INTRODUCCIÒN

Se debe tener en cuenta que en cada división celular hay una pequeña probabilidad de
que ocurra un cambio genético, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa
celular la población sea heterogénea. Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben
distinguir de las variaciones fenotípicas que dependen de las condiciones ambientales y
que tienen lugar en todas las células de la población que expresan la misma
modificación fisiológica, dentro de las variaciones permitidas por su genotipo. En las
mutaciones espontáneas el elemento responsable de la mutación no es conocido, pero
igual que las inducidas (el factor mutagénico se conoce) son estables y hereditarias y
tienen una frecuencia estadísticamente medible.

Por tanto las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin
intervención de procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones
bacterianas espontáneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias
dentro del rango de 10--5 a 10--10 por célula y división.

En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una

cepa sensible a un antibiótico se pone en contacto con ese antibiótico, al cabo del
tiempo se comprueba que todo el cultivo consta de bacterias resistentes. A través de
experimentos quedó demostrado que lo único que hace el antibiótico es seleccionar los
mutantes resistentes espontáneos que surgen en la población independientemente de
la presencia del agente selectivo.
Esta es precisamente la base genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas
resistentes a antibióticos: el fármaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles,
pero no afecta a los pocos individuos que por mutación espontánea hayan adquirido un
alelo resistente; estos individuos se multiplican, de modo que al final son los más
prevalentes.

En el siguiente informe se obtendrá mutantes espontáneas de Escherichia coli resistente

a Rifampicina (inhibidor de la ARN polimerasa), en un medio selectivo como lo es el
Caldo Luria evidenciando la aparición de colonias amarillas claras y luego determinará
la frecuencia de mutaciones espontáneas.
OBJETIVOS

 Aislamiento de mutantes espontáneas de E.coli que son resistentes a la

Rifampicina.
 Medir la frecuencia de mutaciones espontáneas.

MARCO TEÓRICO

Las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin intervención de
procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones bacterianas espontáneas
son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias dentro del rango de 10--5 a
10--10 por célula y división.

En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una

cepa sensible a un antibiótico se pone en contacto con ese antibiótico, al cabo del
tiempo se comprueba que todo el cultivo consta de bacterias resistentes, ante esto a
través de experimentos, quedó demostrado que lo único que hace el antibiótico es
seleccionar los mutantes resistentes espontáneos que surgen en la población
independientemente de la presencia del agente selectivo. Esta es precisamente la base
genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas resistentes a antibióticos: el fármaco
inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles, pero no afecta a los pocos individuos
que por mutación espontánea hayan adquirido un alelo resistente; estos individuos se
multiplican, de modo que al final son los más prevalentes.Una forma de seleccionar
mutantes resistentes a un antibiótico sin haber estado en contacto con él, es la
experiencia de las replicas de Lederberg, como se muestra en la siguiente figura:
 Figura 1.

El conocimiento de la frecuencia de aparición de mutación a resistencia a un

quimioterápico o antibiótico en una determinada especie bacteriana, así como el sitio de
acción de dicho fármaco, son factores importantes para una aproximación racional a la
quimioterapia.

Así por ejemplo, el bacilo tuberculoso produce frecuentemente lesiones en el pulmón,

donde se concentran enormes cantidades de la bacteria. Aquí, la quimioterapia con un
solo agente no da éxito, ya que aunque ese agente mate a casi todos los individuos de
esta especie bacteriana, no afectará a la pequeña subpoblación que posea el alelo
resistente; estos pocos individuos sobrevivirían a este tratamiento, y recolonizarían el
resto del pulmón, por lo que la infección persistiría. Así pues, en este tipo de casos hay
que tratar con varios quimioterápicos simultáneamente (la probabilidad de resistencias
múltiples basadas en mutaciones espontáneas equivale al producto de las probabilidades
individuales). En la tabla I se muestra el fenotipo que proporciona la resistencia a
diferentes antibióticos.
 Tabla I. Fenotipos resultado de mutaciones conducentes a resistencias a
antibióticos específicos

Antibiótico Fenotipo que proporciona la resistencia

Actinonina Pérdida de actividad enzimática
Ampicilina Respuesta SOS que detiene la división celular
Azitromicina Pérdida de una proteína reguladora
Cloranfenicol Reducción de la formación de una porina o de una proteína
reguladora
Ciprofloxacina Pérdida de una porina o pérdida de una proteína reguladora
Eritromicina Reducción de afinidad a ARNr 23S o pérdida de una proteína
reguladora
Fluoroquinolonas Pérdida de afinidad a la girasa
Imioenema Reducción de la formación de una porina
Kanamicina Reducción de la formación de una proteína de transporte
Ácido nalidíxico Pérdida o desactivación de una proteína reguladora
Rifampina Pérdida de afinidad a la ARN-polimerasa
Estreptomicina Afinidad reducida al ARNr 16S o reducción de la actividad de
transporte
Tetraciclina Formación reducida de una porina o de una proteína reguladora
Zwittermicina A Pérdida de fuerza motriz del protón

La resistencia bacteriana al antibiótico rifampicina puede resultar de una mutación

común. La rifampicina inhibe la transcripción bacteriana interfiriendo con la actividad
normal de la ARN-polimerasa (Gale et al., 1981; Levin y Hatfull, 1993). Las bacterias
pueden adquirir resistencia por una mutación puntual de la subunidad β de la ARN-
polimerasa, que está codificada por el gen rpoB (Enright et al., 1998; Taniguchi et al.,
1996; Wang et al., 2001; Williams et al., 1998). Esta mutación altera de forma
suficiente la estructura de la subunidad β de modo que pierde especificidad para la
molécula de la rifampicina. Como resultado, la ARN-polimerasa deja de tener afinidad
por la rifampicina, y ya no queda afectada por el efecto inhibidor del antibiótico.

La resistencia a rifampicina también ha sido atribuida a mutaciones puntuales,

inserciones y delecciones en una región limitada del gen; por lo menos el 95% de los
aislamientos para resistencia a rifampicina tienen mutaciones en este gen. Estas
mutaciones asociadas con resistencia fenotípica a rifampicina son generalmente
localizadas en una región de 81pb. Con mutaciones frecuentemente en los codones: Ser-
531, His-526 y Asp-516. Diferentes variaciones alélicas han sido detectadas en esta
región y genotipos específicos del gen rpoB son conocidos por estar asociados con altos
índices de resistencia a rifampicina en cepas de M. tuberculosis aisladas de diferentes
partes del mundo. (Agapito, 2003)

PROCEDIMIENTO
 AISLAMIENTO DE
MUTANTES
ESPONTÁNEAS

1-RECUENTO DE LA
POBLACIÓN TOTAL
Diluir el cultivo de E. coli DH5α, hasta
10-7 , 10-8 y 10-9 y sembrar 0.1ml de cada
dilución en Agar LB para el conteo de la
población total.
Incubar a 37ºC x 24h.

2-RECUENTO DE MUTANTES
ESPONTÁNEAS
Del cultivo de E. coli DH5α, sembrar
directamente 0.25 ml en 5 placas con
Agar LB + Rifampicina (60µg/ml).
Incubar a 37ºC x 24h.

3-Realizar el conteo de la población total

y de las mutantes espontáneas.
Hallar la frecuencia de aparición de
mutantes espontáneas con estos datos.

RESULTADOS
 1. Recuento de la población total.
2. Recuento de mutantes espontáneas.

n º m.e
f m .e = x100
n º col .totales

Para nuestra mesa (nº3):

Obtuvimos 5 colonias 5 1.25 ml

X 1 ml

X= 4 UFC / ml

4UFC / ml
f m .e = x100
1.2 x1010 UFC / ml

f m.e =3.3 x10 −8

TABLA DE RESULTADOS

Nº mutantes espontáneas (m.e) Frecuencia

(G2; 4-6 pm)

Mesa 1 1.2 x 1010 UFC/ml -

Mesa 2 4.8 UFC/ml 4 x 10-8

Mesa 3 4 UFC/ml 3.3 x 10-8

DISCUSION DE RESULTADOS

• Hay que tener en cuenta que los factores que influyen en la frecuencia de las
mutantes espontáneas dependen del gen de implicado, su conservación y del tipo
 de cepa a utilizar; en este caso la frecuencia de mutantes espontáneas empleando
E.coli DH5α fue de 3.3 x 10-8 (para nuestra mesa), el cual fue optimo, ya que
las mutaciones espontáneas afectan en un rango de 10--5 a 10--10 por célula y
división.
• El procedimiento desarrollado permitió obtener mutantes específicos para el gen
rif.

CONCLUSIONES

• La mutación espontanea, permite obtener variaciones a nivel de un gen

determinado, mientras que las mutaciones por agentes mutanógenos provocan
alteraciones en diversos genes.
• Las mutantes resistentes a Rifampicina, presenta como característica una
modificación a nivel de la subunidad β de la RNApolimerasa, lo que las hace
resistentes a este antibiótico.

Bibliografía

• Agapito, J. 2003. Caracterización de las Mutaciones en el Gen rpoB asociadas a

la Resistencia a Rifampicina y Tipificación Molecular Mediante Rflp (Is6110)
En Cepas de M. Tuberculosis de Pacientes con Tuberculosis Pulmonar.
Enfermedades del Tórax 2003; 46 (1): 9-24

• Anderson, L. La resistencia de las bacterias a los antibióticos.

• Pumarola, A. Microbiologia y Parasitologia Medica . 2da edicion