris Raya dan Irlandia selama dekade terakhir. Secara khusus, kami
menganalisis struktur populasi ini dalam konteks koleksi utama K. pneumoniae yang baru-
baru ini diterbitkan untuk menjelaskan posisi dan kemunculan isolat MDR Inggris dan
Irlandia baru-baru ini dari dalam populasi global. Selain itu, kami secara sistematis
mengidentifikasi distribusi gen yang diketahui yang mengkode faktor virulensi dan
determinan resistensi antibiotik dalam populasi.

HASIL Kami pertama kali menempatkan isolat MDR K. pneumoniae dari koleksi Inggris dan
Irlandia dalam konteks struktur populasi global. Pohon filogenetik gabungan yang dihasilkan
mengungkapkan bahwa isolat MDR Inggris dan Irlandia berada di beberapa cabang pohon
global tetapi beberapa klade sebagian besar terdiri dari sampel Inggris Raya (Gbr. 1A). Juga
terbukti bahwa populasi MDR K. pneumoniae Inggris dan Irlandia sama beragamnya dengan
populasi global, yang menunjukkan bahwa garis keturunan yang ditemukan dalam koleksi
Inggris Raya dan Irlandia mungkin memiliki banyak sumber di luar Inggris Raya. Seperti
yang ditunjukkan sebelumnya untuk koleksi global Holt et al. (4), koleksi MDR Inggris Raya
berisi pembagian yang dalam antara spesies utama K. pneumoniae. Spesies KpI, KpIIA,
KpnIIB, dan KpIII semuanya terwakili dalam koleksi Inggris dan Irlandia, dengan spesies KpI
mendominasi (Gbr. 1A). Sejalan dengan Holt et al. (4), kami juga mengidentifikasi puncak
yang berbeda, mewakili dua skala waktu yang berbeda dari divergensi filogenetik, dalam
distribusi jarak berpasangan single-nucleotide polymorphism (SNP) (Gbr. 1B). Puncak
50.000 SNP dengan latar belakang kuning pada Gambar. 1B menunjukkan perbedaan
antara spesies KpI, KpIIA, KpIIB, dan KpIII. Sebaliknya, puncak lainnya, yang ditunjukkan
dengan latar belakang biru pada Gambar 1B, sesuai dengan kelompok cabang panjang dan
pendek yang berbeda terutama dalam spesies KpI dan dalam beberapa kasus dalam
spesies KpII dan KpIII. Distribusi jarak SNP berpasangan untuk isolat dari jenis urutan yang
sama atau berbeda (ST) menunjukkan bahwa resolusi pengetikan urutan multilokus (MLST)
sebagian besar terbatas pada jarak SNP 10.000 SNP (lihat Gambar. S1A dalam materi
tambahan). Pemetaan ST di Inggris dan Irlandia MDR K. pneumoniae isolat ke pohon
filogenetik mengungkapkan tingkat kesesuaian yang tinggi antara MLST dan filogeni
berbasis urutan seluruh-genom, menunjukkan kekuatan diskriminatif MLST dalam
mendeteksi klade mayor (Gbr. S1B ). Analisis MLST dari isolat Inggris dan Irlandia
menunjukkan berbagai ST, dengan ST15 menjadi

yang paling umum (Gbr. S1C). Beberapa ST yang ada dalam koleksi kami, seperti ST15 dan
ST147, diketahui terkait dengan resistensi multidrug di seluruh dunia (28, 29) dan
khususnya di Eropa (30). Untuk mengidentifikasi perkenalan potensial ke, dan penyebaran
selanjutnya dari garis keturunan di dalam, koleksi isolat MDR Inggris dan Irlandia, kami
selanjutnya berfokus pada divergensi antara isolat dari ST yang sama, yaitu, isolat yang
terpisah 10.000 SNP, di dalam MDR Inggris dan Irlandia isolat dan antara isolat MDR Inggris
dan Irlandia dan isolat global (Gbr. 2A). (Perhatikan bahwa kami tidak menghapus wilayah
yang direkombinasi pada tahap ini, jadi nilai ini mencakup SNP karena mutasi titik, serta
yang disebabkan oleh rekombinasi.) Untuk tujuan ini, kami menggambar ulang pohon
dengan memasukkan semua isolat Inggris Raya dan Irlandia dan setiap isolat dari kedua
koleksi yang 10.000 SNP jauh dari isolat Inggris Raya dan Irlandia. Pohon yang dihasilkan
menunjukkan bahwa sebagian besar isolat yang termasuk dalam koleksi Inggris dan Irlandia
berkerumun dalam klade yang terkait erat, dengan isolat dari koleksi global sering kali
bersifat basal, tetapi kadang-kadang diselingi di dalam, klade ini (Gbr. 2A). Menggunakan
informasi rinci tentang sumber infeksi K. pneumoniae untuk Holt et al. (4) isolat, kami
menemukan bahwa isolat yang berasal dari nosokomial tampaknya terlalu banyak terwakili
(yaitu, tampak lebih sering terkait dengan isolat Inggris dan Irlandia daripada yang
diharapkan dari frekuensi mereka dalam koleksi Holt et al. (4) [ Gambar. 2B]) dibandingkan
dengan K. pneumoniae yang didapat dari komunitas. Selain itu, kami menemukan beberapa
isolat asal bukan manusia (monyet, sapi, dan tikus) dan isolat klinis bukan manusia tersebar
di pohon ini. Hal ini menunjukkan bahwa hewan dan lingkungan dapat berfungsi sebagai
reservoir tersembunyi dari klinis MDR K. pneumoniae, seperti yang telah diusulkan untuk
makanan hewan dan daging eceran (12). Untuk menganalisis lebih lanjut hubungan antara
isolat MDR Inggris dan Irlandia dan koleksi global, kami membangun beberapa pohon yang
terdiri dari isolat Inggris Raya dan Irlandia dan setiap isolat dari koleksi global yang berada
dalam jarak SNP tertentu dari Inggris Raya mengisolasi untuk berbagai jarak SNP. Kami
kemudian menghitung proporsi dan asal isolat global yang muncul di pohon pada setiap titik
potong jarak SNP. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pohon yang terbatas pada isolat
yang paling dekat kerabatnya seluruhnya terdiri dari isolat Inggris Raya dan Irlandia,
sedangkan isolat global dari Nepal, Belanda, Italia, dan Spanyol muncul secara berurutan
saat pintasan diperlebar (Gbr. 2D). Meskipun hal ini mungkin didorong sampai batas tertentu
oleh bias dalam pengumpulan, kami mencatat bahwa situs yang paling sering diambil
sampelnya belum tentu situs yang tampak paling dekat dengan wilayah Inggris Raya dan
Irlandia. Hubungan ini menunjukkan transmisi langsung atau tidak langsung yang sering
antara Inggris dan Irlandia dan terutama Eropa tetapi juga negara-negara yang secara
geografis sangat jauh, menunjukkan bahwa isolat MDR K. pneumoniae Inggris dan Irlandia
adalah bagian dari garis keturunan yang bersirkulasi secara global

Pohon filogenetik pada Gambar. 2A terdiri dari beberapa ST besar yang lebih sering terjadi
pada populasi dibandingkan ST lainnya. Kami mengidentifikasi klade yang sesuai dengan
ST15, ST16, ST147, ST101, dan ST874, yang berisi setidaknya 10 isolat MDR K.
pneumoniae Inggris dan Irlandia dan menunjukkan berbagai derajat heterogenitas geografis.
Kecuali untuk klade ST874, yang berisi satu isolat ST103, klade lainnya homogen dan
hanya terdiri dari satu ST. Kami menggunakan analisis filogenetik tertanggal Bayesian di
BEAST untuk menghitung laju substitusi genom dan memperkirakan tanggal leluhur
bersama (MRCA) terbaru dari isolat MDR Inggris dan Irlandia dan isolat non-Britania Raya
terdekat di setiap klade ( Gambar 3A sampai C). Tingkat substitusi menunjukkan beberapa
variasi di seluruh clades, tetapi rata-rata ~ 3,8 SNP per genom per tahun (6,34 10 7 SNP per
situs per tahun) (Gbr. 3B). Pohon filogenetik yang berumur menunjukkan bahwa sebagian
besar klades terbentuk dalam beberapa dekade terakhir (Gbr. 3A dan C). Klade ST101 dan
ST874 seluruhnya terdiri dari isolat Inggris tetapi masing-masing terbentuk 100 tahun lalu
dan 20 tahun lalu. Sementara isolat ST101 berasal dari berbagai rumah sakit di Inggris dan
Irlandia, klade ST874 termasuk dua wabah diduga terkait di dua rumah sakit yang berbeda
(Gbr. 3A). Klade ST16 dengan MRCA selama 25 tahun sebagian besar terdiri dari wabah di
Inggris dan isolat dari infeksi sporadis isolat penghasil karbapenemase blaOXA-48 di dua
rumah sakit di Spanyol (15) dan dua isolat dari Italia (karena tahun isolasi, isolat Spanyol
tidak termasuk dalam pohon Bayesian ST16 pada Gambar. 3A). Klade ST147 dan ST15
lebih beragam secara geografis dan memiliki MRCA masing-masing selama 39 dan 48
tahun. Klade ST147 termasuk empat isolat MDR dari dua rumah sakit di Italia (16) dan
beberapa isolat dari Vietnam, Laos, dan Nepal yang terkait dengan kemungkinan wabah
yang disebabkan oleh isolat MDR Inggris dan Irlandia. Klade ST15 sangat beragam, terdiri
dari wabah terkait yang disebabkan oleh pengumpulan isolat MDR Inggris dan Irlandia dan
yang dilaporkan sebelumnya di Nepal dan Belanda (18, 19, 31), yang menyimpang dari
Inggris dan Irlandia MDR isolat 13 dan 15 tahun yang lalu, masing-masing (Gbr. 3A). Secara
keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa isolat MDR K. pneumoniae Inggris dan Irlandia
di ST utama ini terhubung ke isolat global, yang terkadang berasal dari wabah encoding
karbapenemase dan strain MDR. Karena koleksi kami sangat rentan terhadap imipenem,
hubungan dengan wabah ini menunjukkan potensi risiko munculnya strain yang resisten
terhadap karbapenem di dalam rumah sakit di Inggris dalam waktu dekat. Untuk
menggeneralisasi temuan dari ST utama, pertama-tama kami mengeluarkan isolat dari ST
utama dari populasi dan kemudian menggunakan laju substitusi rata-rata untuk
mendapatkan asal transmisi nyata dari pengumpulan global ke Inggris dan Irlandia yang
terjadi dalam periode terakhir ~ 20 tahun, yaitu sejak pembentukan clade ST874 sebagai
clade terbaru. Hasil penelitian menunjukkan bahwa divergensi baru-baru ini pada skala
waktu ini melibatkan isolat dari beberapa negara (Gambar 3D). Secara khusus, beberapa
isolat ST307 dari Italia dan Nepal menunjukkan perbedaan baru-baru ini dari satu isolat
MDR Inggris dan Irlandia. Selain itu, dua isolat MDR Inggris dan Irlandia tampaknya berasal
dari klade ST11, yang terdiri dari isolat dari penyebaran baru-baru ini dari garis keturunan
resisten karbapenem di seluruh Spanyol, lebih jauh menggarisbawahi risiko penyebaran
strain resisten karbapenem ke Inggris Raya. rumah sakit.

Keragaman genom dari koleksi MDR United Kingdom K. pneumoniae juga terlihat dalam
ukuran genom aksesori. Jumlah gen dalam genom inti, yaitu jumlah gen yang dimiliki oleh
99% isolat, adalah 2.958, lebih tinggi dari 1.743 yang dilaporkan untuk koleksi global (4),
mungkin merupakan cerminan dari keragaman yang lebih tinggi di dalamnya. koleksi.
Genom inti lunak (gen yang dimiliki oleh 95% dan 99% isolat) memiliki tambahan 543 gen.
Genom non inti (gen yang dimiliki oleh 0% dan 95% isolat) berukuran sangat besar, terdiri
dari 25.044 gen. Genom yang dapat dibuang yang besar ini juga sebagian disebabkan oleh
adanya beberapa plasmid dalam isolatnya. Isolat tersebut sebagian besar menyimpan
plasmid dengan replikasi Kpn3, FIIK, PKP91, dan Col (Gambar S2). Dari jumlah tersebut,
FIIk, FIBk, dan Kpn3 telah dilaporkan membawa banyak beta-laktamase, terutama
sefalosporinase, dan sering dimiliki oleh anggota keluarga Enterobacteriaceae (32, 33).

Infeksi oleh K. pneumoniae melibatkan sejumlah interaksi inang atau faktor virulensi,
termasuk protein produksi kapsul, fimbriae, lipopolisakarida, siderofor, dan pompa eflux (26).
Data kami menunjukkan bahwa gen kapsul (wzi), gen reseptor aerobaktin siderofor (iutA),
dan gen fimbrial (mrk) sering terdapat pada setiap isolat (Gambar S3). Sebaliknya, gen
yersiniabactin (ybt), iron transporter permease gen (kfuB dan kfuC), dan iron regulator
protein genes (irp1 and irp2), semuanya terlibat dalam metabolisme besi, hanya terdapat
pada sebagian isolat yang terkandung dalam klade tertentu. (Gbr. S3A), menunjukkan
bahwa isolat dalam klade ini mengembangkan berbagai mekanisme penyerapan zat besi
dan mungkin memiliki potensi untuk berubah menjadi strain K. pneumoniae hipervirulen baru
(Gbr. S3A). Keragaman siderofor yang lebih tinggi telah disarankan untuk membuat bakteri
lebih mampu mengambil zat besi lingkungan dengan menghindari lebih banyak bakteri
penipu yang tidak menghasilkan siderofor (34). Efisiensi penyerapan zat besi yang lebih
tinggi dapat mengakibatkan perubahan fenotipe seperti produksi kapsul yang lebih tinggi,
yang terlibat dalam pembentukan fenotipe hipervirulen (27, 35, 36). Lebih lanjut, jumlah gen
virulensi bervariasi di seluruh ST utama dan tampaknya relatif lebih tinggi pada ST101,
ST336, dan ST29, yang memberikan bukti genomik karakteristik virulensi diferensial
(Gambar S3B). Ketersediaan MIC kuantitatif, daripada klasifikasi resisten / rentan kualitatif,
memungkinkan kami untuk secara langsung mengidentifikasi determinan genetik yang
menyebabkan peningkatan resistensi antibiotik pada MDR K. pneumoniae (Gambar S4).
Seperti yang diharapkan, kami menemukan korelasi yang tinggi antara MIC antibiotik
dengan mekanisme aksi yang serupa, seperti minocycline dan turunannya tigecycline dan
cefuroxime / cefotaxime (Gbr. S5A). Hasil fenotipe menunjukkan bahwa populasi secara
luas resisten, yaitu, 50% populasi, terhadap penisilin amoksisilin (rentan [S], 0; menengah
[I], 0; resisten [R], 250), amoksisilin-klavulanat ( S, 78; I, 0; R, 172), dan piperacillin-
tazobactam (S, 58; I, 72; R, 120); sefalosporin seftazidim (S, 78; I, 11; R, 161), sefotaksim
(S, 77; I, 1; R, 147), dan sefuroksim (S, 15; I, 0; R, 235); ciprofloxacin (S, 62; I, 24; R, 164);
dan gentamisin aminoglikosida (S, 116; I, 0; R, 134). Sebaliknya, koleksinya kurang resisten
terhadap imipenem, antibiotik karbapenem yang digunakan dalam penelitian ini (S, 248; I, 2;
R, 0), serta tigecycline (S, 120; I, 72; R, 51) ( Gambar S5B). Kami menemukan bahwa
peningkatan resistensi terhadap sebagian besar antibiotik telah muncul di seluruh pohon,
menunjukkan bahwa evolusi berkelanjutan dari MDR K. pneumoniae clades didorong oleh
pengobatan antibiotik (Gbr. S5C). Di antara ST utama yang diidentifikasi di sini, ST101 dan
ST147 lebih resisten terhadap tetrasiklin dan ST101 dan ST340 lebih resisten terhadap
sefotaksim dan ciprofloxacin, seperti yang ditunjukkan oleh distribusi MIC di seluruh ST
utama (Gbr. S5D). Resistensi K. pneumoniae terhadap obat beta-laktam dikaitkan terutama
dengan adanya ESBL (3). MIC amoxicillin-clavulanate, ceftazidime, dan cefuroxime untuk
isolat penghasil ESBL dalam koleksi kami lebih tinggi daripada untuk isolat non-penghasil
ESBL (Gbr. S5E), dan isolat ini tampaknya menghasilkan berbagai betalaktamase,
beberapa di antaranya diketahui untuk mengarah pada fenotipe penghasil ESBL. Terutama,
gen blaCTX-M-15, yang telah dilaporkan tersebar luas di seluruh Eropa (37), dan varian
blaSHV SHV-12, SHV-39, SHV-100, dan SHV-40 diperoleh melalui isolat di seluruh pohon.
(Gambar S6A). Gen-gen ini, bersama dengan gen pengkode ESBL yang diduga langka
seperti blaCTX-M-26, blaSHV-27, dan blaSHV-5, menyumbang 95% dari fenotipe ESBL,
dan beberapa di antaranya sangat terkait dengan peningkatan tingkat resistensi terhadap
betalactams (Gbr. S6B). Gen penyandi beta-laktamase varian ini diperoleh beberapa kali di
seluruh pohon sebagai gen pelengkap dan dikaitkan dengan peningkatan resistensi
terhadap amoksisilin, ceftazidime, dan cefuroxime dalam isolat dengan MIC tinggi (Gbr.
S6C). Selain ESBL, resistensi terhadap sefalosporin dan cephamycin dapat dimediasi oleh
AmpC beta-laktamase pada anggota famili Enterobacteriaceae. Meskipun K. pneumoniae
diketahui tidak memiliki gen ampC yang terletak secara kromosom, delapan varian ampC
dalam genom aksesori tampaknya diperoleh secara sporadis oleh isolat di sepanjang pohon
filogenetik. Salinan tambahan dari gen ampC secara eksklusif terdapat dalam satu isolat,
yaitu 12045_7 # 42, dengan cakupan baca 40 di seluruh gen, yang memiliki MIC cefoxitin
tertinggi, sebagai satu-satunya cephamycin yang dipelajari di sini. Gen tersebut tampaknya
terkait dengan protein fag dan terjadi dalam konteks beberapa plasmid K. pneumoniae.
Varians MIC cefoxitin untuk isolat lain mungkin disebabkan oleh mekanisme resistensi lain,
seperti perbedaan tingkat ekspresi beta-laktamase. Meskipun beberapa laporan wabah K.
pneumoniae penghasil karbapenemase, resistensi karbapenem relatif tidak umum di Eropa
Barat (38), dan ini berlaku untuk koleksi kami. Dalam satu isolat yang menunjukkan MIC
tinggi imipenem (8 g / ml), gen blaNDM1, yang mengkode karbapenemase
Enterobacteriaceae dominan yang pertama kali terdeteksi di India dan Pakistan, hadir (39).
Ekspresi pompa limbah tetrasiklin adalah mekanisme resistensi yang diketahui di berbagai
spesies (40). Dalam isolat kami, selain gen pengkode protein tetA dan tetD tetrasiklin yang
terletak secara kromosom, yang ditemukan dalam genom inti, salinan tambahan tetA dan
tetD telah diperoleh oleh beberapa isolat, dan ini tampaknya terkait dengan peningkatan
MICs. (Gbr. S6D dan E). Tiga kelas enzim pengubah aminoglikosida (adenylyltransferases,
phosphotransferases, dan acetyltransferases) umumnya memberikan resistensi gentamisin
pada anggota keluarga Enterobacteriaceae. Sejumlah isolat yang tersebar di seluruh pohon
tampaknya telah memperoleh gen penyandi resistensi gentamisin yang berbeda secara
independen, yang meliputi terutama aminoglikosida asetiltransferase [aac (6 =) dalam 125
isolat dan aac (3) -II pada 97 isolat] -, adenylyltransferase (aadA pada 93 isolat) -, dan
fosfotransferase (gen strA dan strB dalam 83 isolat dan aph (3 =) -I dalam 46 isolat) - gen
pengkode. Mirip dengan gentamisin, ciprofloxacin dilaporkan masih menjadi pengobatan
yang efektif untuk infeksi K. pneumoniae, meskipun tingkat resistensi ciprofloxacin pada K.
pneumoniae telah meningkat baru-baru ini (41, 42). Resistensi siprofloksasin umumnya
dimediasi melalui mutasi pada gen gyrB dan gyrA (gyrase) dan gen parC (topoisomerase
IV). Dalam koleksi kami, mutasi nonsynonymous gyrB E468D, yang sebelumnya dilaporkan
meningkatkan MIC sebanyak 8 kali lipat, telah muncul sebagai hasil dari dua mutasi titik
yang berbeda pada empat dan enam isolat dan sangat terkait dengan peningkatan MIC
ciprofloxacin (P 0,0001 [Student's t tes]) (43).

PEMBAHASAN Kami menggunakan pendekatan genomik dan filogenetik untuk

menganalisis kumpulan isolat MDR K. pneumoniae yang secara sistematis diperoleh dari
infeksi aliran darah di rumah sakit di Inggris dan Irlandia. Secara khusus, kami mempelajari
struktur populasi dan variasi dari koleksi ini dalam konteks filogenetik dari koleksi K.
pneumoniae global lainnya untuk mengungkap hubungan spesifik antara isolat Inggris dan
Irlandia dan isolat global. Selain itu, ketersediaan data kerentanan obat (MIC)
memungkinkan kami untuk mengidentifikasi determinan genetik yang terkait dengan
resistensi antibiotik. Temuan kami menunjukkan bahwa populasi K. pneumoniae di Inggris
dan Irlandia sangat beragam, mencakup isolat dari garis keturunan utama K. pneumoniae
dan berbagai ST, beberapa di antaranya telah dikaitkan dengan penyebaran global K.
pneumoniae (28). Secara khusus, kami menemukan bahwa beberapa klon MDR K.
pneumoniae telah muncul baru-baru ini dan menyebar ke seluruh negeri dan dalam
beberapa kasus telah menimbulkan wabah. Selain itu, ada hubungan yang jelas antara
isolat Inggris dan Irlandia dan wabah di rumah sakit terutama Eropa. Kami mencatat bahwa
kerabat terdekat MDR K. pneumoniae di Inggris dan Irlandia lebih mungkin diisolasi dari
infeksi nosokomial daripada yang didapat dari komunitas. Ini menyoroti pentingnya
mengidentifikasi reservoir putatif K. pneumoniae yang mungkin terlibat dalam penularan K.
pneumoniae antara rumah sakit yang jauh dan dengan demikian mengarah pada sirkulasi
global K. pneumoniae. Sebagai patogen oportunistik komensal, K. pneumoniae memiliki
potensi untuk menyebar dengan cepat antar rumah sakit melalui pengangkutan pada pasien
yang ditransfer antar negara, wisatawan medis, atau produk darah (44). Penelusuran lebih
lanjut dari pasien yang terlibat dalam penularan antar negara dapat membantu menemukan
perantara yang hilang dalam rantai penularan dan, dengan melakukan itu, menentukan
tingkat penularan langsung ke rumah sakit tidak langsung.

Kami menemukan bahwa faktor penentu genetik yang meningkatkan tingkat resistensi (MIC)
telah muncul di seluruh populasi. Temuan ini, bersama dengan pengamatan bahwa isolat
MDR UnitedKingdom dan Irlandia bersarang dalam koleksi global, menunjukkan bahwa
bahkan garis keturunan MDR dapat menjadi lebih resisten dan dapat menyebar dengan
cepat. Pengenalan K. pneumoniae penghasil ESBL ke Eropa, dan pada beberapa
kesempatan di Inggris, dianggap berasal dari pemindahan pasien dari negara di mana MDR
K. pneumoniae adalah endemik (38, 45). Hal ini terutama berkaitan dengan pengenalan
resistensi karbapenem dari luar Inggris, karena ini adalah salah satu dari sedikit kelas
antibiotik yang tersisa yang efektif melawan infeksi K. pneumoniae. Studi kami memberikan
bukti lebih lanjut dari munculnya independen dari garis keturunan resisten karena akuisisi
determinan resistensi terhadap antibiotik yang saat ini efektif (39). Resolusi tinggi
sekuensing genom utuh memungkinkan kami untuk menjelaskan struktur halus populasi
MDR K. pneumoniae Inggris dan Irlandia dalam penelitian ini. Menggunakan koleksi yang
lebih luas secara geografis dari klinis yang sensitif terhadap obat, serta resisten, K.
pneumoniae akan memungkinkan pemahaman tentang sejauh mana jaringan global
penularan antar rumah sakit dan juga mengidentifikasi sumber dan reservoir patogen ini
yang sebelumnya tidak dikenal. Ini akan menjadi penting untuk merancang cara yang efektif
untuk mengendalikan penyebaran infeksi ini.

BAHAN DAN METODE Mengisolasi dan menguji kerentanan antibiotik. Studi ini disetujui
oleh National Research Ethics Service (referensi no. 12 / EE / 0439) dari Inggris dan
Departemen Penelitian dan Pengembangan Rumah Sakit Universitas Cambridge. Dua ratus
lima puluh isolat K. pneumoniae dikumpulkan oleh British Society for Antimicrobial
Chemotherapy (BSAC). Koleksi tersebut terdiri dari isolat yang dikirim ke program surveilans
bakteremia sistematis antara 2001 dan 2011 oleh 28 rumah sakit di Inggris dan Irlandia.
Koleksi K. pneumoniae berasal dari kumpulan sistematis skala besar patogen MDR Gram-
negatif dari sejumlah rumah sakit di Inggris dan Irlandia yang dipilih untuk memaksimalkan
keragaman geografis. Untuk memaksimalkan keanekaragaman temporal, isolat diambil dari
masing-masing 10 tahun pengambilan sampel. Ini menghasilkan kumpulan isolat MDR yang
beragam secara temporer dan geografis. Kami kemudian menganalisis semua isolat K.
pneumoniae dalam koleksi ini, yang tersebar di sebagian besar rumah sakit selama 10
tahun. Daftar isolat dalam koleksi disajikan pada Tabel S1. Kami mendefinisikan resistensi
multidrug sebagai non-kerentanan terhadap tiga atau lebih kelas antimikroba, seperti
dijelaskan dalam referensi 46. Isolat dikumpulkan jika resisten terhadap setidaknya satu
antibiotik dalam tiga kelas berikut: penisilin, karbapenem, sefalosporin, tetrasiklin,
aminoglikosida, dan fluoroquinolones. Untuk mengontekstualisasikan isolat kami, kami
menggunakan data sekuens dari koleksi global yang dipublikasikan sebelumnya yang berisi
genom isolat dari hewan dan manusia dengan sumber infeksi lingkungan dan nosokomial,
terutama dari lima negara di seluruh dunia (4). Untuk memaksimalkan keragaman populasi
kontekstual, kami memasukkan sembilan koleksi klinis K. pneumoniae yang dipublikasi yang
ditemukan terutama dari Eropa tetapi juga dari Asia dan Amerika dalam analisis kami (15,
16, 18, 19, 31, 47-50). Pengumpulannya mencakup setiap kumpulan data yang diterbitkan
sebelumnya dengan lebih dari 10 kumpulan yang diserahkan ke NCBI dan dua kumpulan
data lebih lanjut dari Nepal. Aksesi dan nomor studi masing-masing, serta negara asal,
ditunjukkan pada Tabel 1. Metode pengenceran agar digunakan untuk mendapatkan MIC
dari setiap antibiotik untuk setiap isolat. Antibiotik termasuk penisilin (amoksisilin, asam
amoksisilin-klavulanat, dan piperasilin-tazobaktam), sefalosporin (sefuroksim, sefotaksim,
dan seftazidim), cephamycin (cefoxitin), suatu aminoglikosida (gentamisin), tetrasiklin), dan
glycylcycline (tigecycline) (46). Distribusi MIC untuk sampel kami dibandingkan dengan
distribusi

dari European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Titik putus

resistensi klinis diunduh dari situs web EUCAST (http://www.eucast.org) pada tanggal 15
Maret 2016. Urutan dan analisis pangenome. Ekstraksi DNA dilakukan dengan instrumen
QIAxtractor (Qiagen) sesuai dengan instruksi pabrik. Library sekuensing Illumina dengan
ukuran sisipan 450-bp disiapkan sesuai dengan protokol pabrikan dan diurutkan pada
Illumina HiSeq2000 dengan pembacaan berpasangan dengan panjang 100 bp. Sembilan
puluh enam sampel dimultipleks per jalur untuk memberikan kedalaman cakupan rata-rata ~
90 kali lipat. Kami mengumpulkan pembacaan urutan ujung berpasangan dengan
menggunakan pipa perakitan dan perbaikan (51) yang didasarkan pada Velvet (52) dan
kemudian memberi anotasi rakitan de novo dengan Prokka (53). Untuk melakukan analisis
pangenome, kami mengambil output dari Prokka dan menganalisisnya dengan Roary (54).
Analisis filogenetik dan penghitungan laju substitusi. Kami memetakan pembacaan singkat
terhadap genom referensi K. pneumoniae Ecl8 (aksesi GenBank no. HF536482 dan
CANH01000000) dengan SMALT v 0.7.4
(https://www.sanger.ac.uk/resources/software/smalt/). Kami menggunakan skor minimum
konservatif 30 untuk pemetaan dan kemudian SNP beranotasi dengan kombinasi SAMtools
mpileup (55) dan BCFtools. Kami menghapus SNP di situs dengan pemetaan heterogen di
mana SNP hadir kurang dari 75% dari pembacaan di situs itu, mirip dengan referensi 56.
Beberapa keselarasan digunakan untuk mendapatkan pohon global. Untuk memperkirakan
laju substitusi dalam setiap klade mayor, yaitu, ST15, ST101, ST147, ST16, dan ST874
(lihat Hasil untuk lebih jelasnya), pertama-tama kami memilih isolat dengan statistik contig
terbaik (yaitu, dengan nilai N50 terbesar dan terendah nomor contig) dari clade itu di koleksi
kami. Kami kemudian bergabung dengan contig dan menggunakan pseudogenom yang
dihasilkan sebagai genom referensi lokal dan memetakan bacaan dari setiap klade ke klade
ini. Kami memperoleh beberapa kesejajaran situs SNP untuk setiap klade dengan metode
yang dijelaskan di atas. Selanjutnya, kami menghilangkan daerah SNP dengan kepadatan
tinggi yang telah mengalami rekombinasi baru-baru ini dengan menggunakan Gubbins, yang
mendeteksi rekombinasi dengan menggunakan kepadatan SNP (57). Rekombinasi terjadi
terutama di hot spot yang mencakup gen fag dan transposon dan kadang-kadang gen yang
mengkode protein membran dan kapsuler, seperti gen wzi. Klade ST15, ST101, ST147,
ST16, dan ST874 masing-masing berisi 2, 3, 5, 2, dan 2 daerah fag. SNP yang terjadi di
wilayah ini tampaknya merupakan mayoritas (antara 90 dan 95%) dari SNP yang
terakumulasi dalam klade mayor. Klade ST15, ST101, ST147, ST16, dan ST874 masing-
masing memiliki 21.316, 9.436, 27.626, 4.480, dan 2.315 situs varian sebelum penghapusan
situs hipervariabel. Gubbins menguranginya masing-masing menjadi 2.302, 588, 1.150, 358,
dan 279 varian. Kami kemudian menggunakan beberapa alinyemen untuk mendapatkan
pohon filogenetik dan menggunakan pohon tersebut untuk memplot jarak akar-ke-ujung
versus waktu isolasi untuk setiap klon. To assess the significance of the temporal signal, ie,
the clock-like accumulation of mutations over time, we conducted 10,000 bootstraps with
randomized years to obtain a distribution for R-squared values. We then compared the real
R-squared values with the distribution. We found a strong temporal signal at 99% confidence
for the ST147 clade and 85% for the ST15 and ST874 clades. The temporal signals were
weaker ( 60%) for the ST16 and ST101 clades. To estimate the substitution rate, we used
BEAST v 1.7 (58). We examined various models, including a strict molecular clock and a
lognormal model with a constant population size. We used the results of the lognormal
model, as it was favored by the maximum-likelihood test (with 500 bootstraps) conducted
with the Tracer software of the BEAST package. We ran three independent chains of BEAST
for 50 million generations with sampling every 10 generations. Convergence was tested by
using effective sample sizes that had to be 200 for key parameters to confirm convergence.
Ten million states were excluded as the burn-in phase, and the output trees were then
merged to attain a dated tree with the TreeAnnotator software from the BEAST package. We
used in-house tools, FigTree (tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree), and iTOL (59) to visualize
the results of phylogenetic analysis. In silico MLST analysis and identification of antimicrobial
resistance determinants, virulence factors, and plasmids. We used the srst2 package (60),
with a 90% coverage cutoff, to map the short reads to antibiotic resistance genes, virulence
genes, and plasmid replicons. The resistance gene and plasmid replicon databases were
obtained from the srst2 package. For virulence genes, we used the database of the Pasteur
Institute (http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html). The results were visualized
on the phylogenetic tree with an in-house tool. The STs were determined with an in silico
MLST pipeline that takes assemblies and compares them against allele data derived from
the public MLST database at http://www.pubmlst.org/kpneumoniae. We identified ESBLs as
defined in the Lahey Hospital and Medical Centre database of beta-lactamases and ESBLs,
which is available at http://www.lahey.org/ Studies . Regression analysis and identification of
antibiotic resistance determinants. In addition to screening the database of known resistance
genes, we developed a genome-wide statistical approach to identify genes/SNPs that are
strongly associated with elevated MICs as quantitative values rather than categorical
resistant/susceptible values. In doing so, we utilized the higher variance in MICs than in
categorical resistance status to identify genetic determinants that underlie the increase in the
MICs of specific antibiotics. This approach is particularly useful for understanding
mechanisms of resistance to antibiotics like tetracycline, for which no clinical breakpoint is
available. To this end, we first developed a multiple regression model in the form of MIC ~
Gene(0/1) ST, where MIC is a continuous dependent variable that corresponds to the MIC of
each antibiotic and Gene(0/1) denotes the presence and absence of the individual accessory
genes (the output of Roary). (Note that, to preform the linear regression model, we made the
approximation assumption that MICs are continuous.) To account for the population
structure, we also included the ST information, given the high level of concordance between
ST clusters and major phylogenetic clades, as a categorical predictor variable. We then
identified the genes that generated a significantly positive slope coefficient (95%) confidence
interval) for the Gene(0/1) variable. Subsequently, we filtered the genes with P values of 104
(Student's t test) for the t statistic of association for the Gene(0/1) variable, which measures
the significance that the slope coefficient was greater than 0. In addition, we set a P 0.05
filter for the F test, which tests the overall significance of the whole regression test. Finally,
we ranked the hits on the basis of the P values and the R-adjusted value; for a list of hits
with their association values, see Table S2, and for the results, see Fig. S7A. These values
are depicted in Fig. S10 for the different antibiotics we studied here. In the second
regression model, we first identified annotated SNPs in the core genome after mapping the
reads to the reference genome of K. pneumoniae Ecl8 and removing SNP sites where 5% of
the reads had an N at that site. As above, we developed a regression model in the form of
MIC ~ SNP(0/1) ST, where the MIC and ST variables are defined as mentioned above. The
SNP(0/1) variable is the predictor variable and represented the presence or absence of
individual SNPs. Similar filter values were used to identify SNPs, the presence of which was
strongly associated with MICs, and the hit list and statistical parameters are detailed in Table
S3 and Fig. S7B. This model was particularly used to study ciprofloxacin resistance, which is
often conferred by chromosomal mutations.